silane modified by PEG)，简称PEG-硅烷。该实验步骤的化学反应式如下。
[0042] 1. 2. 6称取干燥的超顺磁性氧化铁纳米粒子分散到环己烷（cyclohexane)中，加 入PEG修饰的硅烷，50摄氏度条件下用超声处理，待环己烷挥发完全即得PEG-硅烷修饰的 具备一定亲水性能超顺磁性氧化铁纳米粒子，即PEG-硅烷修饰的SPIO纳米粒子。该实验 步骤的化学反应式如下。
[0043]
[0044] I. 2. 7称取少量PEG-硅烷修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子，加入过量乙二胺 (ethanediamine)反应2小时，去离子水清洗后通过离心得到表面氨基化的超顺磁性氧化 铁纳米粒子（SPI0 of surface amination)。该实验步骤的化学反应式如下。
[0046] 1. 2. 8称取鹏乙酸（iodoacetic acid)，二环己基碳二亚胺 (dicyclohexylcarbodiimide，DCC)，N-羟基琥泊酿亚胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS)，使 用乙酸乙酯（ethly acetate)溶解，在0摄氏度的条件搅拌反应3小时，得到羧基活化的碘 乙酸（carboxyl activated iodoacetic acid)。称取2~5倍量駿基活化的鹏乙酸溶解于 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMS0)中滴入到含有超顺磁氧化铁纳米粒子的水分散体 系中，室温反应过夜，后通过截流分子量为3500的半透膜除去多余的碘乙酸，即得端碘乙 酸酯化的超顺磁性氧化铁纳米粒子（ethly iodoacetate terminated SPI0)。该实验步骤 的化学反应式如下。
[0048] 1. 2. 9称取一定量疏基乙酸（thioglycolic acid)，在无水条件下利用乙酰氯 (acetyl chloride)得到乙酰化巯基保护的巯基乙酸。之后依次称取乙酰化巯基乙酸， DCC, NHS在0度条件下反应得到羧基活化的乙酰化疏基乙酸（N-succinimidyl-S-acetylth ioacetate，SATA)，过柱纯化后立即与氯离子通道蝎毒素（Chlorotoxin, CTX，Ph = 8. 5碳酸 氢盐缓冲溶液，浓度为1 μ g/ μ 1)在〇度条件下反应4小时，得到SATA-CTX，通过截留分子 量8000-12000的半透膜提纯浓缩。该实验步骤的化学反应式如下，式中，Chlorotoxin即 CTX，Ac即乙酰基。
[0050] I. 2. 10 向 SATA-CTX 体系加入盐酸轻胺（hydroxylamine hydrochloride)和乙 二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，室温条件下孵育1小时，使得 SATA-CTX的乙酰基脱去，裸露出活性巯基，得到端巯基修饰的CTX，截留分子量为3500的半 透膜纯化后立即与前步所得端碘乙酸酯化的超顺磁性氧化铁纳米粒子混合反应，冰浴条件 下反应搅拌过夜，离心即得终产物SPI0-PEG-CTX。
[0052] I. 2. 11材料测试和表征
[0053] (1)通过前述的实验方法，成功合成了 SPIO以及PEG-硅烷修饰的SPI0,经检测， 粒径分布均约在20~35nm之间，较均一。
[0054] (2)端羧基聚乙二醇的红外图谱如图1所示，红外光谱显示PEG的羧基改性成功， 3000cm 1的宽峰，以及1700cm 1的双峰表示羧基修饰成功。
[0055] (3)通过核磁共振仪检测了化学合成过程中的关键化合物结构。PEG-硅烷的核磁 图谱如图3所示。
