5] 如本文使用的，"群体"指超过一种多肽，其中该群体的特征作为平均值考虑。特别 地，它在本文中用于指与例如由过渡金属离子占据的活性位点相比较，例如具有空活性位 点的特定比的ACE2多肽群体。在群体内，个别ACE2多肽可以仅具有被占据或空的活性位 点，但在整个群体中，达到给定比。
[0036] "游离锌"或"游离金属离子"应理解为锌或另一种金属离子相应地是游离的，并且 因此可用于进入ACE2多肽的锌结合位点，例如在制剂或组合物中未被其他组分例如螯合 剂络合的金属离子或锌离子。
[0037] "贫金属(元素/离子)"和"后过渡金属(元素/离子)"在本申请中可互换使用。 应当理解该术语包括下述金属离子：错（A1)、镓（Ga)、铟（In)、锡（Sn)、铊（T1)、铅（Pb)、铋 (Bi)和钋（Po)。优选地，后过渡金属选自铝和锡，例如A12+、A13+和Sn2+。该术语预期涵盖 处于所有可能带正电的氧化状态的后过渡金属，优选处于2+或3+氧化状态，但更特别处于 2+氧化状态的离子。
[0038] "过渡金属(元素/离子)"指周期表的族3至12,以及周期4、5、6和7中的那些 元素，包括但不限于铬（Cr)、钴（Co)、镍（Ni)、锰（Mn)、铜（Cu)、铁（Fe)、锌（Zn)、钼（Mo)、钌 (Ru)、铑（Rh)、钯（Pd)、银（Ag)和镉（Cd)。该术语预期涵盖处于所有可能带正电的氧化状 态的过渡金属，优选处于2+或3+氧化状态的离子。在一个实施方案中，过渡金属元素是周 期表的族3至12的周期4或5元素。在另一个实施方案中，过渡金属选自Co2+、Ni2+、Mn2+、 Cu2+、Fe3+、Fe2+和Pb2+。在进一步的实施方案中，过渡金属选自Co2+、Ni2+和Pb2+。在进一步 的实施方案中，过渡金属选自Fe3+、Cu2+和Mn2+。在进一步的实施方案中，过渡金属选自Co2+ 和Ni2+。在另一个实施方案中，过渡金属选自Fe3+和Mn2+。
[0039] 人ACE2多肽（UniProt序列数据库条目：Q9BYF1)包含信号肽(氨基酸1至17)、细 胞外结构域(氨基酸18至740)、螺旋跨膜结构域(氨基酸741至761)和细胞质结构域(氨基 酸 762 至 805)。
[0040]ACE2的锌结合区含有锌结合基序：HEXXH，其对应于根据SEQIDNo. 1的全长805 个氨基酸的ACE2序列的氨基酸374至378 (以粗体表示)。ACE2的晶体结构对于天然酶 (PDB数据库条目：1R42)和作为抑制剂结合的酶（PDB数据库条目：1R4L)公开，举例说明了 在Zn2+结合位点中的锌离子。
[0041] 根据本发明，ACE2多肽可以是全长ACE2多肽或其片段。在一个实施方案中，该片 段包含SEQIDNo: 1的氨基酸374至378。在一个实施方案中，ACE2多肽包含SEQIDN0:1 的氨基酸1至740。在另一个实施方案中，ACE2多肽是缺乏跨膜结构域和/或缺乏崩ξ端信 号肽的可溶性ACE2。在本发明的另一个实施方案中，ACE2多肽包含ACE2的细胞外结构域 的氨基酸序列，或由ACE2的细胞外结构域的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，ACE2 多肽包含SEQIDNO: 1的氨基酸18至740或氨基酸18至615,或者由SEQIDNO: 1的氨基 酸18至740或氨基酸18至615组成。
[0042]ACE2多肽或ACE2多肽片段包括人ACE2或其片段或其任何同源直向同系物，具有 相同或相似的天然性质活性。因此，源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪、灵长类动物或牛的ACE2也由 本发明包括。在一个实施方案中，ACE2多肽具有人起源。ACE2是具有相同AngII底物的 所有哺乳动物中的通用酶。对于治疗用途，ACE2多肽因此也可以用于外源生物中。因此，例 如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、灵长类动物或牛可以用根据本发明的ACE2进行处理，与ACE2 源无关。优选地，治疗性ACE2多肽源于待处理的相同生物，以便使免疫应答的危险降到最 低，例如人起源的ACE2多肽用于治疗人患者。
