一种超顺磁性氧化铁纳米mri探针和制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种超顺磁性氧化铁纳米MRI探针和制备方法及其应用，属于医药技 术领域。
【背景技术】
[0002] 核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI)能够准确的对肝癌进行显示， 能够发现一些其他检查手段例如CT不能发现的病变，但是对于发现比较小的病灶，特别是 小于Icm的肝癌和同时伴有肝硬化病人的肝癌尚有一定的困难。近些年来，对分子影像学 (Molecular Imaging)研究的不断深入，为肝细胞癌的早期检测和早期诊断提供了一种全 新的思维方法。分子影像学是一门新兴的边缘科学，与传统影像学的不同点在于其能够将 分子水平的改变在活体状态下显示出来，从而定性及定量的对分子改变所导致的生物学行 为通过影像的方法进行分析，在组织、细胞及亚细胞等不同层面对疾病进行早期判断。
[0003] 临床上常用的磁共振对比剂是含IL磁共振对比剂（简称IL剂，Gadolinium based contrast agent，GBCA)，在磁共振影像诊断方面有一定的价值，能够提高诊断的准确率，但 其在体内组织中呈非特异性分布，对早期肿瘤和较小的转移瘤诊断的敏感性不高，对肿瘤 组织和正常组织的分界往往不能准确地区分，并且有一定程度的肾毒性。为了更加清晰的 显示微小病灶，需要研制出能够增强图像对比度的对比剂，提高磁共振对软组织的分辨率。 钆剂在脑组织、肾脏及血液系统的成像方面作用比较明显，但是在肝胆系统的成像效果欠 佳，这种情况下，对肝脏特异性磁共振对比剂的研究是极其有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的技术问题是，提供一种新的MRI探针，可以用于癌细胞的早期检测， 特别适合肝细胞癌的早期检测。
[0005] 本发明的技术方案是，提供一种超顺磁性氧化铁纳米MRI探针，其化学结构式如 下：
[0007] 所述SPIO为超顺磁性氧化铁；所述CTX为氯离子通道蝎毒素；所述η为聚合度，为 4-200的任意整数。
[0008] 进一步地，超顺磁纳米MRI探针的制备方法为：向
中加入盐酸羟胺和乙 二胺四乙酸，室温下反应脱去
中的乙酰基，经截留分子量为3500的半透膜纯化 后与端碘乙酸酯化的超顺磁性氧化铁纳米粒子混合反应，冰浴条件下反应，搅拌过夜，反应 完成后离心即得所述MRI探针；所述端碘乙酸酯化的SPIO的化学结构式为：
[0010] 进一步地，所述
的制备方法为：在无水条件下将巯基乙酸和乙酰氯反应 得到乙酰化巯基乙酸，再与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到羧基活化的乙酰化巯基乙酸，再与 氯离子通道蝎毒素反应得到
[0011] 进一步地，所述端碘乙酸酯化的SPIO的制备方法为：将SPIO纳米粒子分散到环 己烷中，加入PEG-硅烷，40-55°C下超声，待环己烷挥发完全得到PEG-硅烷修饰的SPIO ;再 在PEG-硅烷修饰的SPIO中加入过量乙二胺，反应得到表面氨基化的SPIO ;表面氨基化的 SPI0再与碘乙酸反应得到所述端碘乙酸酯化的SPI0 ;其合成路线为：
[0013] 本发明进一步地提供所述MRI探针作为磁共振成像的造影剂的应用。
[0014] 超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPI0)具有很多优点，例如生 物相容性较好，毒性较低，磁场敏感性较强，可以使质子弛豫率增强，使横向弛豫（T2)时间 缩短，从而使病变与周围组织的对比度增大，使图像的分辨率提高。肝脏网状内皮系统中 含有Kupffer细胞，Kupffer细胞可以摄取超顺磁氧化铁，从而降低正常肝组织的磁共振信 号，由于Kupffer细胞在肝脏大部分恶性肿瘤中非常少或者缺乏，所以肝脏恶性肿瘤的磁 共振信号无明显变化，这种情况下病变与正常肝组织的T2序列磁共振信号差别加大，产生 磁共振负性强化。
[0015] 基质金属蛋白酶-2 (Matrixmetalloproteinases-2，ΜΜΡ-2)的在肝硬变和慢性 肝炎的肝组织内表达较弱，在肝细胞癌中基质金属蛋白酶-2能够较高的表达，并且这种表 达与肿瘤的侵袭、分化程度、转移和复发趋势有一定的相关性。因此，基质金属蛋白酶-2 有希望成为超顺磁性氧化铁新型肝癌分子探针的特异结合靶点之一。氯离子通道蝎毒素 (Chlorotoxin，CTX)是一种从以色列金蝎的毒液中提取的、包含有36个氨基酸（其中包 含1个酪氨酸残基、8个半胱氨酸残基）和4个双硫键的多肽，分子重量为3950Da，其中酪 氨酸残基可以进行放射性碘标记，其结构可参见文献{Mamelak AN, Jacoby DB. Targeted delivery of antitumoral therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin(TM-601)[J]. Expert Opin Drug Deliv 2007,4(2):175-186}〇 CTX可选择性地和特异性地与MMP-2结合，从而间接与肝癌建立靶向联系。聚乙烯乙二醇 (poly-ethylene glycol，PEG)是一种常用的表面修饰材料，具有很好的亲水性，同时没有 免疫原性，PEG便宜易得，中性无毒，有良好的生物相容性，溶于水和多种有机溶剂，能够通 过端基反应性以嵌段或接枝的方法连接到纳米颗粒上，使其具有亲水性，增强其稳定性，延 长在血液内的循环时间，减少纳米颗粒被巨噬细胞的吞噬。因此可以选择PEG作为连接CTX 与SPIO的桥梁，将CTX与SPIO通过某种物质连接起来，则可以使SPIO作为磁共振对比剂 与肝癌靶向结合，达到SPIO与肝癌的靶向联系的目的。