[0056] (4)终产物SPI0-PEG-CTX的红外光谱表征及其与SPIO和表面氨基化的SPIO对照 图，如图4所示，a表示SPIO, b表示表面氨基化的SPIO, c表示终产物SPI0-PEG-CTX。
[0057] 实施例2
[0058] 本实施例提供SPI0-PEG-CTX纳米颗粒的细胞毒性检测。
[0059] 分别将CTX、SPIO及SPI0-PEG-CTX溶液加入到人肝细胞癌细胞株H印G2,于第1 天、第2天及第3天行MTT检测。分析其结果可知：从第1天到第3天，加入三种溶液之后 的人肝细胞癌细胞株ifepG2的光吸收值是逐渐增大的，间接反映出存活的细胞数量是逐渐 增多的，因此可以说明人肝细胞癌细胞株ifepG2的生长不受CTX、SPIO及SPIO-PEG-CTX的 影响，CTX及SPIO对人肝细胞癌细胞株H印G2无明显的细胞毒性。
[0060] 实施例3
[0061] 本实施例提供SPI0-PEG-CTX纳米颗粒体内磁共振成像的应用。
[0062] 实验方法：
[0063] 选取12只合适的VX2兔肝癌模型，要求肿瘤生长局限，无明显周围侵犯，腹腔无种 植等，将12只VX2瘤兔随机分成两组：CTX组和SPIO组，CTX组8只，SPIO组4只，以水合 氯醛经耳缘静脉麻醉后行磁共振扫描，两组分别以SPI0-PEG-CTX和SPIO做磁共振对比剂， 浓度为25 μ g/ml，剂量约5ml。
[0064] 使用荷兰Philips Achieva 3. OT X series超导磁共振成像系统，16通道SENSE XL Torso线圈，扫描序列如下：
[0065] (1)冠状位快速自旋回波T2加权脂肪抑制序列，TE 70ms，TR 1852ms，NSA = 3,翻 转角：90度，矩阵：252 X 193,层厚3mm，间距0· 3mm，视野：24X 24cm，常规加脂肪抑制。
[0066] (2)横断位快速自旋回波T2加权脂肪抑制序列，TE 70ms，TR 1565ms，NSA = 3,翻 转角：90度，矩阵：252 X 193,层厚4mm，间距0.4mm，视野：24X 24cm，常规加脂肪抑制。
[0067] (3)横断位快速自旋回波Tl加权序列，TE 2. 3ms，TR 10ms，NSA = 3,翻转角：15 度，矩阵：252X 193,层厚 3mm,间距 0· 3mm，视野：24X 24cm。
[0068] (4)横断位快速自旋回波T2加权脂肪抑制序列，TE 70ms，TR 1565ms，NSA = 3,翻 转角：90度，矩阵：252 X 193,层厚4mm，间距0. 4mm，视野：24X 24cm，常规加脂肪抑制，注射 对比剂后30分钟扫描。
[0069] 将两组VX2瘤兔增强前后的肝癌和正常肝脏的T2值作为测量对象，增强前后选择 同样的位置作为感兴趣区，ROI为4x4mm 2,避开胆管、血管及坏死区域，所有磁共振图像均由 三位影像诊断医师独立阅片，同一个病变或正常肝脏的T2信号强度值取三位医师所测T2 信号强度值的平均值。分别将以SPI0-PEG-CTX作为对比剂和以SPIO作为对比剂增强前后 的肝癌和正常肝脏的磁共振T2信号强度值进行数据分析，比较增强前后病灶及正常肝脏 的T2信号强度值有无变化。
[0070] 实验结果
[0071] CTX组实验数据及磁共振图像
[0072] CTX组的8只VX2瘤兔共发现13个肝癌病灶，肝癌病灶及正常肝组织增强前后磁 共振值T2信号强度值测量结果统计见表1。
[0073] 表1 CTX组肝癌及正常肝组织增强前后T2信号强度值
[0075] 注：S"CT#肝癌平扫时的T2信号强度值，S _CTX指肝癌以SPI0-PEG-CTX为对比 剂增强扫描后的T2信号强度值，SffTCTX指正常肝组织平扫时的T2信号强度值，S ffigm指 正常肝组织以SPI0-PEG-CTX为对比剂增强扫描后的T2信号强度值。
