治疗炎症性疾病的方法和非免疫原性组合物的制作方法
【专利说明】治疗炎症性疾病的方法和非免疫原性组合物
【背景技术】
[0001] 本技术涉及治疗炎症性疾病的方法，包括骨关节炎。特别地，方法特定包括使用含 细胞因子的溶液，包括源自血液和其它组织的非免疫原性溶液。
[0002] 炎症是复杂的细胞和生化过程，在受影响的血管和邻近组织中出现，响应损伤或 者物理、化学或生物学剂如病原体、过敏原或刺激物所导致的异常刺激而出现。所述炎症过 程包括局部反应和导致组织内形态变化；破化或移除致病物；引起修复和治愈的反应。大 部分情况下，炎症是有益和暂态过程，其随着机体攻击和克服传染剂或其它有害试剂而减 少。然而，一些情况下，炎症可以是慢性自保持过程，例如作为持续退化过程（如关节炎）或 自身免疫疾病的一部分，导致组织损坏。慢性炎症与多种疾病相关，包括类风湿性关节炎、 动脉粥样硬化、局部缺血性心脏病、牙周炎、结肠炎和一些癌症。
[0003] 炎性反应由涉及局部血管系统和免疫系统的生化事件以及受损组织内的多种细 胞级联组成。所述过程涉及释放多种细胞来源的调节剂，包括组胺、干扰素-γ、白介素-8、 白三烯、一氧化氮、前列腺素、肿瘤坏死因子-α和白介素-1。特别地，白介素-I(IL-I)包 括细胞因子家族，所述细胞因子能刺激淋巴细胞和巨噬细胞，活化吞噬细胞，增加前列腺素 生成，引起骨关节退化，提高骨髓细胞增殖，且参与许多慢性炎性病症。IL-I能由巨噬细胞、 单核细胞和树突细胞产生，且可以是抵御感染的炎性反应一部分。
[0004] IL-I作用模式可由白介素-1受体拮抗蛋白（IL-Ira ;也称为" IRAP"）调 节。IL-Ira在细胞表面结合的受体与IL-I相同，因此防止IL-I向该细胞发送信号。 E-Ira从白细胞中分泌，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、多形核细胞（PMN)和其 它细胞，且能调节多种IL-I相关免疫和炎性反应，如Arend WP，Malyak Μ，Guthridge CJ, Gabay C (1998)''Interleukin-lreceptor antagonist :role in biology^Annu. Rev. Immunol. 16:27-55所述。IL-Ira的生成由数种物质刺激，包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、 其它细胞因子和细菌或病毒组分。IL-Ira以及其它细胞因子如可溶性肿瘤坏死因子受体 I (sTNF-Rl)、可溶性肿瘤坏死因子受体2(sTNF-R2)和可溶性白介素受体I (SlL-IRII)，是 关节炎、结肠炎和肉芽肿性肺疾病中的重要天然抗炎蛋白质。
[0005] IL-Ira能用于治疗类风湿性关节炎，其中IL-I起关键作用的自身免疫疾病，减 少与该疾病相关的炎症和软骨降解。例如，Kineret?(阿那白滞素）是IL-Ira的重组、 非糖基化形式（加利福尼亚州千橡市的安进公司（Amgen Manufacturing, Ltd.))。多种 重组白介素-1抑制剂和治疗方法参见美国专利号6, 599, 873, Sommer等，2003年7月29 日公开；美国专利号5, 075, 222, Hannum等，1991年12月24日公开；和美国申请公开号 2005/0197293，Mellis等，2005年9月8日公开。另外，包括使用自身体液在内的从体液生 成IL-Ira的方法参见美国专利号6, 623, 472, Reinecke等，2003年9月23日公开；美国专 利号 6, 713, 246, Reinecke 等，2004 年 3 月 30 日公开；和美国专利号 6, 759, 188, Reinecke 等，2004年7月6日公开。
[0006] 许多这类炎症治疗为本领域已知。本领域已知疗法可涉及移除导致炎症反应的潜 在刺激物或试剂，或通过调节一个或多个炎性反应方面。示例包括糖皮质激素留体（如氢 化可的松、可的松、强的松和倍氯米松）、非留体抗炎药物（如阿司匹林、布洛芬和萘普生） 和免疫选择性抗炎药。然而，许多这类治疗呈现副作用，特别是在慢性施用期间，或具有限 制其应用的药理学特性。例如，使用IL-Ira的组合物和方法为本领域已知，同时其可能与 涉及IL-Ira稳定性和半衰期以及所提供IL-Ira量和速率的问题相关。此外，许多治疗对炎 症过程的根本病因没有作用。因此，需要改善的炎症治疗方法，提供一种或多种改进功效、 减少副作用和提升给药特性。