[0016] 本发明的有益效果是，成功地制备出了一种新型的超顺磁纳米MRI探针，该MRI探 针纳米颗粒溶液的磁共振成像规律与SPIO溶液相同，均为随着溶液中铁浓度增高，TlWI序 列的信号强度增高，T2WI序列的信号强度降低，对人肝细胞癌细胞株H印G2无明显的细胞 毒性，可以用于肝细胞癌的早期检测。
【附图说明】
[0017] 图1表示超顺磁性氧化铁纳米MRI探针的化学结构。
[0018] 图2表示端羧基聚乙二醇的红外图谱。
[0019] 图3表示PEG-硅烷的核磁共振-氢谱。
[0020] 图4表示终产物SPI0-PEG-CTX的红外光谱表征及其对照图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例提供一种超顺磁性氧化铁纳米MRI探针的合成步骤和表征，该MRI探针 的结构为：
α
[0024] 上述MRI探针的结构中主要包含SPIO (超顺磁性氧化铁）、PEG (聚乙二醇）和 CTX (氯离子通道蝎毒素）三部分，因此该MRI探针可以简写为SPIO-PEG-CTX，其合成步骤 具体为：
[0025] I. 1疏水性SPIO纳米颗粒制备
[0026] 超顺磁氧化铁纳米粒子制备的基本方法是，将摩尔比为2:1的三价铁（Fe3+) 和二价铁（Fe 2+)混合溶液滴加到碱性溶液（0H )中，通过化学共沉淀法（Chemical coprecipitation)合成。共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒的化学反应式如下：
[0027] Fe2++Fe3++80H - Fe (OH) 2/Fe (OH) 3
[0028] Fe (OH) 2/Fe (OH) 3+2Fe (OH) 3一 Fe 304+Fe00H+5H20
[0029] 2Fe00H+Fe (OH) 2- Fe 304+H20。
[0030] 称取三氯化铁六水合物（Iron trichloride hexahydrate，分子式为 FeCl3 ·6Η20， I. 081g，4mmol)和二氯化亚铁（ferrous chloride tetrahydrate，分子式为 FeCl2,0. 397g， 2mm〇l)置于一 250毫升的三颈瓶中，加入120毫升去离子水溶解，然后将三颈瓶密封，并抽 去其中的氧气，然后再充入氮气，此抽氧气及充氮气的过程重复三次即三充三放，保持三颈 瓶内的无氧环境。随后在对整个混合铁溶液体系进行剧烈搅拌过程中（机械搅拌，转速大 于1500rpm)，并逐滴加入0. 2mL的油酸（Oleic acid)。之后吸取15mL质量分数为28%的 氨水（Ammonium hydroxide) 15mL缓慢地加入到三颈瓶中，体系中保持80摄氏度的恒定温 度，并且始终处于超声环境。随着氨水的加入，整个体系逐渐变成棕黑色。反应半小时之后， 得到一定粒径范围的超顺磁氧化铁纳米粒子沉淀。该沉淀通过离心分离，无水乙醇（ethyl alcohol absolute)清洗，室温条件下真空干燥，得到干燥的超顺磁性氧化铁纳米粒子。
[0031] L 2亲水性纳米颗粒SPI0-PEG-CTX制备
[0032] 疏水性纳米颗粒SPIO亲水性表面修饰的基本原理：使用配体交换方法对上步 制备的疏水性超顺磁性氧化铁纳米粒子进行亲水性修饰，使其与PEG及CTX结合，得到 SPI0-PEG-CTX纳米颗粒，具备一定的亲水性能。配体交换是指配位化合物中的配体被其他 配体所取代。
[0033] I. 2. 1 称取一定量的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG6000)置于两口 烧瓶内，一 口接分水器，分水器上接冷凝管，另一口接温度计。然后向烧瓶中加入甲苯 (Methylbenzene)溶解聚乙二醇PEG6000,110至130摄氏度条件下共沸（Azeotrope)除去 其中的甲苯/水混合物，之后冷却至室温待用。
[0034] L 2. 2称取一定量的丁二酸酐（Succinic anhydride)，干燥处理聚乙二醇 PEG6000,用做催化剂的二甲氨基吡啶（Dimethylaminopyridine，DMAP)，用做溶剂的二氯甲 烧（dichloromethane)，室温下搅拌24小时。用乙醚（Ether)做后处理，沉淀出白色固体， 之后用异丙醇（Isopropanol)对此白色固体进行溶解，会产生少许不溶物，弃去不溶物，仅 收取溶剂部分，经浓缩过柱得端羧基化的聚乙二醇（carboxyl terminated PEG)。该实验步 骤的化学反应式如下。
[0036] 1. 2. 3称取步骤1. 2. 2制备的端羧基化的PEG，加入一定量氯化亚砜（sulfoxide chloride，SOCl2)，氮气条件下回流I. 5小时，经后处理得酰氯化的PEG(acidchloride PEG)。该实验步骤的化学反应式如下。
[0038] 1. 2. 4向上步所得的酰氯化PEG中加入一定量的三氟乙醇（trifIuoroethanol)， 氮气条件下搅拌2小时，后经加热回流反应3小时，过柱纯化得到功能化修饰的 PEG(functionalizational PEG)。该实验步骤的化学反应式如下：
[0040] 1. 2. 5称取3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS)和功能化修饰的PEG，APS与PEG的 比例为1:2,将二者加入到用少量二氯甲烧（dichloromethane)溶解的聚乙二醇体系中，该 体系用氮气保护，避光条件下搅拌过夜。之后经过真空干燥得到PEG修饰的硅烷（