[0090] 在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的IL-Ira浓度优选比该蛋白质溶液中的 白介素-1 α浓度高至少5, 000倍或至少10, 000倍。IL-Ira:白介素-1 β (IL-1 β )浓度之 比优选是至少100。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的IL-Ira浓度优选比该蛋白质 溶液中的IL-I β浓度高至少1500倍或至少8000倍。sIL-lRII:白介素-1 β (IL-1 β )浓 度之比优选大于1。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的sIL-lRII优选比该蛋白质溶 液中的白介素-1 β浓度高至少2000倍或至少45000倍。
[0091] 本技术提供蛋白质溶液，其中该蛋白质溶液的一种或多种组分获自非自体来源， 如通过重组或合成方法，或通过从同种异体来源（即来自与待施用溶液的对象种类相同的 对象）或异种来源（即来自待施用溶液的种类以外的动物来源）分离。在一些实施方式中， 所述蛋白质溶液由这类同种异体组分组成，或基本由其组成。然而，在各种实施方式中，所 述蛋白质溶液额外包括源自对象的一种或多种组分（如白细胞和血小板），根据本技术的 治疗方法向所述对象施用所述溶液。因此，这类组分是"自体的"。在一些实施方式中，所述 蛋白质溶液包括自体和同种异体组分的混合物。
[0092] 制备蛋白质溶液的方法
[0093] 蛋白质溶液可通过多种方法（包括混合个体组分）和方法的任一种制备，（其中 一种或多种组分获自源材料。在各种实施方式中，所述蛋白质溶液通过分级分离细胞因子 细胞悬液制备，从而生成含ILl-ra的蛋白质溶液。
[0094] 通过细胞因子生成细胞接触提取物质来获得蛋白质溶液
[0095] 在各种实施方式中，通过从含细胞因子生成细胞的组织获得一种或多种组分来制 备蛋白质溶液。如本文所示，"细胞因子生成组织"是获自哺乳动物对象的组织，包含能生成 细胞因子的细胞。这种细胞包括白细胞、脂肪基质细胞、骨髓基质细胞和其组合。应理解白 细胞包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。用于 本技术方法的白细胞优选包括单核细胞和中性粒细胞。本文所用的细胞因子生成组织包括 血液、脂肪组织、骨髓、和其部分，如下进一步所讨论。
[0096] 本文所用的血液包括全血、血浆、富血小板血浆、贫血小板血浆和血凝块。在优选 实施方式中，本技术方法使用含白细胞和血小板的富血小板血浆（PRP)，包含通过沉淀全血 产生的白膜层。本文所用的脂肪组织包括任何脂肪组织，包括白色和棕色脂肪组织，其可获 自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织位置。本文所用的骨髓包括红髓和黄髓。在 优选实施方式中，骨髓是获自红髓和黄髓的骨髓浓缩物，包括造血和间充质干细胞。如上所 讨论，相对于根据本技术方法治疗的对象，本技术的组合物可制备自同种异体来源的血液、 脂肪和骨髓组织。组合物还可制备自同种异体和自体组织的组合。
[0097] 在一些实施方式中，方法包括分级分离液体（"细胞因子细胞悬液"），所述液体包 含能生成细胞因子如ILl-ra和sTNF-Rl的细胞。如上所讨论，这种细胞包括白细胞、脂肪 基质细胞、骨髓基质细胞和其组合。在一些实施方式中，所述细胞因子细胞悬液是含白细胞 的液体。应理解所述细胞因子细胞悬液包括细胞和胞外液体，无论细胞和液体的相对比例 如何。在一些实施方式中，所述悬液可主要包括细胞，液体仅作为副成分，基本用于湿润细 胞。在一些实施方式中，所述液体可包括两相，由以下构成：主要由液体组成的相和主要由 细胞组成的相，仅在搅拌或其它混合后形成液体中的细胞的悬液。
[0098] 如图1所示例，本技术方法包括：
[0099] (a)获得细胞因子细胞悬液，如含白细胞的液体（步骤105、115或135,或其组 合）；
[0100] (b)悬液与固相提取材料接触（步骤140);和
[0101] (c)从固相提取材料分离含蛋白质的液体（步骤150)。
[0102] 获得悬液105、115和135能包括产生含细胞液体的任意多种本领域已知方法。这 类方法包括从组织和培养物分离。获得悬液可在所述方法中直接进行，其中健康护理人员 或其他个体进行分离、加工、培养或其它方法以产生悬液，所述过程包括接触和分离步骤。 在一些实施方式中，产生悬液的方法与接触和分离步骤同时进行，作为照护过程的一部分， 如本文进一步所讨论。或者，获得悬液可以是间接的，仅涉及获取悬液以用于接触和分离步 骤，其中产生悬液的加工处理之前由另一方完成。
[0103] 在各种实施方式中，获得包括从血液、脂肪组织、骨髓抽吸物或其它含细胞因子生 成细胞的组织中分离细胞因子细胞悬液，所述悬液包含白细胞或其它细胞因子生成细胞， 如图1的步骤110、120和125所示例。方法可包括从2、3或更多组织来源获得细胞因子细 胞悬液。
[0104] 从血液获得细胞因子细胞悬液
[0105] 在包括使用血液的实施方式中，血液可直接用于接触固相提取材料，如图1的步 骤140所示例，或在优选实施方式中，可加工所述血液以提供成分血，如PRP。产生成分血的 许多装置和方法为本领域已知，采用诸如离心和过滤等手段。