【发明内容】
[0007] 本技术提供富含抗炎性细胞因子的溶液产生方法以用于治疗炎症和其它由白介 素-1和肿瘤坏死因子-α介导的疾病。产生这类溶液的方法包括将液体体积的细胞因子 生成细胞（如白细胞）接触固相提取材料，从液体移出固相提取材料。所述方法进一步包 括以下一种或两种：在液体与固相提取材料接触期间或之后从液体移出细胞，从液体移出 固相提取材料后冷冻干燥（冻干）溶液。在一些实施方式中，液体体积的细胞获自多种哺 乳动物对象。此技术的组合物是非免疫原性的，能用于治疗哺乳动物对象，无论制备溶液所 用的细胞来源如何。
[0008] 特别地，本技术提供制备非免疫原性抗炎性细胞因子组合物的方法，包括含有以 下步骤的方法：
[0009] (a)从哺乳动物供体获得含细胞因子生成细胞的液体，所述细胞如白细胞；
[0010] (b)将液体接触固相提取材料以产生富含白介素 -1受体拮抗剂的组合物；和
[0011] (c)从组合物中移出细胞。
[0012] 方法还包括
[0013] (a)从哺乳动物供体获得含细胞因子生成细胞的液体；
[0014] (b)将液体接触固相提取材料以产生富含白介素 -1受体拮抗剂的组合物；和
[0015] (c)冷冻组合物以生成非免疫原性抗炎性细胞因子组合物。
[0016] 在其它实施方式中，方法包括：
[0017] (a)从哺乳动物供体获得含细胞因子生成细胞的液体；
[0018] (b)将液体接触固相提取材料以产生富含白介素 -1受体拮抗剂的组合物；和
[0019] (C)从固相提取材料分离液体；
[0020] (d)将所述组合物与储液混合以制备贮存稳定化的溶液；和
[0021] (e)冷藏稳定化溶液。
[0022] 在各种实施方式中，含细胞因子生成细胞的液体可包括全血、骨髓抽吸物、脂肪组 织、尿、其部分（如富血小板血浆和骨髓浓缩物）及其混合物，含有（例如）白细胞、脂肪基 质细胞、脂肪细胞和骨髓基质细胞。所述固相提取材料可选自刚玉、石英、钛、葡聚糖、琼脂 糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和其组合。
[0023] 在一些实施方式中，含细胞因子生成细胞的液体由包括以下步骤的方法制备：
[0024] (1)将含细胞因子生成细胞的组织加样到置有浮标的管内，其中所述浮标的密度 使得浮标能在管内组织离心后可操作达到平衡位置，所述平衡位置在含细胞因子生成细胞 的第一部分和第二部分之间，第二部分的细胞浓度大于第一部分的细胞浓度；
[0025] (2)对管进行离心，从而所述浮标界定第一与第二部分之间的界面；和
[0026] (3)移出细胞部分以形成含细胞因子生成细胞的液体。
[0027] 在各种实施方式中，所述获得和接触步骤包括：
[0028] (1)将含全血、骨髓抽吸物或两者和抗凝剂的组织加样到置有浮标的管内，其中所 述浮标的密度使得浮标能在管内组织离心后达到平衡位置，所述平衡位置在含细胞因子生 成细胞的第一部分和第二部分之间，第二部分的细胞浓度大于第一部分的细胞浓度；
[0029] (2)对管进行离心，从而所述浮标界定第一与第二部分之间的界面；和
[0030] (3)收集第二部分，作为含细胞因子生成细胞的液体；
[0031] (4)将第二部分加样到含固相提取材料的浓缩器组件，温育与固相提取材料接触 的第二部分；和
[0032] (5)旋转浓缩器组件，采用的离心速度能分离固相提取材料和富含白介素-1受体 拮抗剂的溶液，所述溶液的白介素-1受体拮抗剂浓度大于全血。
[0033] 在各种实施方式中，所述抗炎性细胞因子组合物包含
[0034] (i)白介素-1受体拮抗剂（IL-Ira)，浓度为至少约10, 000pg/ml ;
[0035] (ii)可溶性肿瘤坏死因子受体I (sTNF-Rl)，浓度为至少约1，200pg/ml ;和
