经修饰的ace2多肽的制作方法
【专利说明】经修饰的ACE2多肽 发明领域
[0001] 本发明涉及经修饰的血管紧张素转换酶2 (ACE2)变体及其药物和分析用途。特 别地，本发明涉及Zn2+耗尽、不含Zn2+、混合金属和金属离子取代的ACE2,以及用于制造这些 变体的方法及其用途，例如这些ACE2变体的治疗和分析用途。
[0002] 发明背景 ACE2 (血管紧张素转换酶2,也称为血管紧张素转换酶相关羧肽酶；酶学委员会编号： 3. 4. 17. 23)是肾素血管紧张素系统（RAS)的关键金属蛋白酶，参见Donoghue等人，Circ. Res. 87,2002:el-e9;Tipnis等人，J.Biol.Chem·，275(43)，2000,33238-43)。ACE2最 初鉴定为ACE类似物。Tipnis等人描述了来自CH0细胞的ACE2 (在所述情况下仍被称为 ACEH)分尚及其cDNA分尚。
[0003]ACE和ACE2两者均为在中心处具有催化锌原子的金属蛋白酶。ACE和ACE2随后 发现在活性以及机制方面是不同的。ACE增加血压，而ACE2降低血压。在机制上，ACE是肽 基二肽酶，而ACE2 是羧肽酶（Towler等人，J.BiolChem279,2004,17996-18007)。
[0004]ACE2主要作为膜锚定的锌金属蛋白酶存在，其在血液循环中起作用，并且诱导受 累器官中的局部效应，以及经由血液循环的全身效应。ACE2在脉管系统以及大多数器官 中表达，但占优势地在肾、肝、心脏、肺和睾丸中表达。它作为单肽酶切割，从而使多种底 物活化或失活，所述底物包括RAS的肽，例如血管紧张素II(AngII)，其被切割为血管紧 张素1-7 (Angl-7)，以及血管紧张素I(AngI)，其被切割为血管紧张素1-9 (Angl-9)， 以及Apelin、强啡肽原、去-Arg-缓激肽及其他（Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277， 2002,14838-14843)。ACE2作为针对ACE-AngII-AL受体轴的反调节剂在RAS内起关键 作用。ACE2通过从由血管紧张素II介导的促炎、高血压、增殖和血管收缩轴转变为反调 节轴而起作用，所述反调节轴通过经由ACE2切割AngII生成Ang1-7 (Danilczyk，U. & Penninger，Circ.Res·，98, 2006,463-471 ;Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277, 2002， 14838-14843)，以及更少程度地，通过ACE2切割AngI生成Ang1-9而触发。ACE2视为重要 的稳态调节物（Ferrario，C.M·，等人，J.Am.Soc.N印Ι?ΓοΙ.,ΙΙΘΘδ,ΠΙΘ-Ι?ΖΖΧΑΟΕ〗的 催化活性对于Angll比Angl高大约 400 倍（Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277,2002， 14838-14843)。可溶形式的ACE2也在循环中发现，其缺乏跨膜结构域。这种可溶形式比膜 结合形式更适合用作广泛多样的治疗方法中的活性化合物。
[0005] 可溶和重组形式的ACE2已得到开发，以治疗危害生命的疾病，例如急性肺和心脏 状况，以及纤维化和肿瘤学疾病。
[0006]ACE2作为ACE2反调节剂的功能首先在国际专利申请公开号W02004/000367中 报道。该申请公开了各种疾病的治疗处理，例如高血压、充血性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、 急性心脏衰竭、心肌梗塞、动脉硬化和肾功能衰竭、以及肺疾病包括成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)。
[0007] 国际专利申请公开号W02004/023270描述了ACE2的结晶化。
[0008] 国际专利申请公开号W02008/151347和美国专利申请公开号US2010/310546描述 了ACE2糖基化和ACE2二聚体。
[0009] 测定ACE2活性的方法例如在国际专利申请公开号W0 2008/046125A和美国专利 申请公开号US2010/0261214中描述。