[0043] 本发明的ACE2多肽可以任选是糖基化的。天然人ACE2的可溶结构域具有七个 N-糖基化位点。在一个实施方案中，对应于SEQIDNO: 1的Asn53、Asn90、Asnl03、Asn322、 Asn432、Asn546、Asn690,根据本发明的ACE2多肽的可能N-糖基化位置中的3、4、5、6或7 个是糖基化的，和/或ACE2多肽具有大于10% (按总ACE2多肽的重量计的百分比)或11%、 12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%，特别是按重量计大于 20%、21%、22%、23%、24% 或 25% 的 糖含量。
[0044]ACE2多肽可以采取单体或二聚体形式。当作为二聚体存在时，一个或两个锌离子 可以被耗尽、不存在和/或由另一种金属离子取代。
[0045] 用于产生ACE2多肽的方法在引入本文作为参考的国际专利申请公开号 W02008/151347中描述，参见实施例1和第12页第二个完全段落到第13页，第二个完全段 落结束。
[0046] 应当理解，根据本发明，锌耗尽的ACE2多肽、不含金属离子的ACE2多肽、金属取代 的ACE2多肽和混合金属的ACE2多肽可以包含上文描述的ACE2多肽或片段中的任一种，特 别是在氨基酸序列、糖基化模式、起源和二聚体/单体形式方面。
[0047] 在一个实施方案中，ACE2多肽是包含SEQIDNo: 1的氨基酸18至740的二聚人 ACE2多肽，在独立地选自下述的一个或多个位置处是糖基化的：SEQIDNO: 1的Asn53、 Asn90、Asnl03、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690,并且具有按重量计大于 20% 的糖含量。
[0048] 根据本发明的第一个方面，提供了在活性位点中具有耗尽水平的Zn2+的ACE2多 肽。在一个实施方案中，Zn2+:ACE2的摩尔比为彡1:1，例如彡0. 99:1、彡0. 98:1、彡0. 95:1、 彡 0· 92:1 或彡 0· 90:1。
[0049] 根据本发明的第二个方面，锌耗尽的ACE2分子基本上不含锌（Zn2+)。然而，可能存 在少量杂质，并且由本发明包含。在另一个实施方案中，Zn2+:ACE2的摩尔比为< 0.50:1、 < 0· 45:1、< 0· 40:1、< 0· 35:1、< 0· 30:1、< 0· 25:1、< 0· 20:1、< 0· 15:1、< 0· 10:1、 彡0. 05:1、彡0. 02:1或彡0. 01:1。Zn2+:ACE2比指在ACE2的锌结合位点中发现的锌。这 可以例如通过多肽的天然纯化或通过透析，随后对所得到的固体材料实施ICP-MS分析进 行测量。在一种方法中，锌耗尽的ACE2可以通过与抗ACE2抗体包被的珠结合进行捕获，用 不含锌的洗脱剂洗脱，并且随后实施ICP-MS分析。使用这些方法，可以测定所得到的锌与 ACE2多肽比是由于在活性位点中锌与多肽的络合。
[0050] 为了阻止Zn2+迀移至结合位点，包含本发明的锌耗尽的ACE2多肽群体的制剂或组 合物还包含很少的锌(根据上述比）或不含锌。通过添加螯合剂例如H)TA、EGTA、8-羟基喹 啉、菲咯啉和/或二巯基丙醇(也称为英国抗路易斯剂或BAL)，可以降低特定制剂或组合物 中的游离锌水平（以及与ACE2的活性位点结合的锌)。所需螯合剂的特定过量通过本领域 技术人员容易地测定，并且尤其取决于采用的螯合剂的性质、pH值和待去除的金属离子类 型。对于从活性位点中去除天然锌，在区域中1000倍Η)ΤΑ的过量是适当的(参见下文实施 例2)。