[0036] (iii)蛋白质，选自sTNF-RII (可溶性肿瘤坏死因子受体2)、IGF_I(胰岛素样生长 因子I)、EGF (表皮生长因子）、HGF (肝细胞生长因子）、TOGF-AB (来源于血小板的生长因 子AB)、TOGF-BB(来源于血小板的生长因子BB)、VEGF (血管内皮生长因子）、TGF-β 1(转 化生长因子β I)、sIL-lRII (可溶性白介素受体II)和其混合物，其中所述蛋白质在所述组 合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。
[0037] 在一些实施方式中，所述组合物额外包括白细胞、血小板或其组合。
[0038] 在人或其他哺乳动物对象中治疗白介素-1受体所介导病症如炎症的方法，包括 局部施用本技术的组合物。在各种实施方式中，所述组合物用细胞因子细胞悬液制备，所述 悬液获自哺乳动物对象或待治疗对象之外的多种对象。
【附图说明】
[0039] 图1的框图描述生成抗炎性细胞因子组合物的方法；
[0040] 图2是分级分离装置的图；
[0041] 图3显示在离心之前（图3A)和之后（图3B)激活样品产生抗炎性细胞因子的装 置；
[0042] 图4是产生血凝块的装置的图；
[0043] 图5是能产生抗炎性细胞因子组合物的单一装置的图；
[0044] 对应的参考数字指示附图数个视图中的对应部分。应指出，本文所列图意在举例 说明本技术材料、组合物、装置和方法的一般特征，以用于描述某些实施方式的目的。这些 图不一定精确反映任意给定实施方式的特征，且不必定用于完整定义或限制本技术范围内 的特定实施方式。
[0045] 发明详述
[0046] 下列技术描述仅示例一种或多种发明的组合物性质、制造和应用，且不意在限制 本申请或所述其他申请中要求权利的任何特定发明的范围、实施和应用，所述其他申请可 能提交要求对本申请的优先权，或其中公开的专利。在本详细描述的结尾处提供关于术语 和短语的非限制性讨论，用于协助理解本技术。
[0047] 本技术涉及组合物、制备组合物的方法、使用组合物治疗炎症性疾病和由白介 素-1所介导其它疾病的方法。一般地，这类组合物由包括以下步骤的方法制备：
[0048] (a)从一个或多个哺乳动物对象获得含细胞因子生成细胞的液体（"细胞因子细 胞悬液"，如下进一步所讨论）；和
[0049] (b)分级分离液体以生成含一种或多种蛋白质如白介素-1受体拮抗剂的蛋白质 溶液。
[0050] 蛋白质组合物
[0051] 本技术提供在人或其它哺乳动物对象中治疗由白介素-1所介导的炎症性疾病和 其它疾病的方法，所述方法使用包含溶解、悬浮或另外携带从而以生理学可接受介质形式 递送给哺乳动物对象的蛋白质的组合物（本文称为"蛋白质溶液"）。在各种实施方式中， 所述组合物包含产自正常哺乳动物对象全血的蛋白质（如细胞因子）。所述组合物还包含 活细胞，包括血小板、白细胞、和其组合。
[0052] 在各种实施方式中，所述蛋白质溶液包含至少2种选自以下的蛋白质：IL_lra、 sTNF-RI、sTNF-RII (可溶性肿瘤坏死因子受体2)、IGF-I (胰岛素样生长因子I)、EGF(表皮 生长因子）、HGF (肝细胞生长因子）、TOGF-AB (来源于血小板的生长因子AB)、TOGF-BB (来 源于血小板的生长因子BB)、VEGF(血管内皮生长因子）、TGF- β 1 (转化生长因子β I )、 sIL-lRII (可溶性白介素受体II)，其中所述组合物的2种蛋白质各自浓度均大于正常血液 中各蛋白质的浓度。为清晰起见，所述蛋白质溶液可包含来自所述组的3种或更多蛋白质。 尽管所述组合物中每一种蛋白质浓度可大于正常血液中其各自浓度，但不必定2种以上蛋 白质的浓度大于正常血液中其各自浓度。
[0053] 在各种实施方式中，蛋白质溶液包括下列组分。
[0054] 表1.蛋白质溶液示例性蛋白质组分
[0055]
[0057] 蛋白质浓度能用实施例4所示方法测量。
[0058] 优选地，所述组合还包含活的白细胞、裂解的白细胞或两者。在优选组合物中，所 述蛋白质溶液包含单核细胞、粒细胞和血小板。在各种实施方式中，蛋白质溶液包含下列组 分。
[0059] 表2.蛋白质溶液示例性细胞组分
[0061] 应理解该浓度为种特异性。此外，应理解浓度可随着个体对象而变化。因此，在包 括从含细胞因子生成细胞的血液或其它组织生成蛋白质溶液的方法中，所述蛋白质溶液的 蛋白质和细胞浓度可与上述不同；上述值是浓度均值，如对象群体中所见。