[0010] 国际专利申请公开号W02009/086572描述了ACE2在治疗肝疾病特别是炎性肝疾 病和纤维化中的用途。
[0011] 国际专利申请公开号W02009/076694描述了使用ACE2的免疫疗法。
[0012] 国际专利申请公开号W02009/124330描述了使用ACE2治疗各种肿瘤。
[0013]ACE2描述为含锌金属蛋白酶，所谓的锌蛋白酶。用于临床使用的目前完全活性的 制剂含有等摩尔锌/蛋白质比。锌由此在酶的活性中心络合。药物产品制剂通常补充有 ZnCl2，以通过抑制酶结合的锌的丧失来稳定酶促活性。
[0014] 发明概述 根据第一个实施方案，提供了在活性位点具有耗尽水平的Zn2+的血管紧张素转换酶2 (ACE2)多肽群体。
[0015] 根据本发明的第一个方面，提供了ACE2多肽群体，其中活性位点基本上不含任何 金属离子。
[0016] 根据本发明的第二个方面，提供了ACE2多肽群体，其中活性位点由选自下述的过 渡金属离子或后过渡金属离子占据：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Pb2+Al、Ga、In、 Sn、Tl、Pb、Bi和Po,优选Co2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Al3+、Al2+和Sn2+，例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和 Al3+〇
[0017] 根据本发明的第三个方面，提供了ACE2多肽群体，其中未由锌占据的活性位点由 选自下述的一种或多种过渡金属离子或后过渡金属离子占据：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、 卩〇3+、卩62+、卩13 2+八1、63、111、511、1'1、？13、81和？〇，优选(：〇2+、2112+、附 2+、？132+、八13+、八12+和5112+， 例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和A1 3+。
[0018] 根据第二个实施方案，提供了ACE2多肽群体切割溶液中的ACE2底物的用途。
[0019] 根据第三个实施方案，提供了用于制备ACE2多肽群体的方法，其包括下述步骤： a. 在细胞系统中表达ACE2多肽； b. 分离所表达的多肽； c. 通过添加金属螯合剂去除在活性位点中结合的金属离子中的一些或全部。
[0020] 根据第四个实施方案，提供了包含ACE2多肽群体和药学可接受的载体或赋形剂 的药物组合物。
[0021] 根据第五个实施方案，提供了用于疗法中的ACE2多肽群体。
[0022] 根据第六个实施方案，提供了用于治疗或预防选自下述的疾病的ACE2多肽群体： 高血压(包括血压升高)、充血性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、急性心脏衰竭、收缩性心脏衰竭、 心肌梗塞、动脉硬化、肾衰竭、肾功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼吸窘迫综合征（ARDS)、急 性肺损伤（ALI)、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、肺动脉高血压、肾纤维化、慢性肾功能衰竭、急 性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、急性肾损伤和多器官功能障碍综合征。
[0023] 根据第六个实施方案，提供了ACE2多肽群体在制造用于治疗或预防选自下述的 疾病的药剂中的用途：高血压(包括血压升高)、充血性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、急性心脏 衰竭、收缩性心脏衰竭、心肌梗塞、动脉硬化、肾衰竭、肾功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼 吸窘迫综合征（ARDS)、急性肺损伤（ALI)、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、肺动脉高血压、肾纤 维化、慢性肾功能衰竭、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、急性肾损伤和多器官功能障碍 综合征。