[0051] 因此，在包含锌耗尽的ACE2多肽群体的制剂或组合物中，上述Zn2+:ACE2比指ACE2 结合位点中的锌量。在进一步的实施方案中，制剂中的锌离子量通过添加金属螯合剂得到 降低。此类螯合剂的量可以如下所述。
[0052] 本发明还提供了产生Zn2+耗尽的ACE2多肽的方法，其包括下述步骤：在细胞中表 达ACE2多肽，分离ACE2多肽，优选用金属螯合剂从所述ACE2多肽中去除Zn2+。ACE2多肽 可以在锌的存在或不存在下进行表达。然而，在大多数细胞系统中，可以存在锌离子，并且 因此所表达的ACE2多肽通常含有在活性位点中的锌。这种结合的锌随后可以例如通过使 用金属螯合剂或通过使用离子交换层析进行去除，所述金属螯合剂例如H)TA、EGTA、8-羟 基喹啉、菲咯啉和/或二巯基丙醇。在另一个实施方案中，金属螯合剂以过量使用，例如其 浓度为制剂或组合物中的锌总浓度（即溶液和活性位点中的锌浓度）的至少2倍、5倍、10 倍、25 倍、50 倍、75 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900 倍、 1000 倍。
[0053] 根据本发明的第三个方面，ACE2多肽的活性位点基本上不含任何金属离子包括 锌。然而，可能存在少量杂质，并且由本发明包含。在另一个实施方案中，金属离子：ACE2 的摩尔比为彡 〇· 50:1、彡 0· 45:1、彡 0· 40:1、彡 0· 35:1、彡 0· 30:1、彡 0· 25:1、彡 0· 20:1、 彡 0· 15:1、彡 0· 10:1、彡 0· 05:1、彡 0· 02:1 或彡 0· 01:1。金属离子：ACE2 比指在ACE2 的 活性位点中发现的金属离子。这可以例如通过多肽的天然纯化或通过透析，随后对所得到 的固体材料实施ICP-MS分析进行测量。在一种方法中，不含金属离子的ACE2可以通过与 抗ACE2抗体包被的珠结合进行捕获，随后用不含金属离子的洗脱剂洗脱，并且随后实施 ICP-MS分析。使用这些方法，可以测定所得到的金属离子与ACE2多肽比是由于在活性位点 中金属离子与多肽的络合。
[0054] 不含金属离子的ACE2多肽是酶促失活但结构稳定的。它们不聚集或崩解，并且可 以通过提供合适的金属离子重构成活性ACE2。多肽的高稳定性可以具有在贮存期间的利 益，甚至在差的贮存条件期间，例如通过中断的冷却期(例如在运输期间)，也具有长贮存期 限。不受理论束缚，长期稳定性可能是由于缺乏活性而得到改善，其可以阻止自体溶解和/ 或可以通过充当路易斯酸，降低锌介导的活性位点氧化。此外，对于根据本发明的ACE2多 肽，能够通过金属耗尽或取代来调节或细调ACE2活性或生物利用度。
[0055] 本发明的锌耗尽、不含锌和不含金属离子的ACE2多肽可以用作肽酶，以切割包含 金属离子的溶液中的ACE2底物。可替代地，提供了切割ACE2底物的方法，其包括使所述 ACE2底物与锌耗尽、不含锌和/或不含金属离子的ACE2多肽在包含金属离子的溶液中接 触。在包含金属离子的溶液中，锌耗尽、不含锌和/或不含金属离子的ACE2多肽将吸收游离 金属离子，在活性位点螯合其，并且从而重构为金属取代的ACE2多肽，例如锌重构的ACE2， 并且重新获得其催化活性。
[0056] 在此类包含金属的溶液中，金属离子选自元素周期表的过渡金属元素或后过渡金 属元素。在一个实施方案中，金属离子是带正电的，特别是2+或3+。任何此类金属可以占 据ACE2的锌结合位点，以保留ACE2的活性。锌还可以替换为其他金属离子，以便恢复ACE2 的活性。元素周期表的过渡元素是周期4、5、6和7中的族3至12,包括Cr、Co、Ni、Mn、Cu、 Fe、Zn、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag和Cd，例如Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+和Pb2+。在其他实施方 案中，过渡元素是周期4或5元素。在进一步的实施方案中，过渡金属选自Co2+、Ni2+和Pb2+。 在进一步的实施方案中，过渡金属选自Fe