[0062] 在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种蛋白质或其它组分的浓度大于 正常血液中该组分的浓度。（具有所述更高组分浓度的组合物被称为"富含"这些组分。） 如本文所示，"正常"血液或其它组织中的组分浓度是获得组织的哺乳动物对象一般群体中 所见浓度，例如正常全血中。在抗炎性细胞因子组合物获自特定对象组织的方法中，蛋白质 或细胞的"正常"浓度可以是进行加工获得蛋白质或细胞之前的个体血液中的浓度。
[0063] 因此，在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种组分的浓度比正常血液 中该组分浓度高大于约1. 5倍、约2倍或约3倍。例如，相对于正常（全）血，组合物中的 组分可具有更高浓度，如下所示：
[0064] · IL-lra，浓度高至少2. 5倍、或至少3倍或至少5倍；
[0065] · sTNF-RI，浓度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0066] · sTNF-RII，浓度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0067] · SlL-IRII，浓度高至少1. 5倍、或至少1. 8倍或至少2倍；
[0068] · EGF，浓度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0069] · HGF，浓度高至少2倍、或至少3倍或至少4倍；
[0070] · H)GF-AB，浓度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0071 ] · PDGF-BB，浓度高至少2倍、或至少3倍或至少5倍；
[0072] · TGF- β 1，浓度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0073] · IGF-I，浓度高至少1. 2倍、或至少1. 4倍或至少1. 5倍；
[0074] · VEGF，浓度高至少2倍、或至少2. 5倍或至少3倍；
[0075] ?白细胞，浓度高至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；
[0076] ?血小板，浓度高至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；
[0077] ?中性粒细胞，浓度高至少1. 5倍、或至少2倍或至少3倍；
[0078] ?单核细胞，浓度高至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0079] ?淋巴细胞，浓度高至少5倍、或至少8倍或至少10倍；和
[0080] ?嗜碱性细胞，浓度高至少2倍、或至少4倍或至少6倍。
[0081 ] 同样，所述蛋白质溶液中的红细胞浓度优选是正常血液中红细胞浓度的至少一 半，或至少三分之一。
[0082] 例如，蛋白质溶液可包含：
[0083] (a)至少约 10, 000pg/ml ILl-ra ;
[0084] (b)至少约 1，200pg/ml sTNF-RI ;和
[0085] (c)蛋白质，选自 sTNF-RII、IGF-I、EGF、HGF、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-β 1、 和sIL-lRII以及其混合物，其中所述蛋白质的浓度大于正常血液中该蛋白质的基线浓度。 另一示例中，蛋白质溶液包含：
[0086] (a)白介素-1受体拮抗剂（IL-Ira)，浓度比正常血液中IL-Ira浓度高至少3倍；
[0087] (b)可溶性组织坏死因子因子-rl (sTNF-rl)，浓度比正常血液中IL-Ira浓度高至 少2倍；
[0088] (c)白细胞，浓度比正常血液中白细胞浓度高至少2倍；和
[0089] (d)血小板，浓度比正常血液中血小板浓度高至少2倍。