[0024] 根据第七个实施方案，提供了治疗或预防选自下述的疾病的方法：高血压(包括 血压升高)、充血性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、急性心脏衰竭、收缩性心脏衰竭、心肌梗塞、 动脉硬化、肾衰竭、肾功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼吸窘迫综合征（ARDS)、急性肺损伤 (ALI)、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、肺动脉高血压、肾纤维化、慢性肾功能衰竭、急性肾功能 衰竭、慢性肾功能衰竭、急性肾损伤和多器官功能障碍综合征，其包括给有此需要的患者施 用有效量的ACE2多肽群体。
[0025] 附图简述 图1显示了不含锌的透析ACE2 (具有在8. 4分钟保留时间处的一个主峰的曲线)，与分 子量参考标准(具有多重峰的曲线）相比较的SEC-HPLC分析。
[0026] 图2显示了通过检测不同制剂中的荧光可切割产物测量的ACE2活性。
[0027] 图3显不了对于rACE2样品、1μΜ金属离子浓度和15分钟温育，每个循环（1分 钟）标绘的测量的相对荧光单位（RFU)。
[0028] 图4显不了对于rACE2样品、1μΜ金属离子浓度和80分钟温育，每个循环（1分 钟）标绘的测量的相对荧光单位（RFU)。
[0029] 图5显示了人ACE2(SEQIDNo:1)的全长氨基酸序列。氨基酸1-17是信号序 列，18-740来自细胞外结构域，741-761来自跨膜结构域，并且762-805来自细胞质结构域。
[0030] 发明详述 已发现锌不是ACE2结构和活性的绝对要求。另外，锌可以替换为其他金属离子，同时 保留酶促活性。因此，本发明提供了ACE2多肽的进一步变体，特别是在活性位点具有耗尽 水平的锌或其中活性位点基本上不含锌(或任何其他金属离子)的ACE2多肽，其中活性位点 由除锌外的另一种金属离子占据的ACE2多肽，以及在活性位点中具有锌和另一种金属离 子的混合物的ACE2多肽群体。
[0031] "Zn2+耗尽的ACE2 (多肽)"也称为"锌耗尽的ACE2 (多肽)"或"在活性位点具有耗 尽水平的Zn2+ (或锌)的ACE2 (多肽)"是全文可互换使用的术语。此类锌耗尽的ACE2的特 征在于在ACE2的锌结合位点中缺乏或降低水平的锌，尤其是Zn2+离子。锌结合位点可替代 地在本文中被称为"活性位点"。当ACE2多肽采取二聚体形式时，锌耗尽的二聚体的例子是 这样的，使得二聚体内的ACE2单体中的至少一个在单体的活性位点中（即在锌结合位点中） 缺乏锌原子。该术语还指ACE2多肽群体，其中锌：ACE2摩尔化学计量学小于1:1。技术人 员应当理解，何时本文陈述能够指以个别化形式的多肽，并且何时所述陈述一定指多肽群 体。
[0032] 在一个实施方案中，提供了锌耗尽的ACE2多肽，其为不含金属离子的ACE2多肽。 如本文使用的，"不含锌的ACE2 (多肽)"和"不含金属离子的ACE2 (多肽)"可互换使用。此 类不含金属离子的ACE2多肽基本上不含在活性位点中存在的锌或其他金属离子。在一个 实施方案中，不含金属离子的ACE2多肽不具有可检测水平的在活性位点中的锌或其他金 属呙子。
[0033] 在另一个实施方案中，提供了锌耗尽的ACE2多肽，其为金属取代的ACE2多肽。如 本文使用的，"金属取代的ACE2 (多肽)"指ACE2多肽或ACE2多肽群体，其中活性位点由除 天然Zn2+离子外的一种或多种过渡金属离子或后过渡金属离子占据。
[0034] 在另一个实施方案中，提供了锌耗尽的ACE2多肽，其为混合金属的ACE2多肽。如 本文使用的，"混合金属的ACE2 (多肽)"用于描述ACE2多肽群体，其中活性位点中一定比 例的天然结合锌的已去除，且替换为另一种过渡金属离子或后过渡金属离子。因此，在混合 金属的ACE2多肽群体中，对多肽亚等摩尔量的锌将存在于活性位点中，以及进一步比例的 过渡金属离子或后过渡金属离子存在于其他活性位点中。明确应当理解，超过一种个别的 金属离子在任何一个时间占据单个活性位点是不可能的，因此在混合金属的ACE2多肽中， 跨越群体评价活性位点的占据。
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