[0076] CTX组数据统计结果
[0077] 对CTX组的数据进行配对样本T检验，S癌平CTX与S癌增CTX两组数据进行配 对，S肝平CTX与S肝增CTX两组数据进行配对，使用SPSS17. 0作为统计软件，统计结果见 下表（表2,表3)。
[0078] 表2 CTX组T2信号强度值配对T检验的成对样本统计量
[0080] 表3 CTX组T2信号强度值配对T检验的成对样本检验结果
[0081]
[0082] 从以上统计结果可以看出，以SPI0-PEG-CTX为对比剂，肝癌增强后T2信号值的均 值小于平扫Τ2信号值的均值，P值为0. 004,小于0. 05,二者的差别有统计学意义，正常肝 组织增强Τ2信号值的均值小于平扫Τ2信号值的均值，P值为0. 202,大于0. 05,二者的差 别无统计学意义。
[0083] 本发明成功建造了 VX2兔肝癌模型，在此实验过程当中，通过对比研究，寻求到了 一种更加有利于进一步研究的建模方法，此方法成瘤率高，损伤小，腹腔种植及腹壁侵犯 少，是一种值得推荐的建模方法。经过PEG及CTX修饰的超顺磁纳米颗粒SPI0-PEG-CTX是 T2造影剂，在VX2兔肝癌模型上对肝癌呈负性强化，能够为肝癌早期诊断的进一步研究提 供基础。
【主权项】
1. 一种超顺磁性氧化铁纳米MRI探针，其特征在于，其化学结构式如下：所述SPIO为超顺磁性氧化铁；所述CTX为氯离子通道蝎毒素；所述η为聚合度，为 4-200的任意整数。2. -种如权利要求1所述的MRI探针的制备方法，其特征在于，向：中加入盐 酸羟胺和乙二胺四乙酸，室温下反应脱去中的乙酰基，经截留分子量为3500的 半透膜纯化后与端碘乙酸酯化的超顺磁性氧化铁纳米粒子混合反应，冰浴条件下反应，搅 拌过夜，反应完成后离心即得所述MRI探针；所述端碘乙酸酯化的SPIO的化学结构式为：3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：在无水 条件下将巯基乙酸和乙酰氯反应得到乙酰化巯基乙酸，再与Ν-羟基琥珀酰亚胺反应得到 羧基活化的乙酰化巯基乙酸，再与氯离子通道蝎毒素反应得到4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述端碘乙酸酯化的SPIO的制备方法 为：将SPIO纳米粒子分散到环己烷中，加入PEG-硅烷，40-55Γ下超声，待环己烷挥发完全 得到PEG-硅烷修饰的SPIO ;再在PEG-硅烷修饰的SPIO中加入过量乙二胺，反应得到表面 氨基化的SPIO ;表面氨基化的SPIO再与碘乙酸反应得到所述端碘乙酸酯化的SPIO ;其合 成路线为：5. -种如权利要求1所述的MRI探针作为磁共振成像的造影剂的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种超顺磁性氧化铁纳米MRI探针和制备方法及其应用，其化学结构式如下：；所述SPIO为超顺磁性氧化铁；所述CTX为氯离子通道蝎毒素；所述n为聚合度，为4-200的任意整数。本发明成功地制备出了一种新型的超顺磁纳米MRI探针，该MRI探针纳米颗粒溶液的磁共振成像规律与SPIO溶液相同，均为随着溶液中铁浓度增高，T1WI序列的信号强度增高，T2WI序列的信号强度降低，对人肝细胞癌细胞株HepG2无明显的细胞毒性，可以用于肝细胞癌的早期检测。
【IPC分类】A61K49/14, A61K49/18, A61K49/12
【公开号】CN105267992
【申请号】CN201510812045
【发明人】陈柱, 肖恩华, 曾文彬
【申请人】中南大学湘雅二医院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月19日