[0106] 在各种实施方式中，本技术方法包括用离心产生作为细胞因子细胞悬液的PRP。这 种方法一般包括将血液置于容器中，分离器可操作使血液分成2个或更多部分，并且离心 分离器以产生富血小板血浆部分。这类装置可包括管和置有浮标的管，其中所述浮标的密 度使得浮标能在管内组织离心后达到平衡位置，所述平衡位置在含白细胞的第一部分和第 二部分之间，第二部分的白细胞浓度大于第一部分的白细胞浓度。这种方法还包括对管进 行离心，从而所述浮标界定含白细胞的第一与第二部分之间的界面。然后，收集第二部分以 进一步用于本技术方法。
[0107] 本文所用的一个这种装置参见美国专利号7,992,725，Leach等，2011年8月9日 公开。这类装置市售可得，如来自巴奥米特公司（Biomet Biologies, LLC)(美国印第安纳 州华沙）的GPS III血小板浓缩和分离系统。所述装置能用于临床或实验室环境以从悬液 或多组分组织材料中分离各部分，所述材料获自对象，如血液、骨髓抽吸物、脑脊液、脂肪组 织。分离部分可包括血小板、贫血小板血浆、富血小板血浆和基质细胞。所述分离部分各自 可在分离容器内具有平衡点或位置，当分离发生时可达到。例如，分离全血样品时，全血的 白膜层（PRP)的平衡位置在红细胞之上。
[0108] 分级分离装置200如图2所示例。分级分离装置200包括浮标210和容器壁215。 对分离容器205进行离心时，浮标周界210a和容器壁215有间隙，允许浮标210在分离容 器205内移动且材料能在浮标周界210a与容器壁215之间通过。或者，浮标210可具有开 口，如中心或内置式开口或者沿着浮标高度的外围通道，这允许材料穿过浮标。
[0109] 分离容器205中载有浮标210,浮标210的调谐密度配置成到达悬液的选定平衡位 置。所述浮标的密度调整在约l.〇g/cc-约I. 10g/cc范围内，如约1.06g/cc。根据各种实 施方式，浮标210能设立成纳入调谐密度且能由一种或多种材料形成以达到调谐密度。
[0110] 如图2所示，分离过程发生后，收集室220位于装置200内。收集室220相对于浮 标210定义，位于容器内分开或分离的中间部分225的平衡位置。选定部分的平衡位置能 定义为相对于分开样品或材料的容器内其它部分，其在该容器内的位置。平衡位置还能相 对于浮标210或容器12的X轴定义。然而，平衡位置可取决于样品内一定量选定部分的样 品量。根据图12说明，部分230的平衡位置高于或比中间部分225的平衡位置更接近装置 200的顶部235。因此，浮标210能调整，如包括选定密度或特定重力，从而相对于任何选定 部分的平衡位置放置收集室220。
[0111] 在一些实施方式中，浮标210能包括收集端口 240。收集端口 240与进入端口 245 连通并与浮标上表面250之上的收集空间220连通，并且能位于浮标周界210a附近。在一 些实施方式中，浮标未载有收集端口 240,反而收集端口是回收装置，如经进入端口或装置 200顶部插入的注射器。
[0112] 根据各种实施方式，分离器255与浮标210偶联。根据各种实施方式，分离器与浮 标的组合还能称为分离集合成员。例如，分离器255提供产生收集室220的方式且包括一 个或多个间隔器260、265以使分离器255与浮标210位置分开，从而形成收集室220。分离 器255载有回收端口 270,连通回收端口 245与收集端口 240。间隔器260、265还能用作收 集端口 50与回收或回收端口 245之间的回路275。回收端口 245用作从收集室220回收经 分离或中间部分225的结构。
[0113] 含全血的装置200进行离心后，第一部分或顶端部分230可以是贫血小板血浆，中 间部分225可以是富血小板血浆或血小板浓缩物，底端部分278可以是红细胞。因此，分级 分离方法还包括从装置200回收所需部分。能提供多个端口 205、245和280以允许进入装 置200的任何合适室。进入端口 205、245、280可以是允许从分离装置200外部连通该装置 内部的任何方式，如卢尔锁端口、隔片、阀或其它开口。另外，收集通气管285允许经开口 290移出收集室220中的分离悬液，而不需移出分离器255之上的所述部分如血浆。即使没 有收集通气管285,分离器上的部分能移出且收集区域可排入分离器上的区域。
[0114] 采用分级分离装置200的方法可通过经进入端口 245输入全血而开始。分级分离 装置200置于离心机内并旋转，旋转时间适合分级分离全血。示例性时间段可以是约5分 钟-约20分钟，速度为约320rpm-约5000rpm。此速度可产生约7. 17xg-约1750xg (正常 重力倍数）的选定重力。
[0115] 可用于分离富血小板血浆的其它装置描述于例如美国专利 5, 585, 007, Antanavich, 1996年 12 月 17 日公开；美国专利号 6, 398, 972, Blasetti 等，2002 年6月4日公开；美国专利号6, 649, 072，Brandt等，2003年11月18日公开；美国专利 号 6, 790, 371，Dolocek, 2004 年9 月 14 日公开；美国专利号 7,011,852, Sukavaneshvar 等，2006年3月14日公开；美国专利号7, 179, 391，Leach等，2007年2月20日公开；美国专 利号 7, 374, 678, Leach 等，2008 年 5 月 20 日公开；美国专利号 7, 223, 346, Dorian 等，2007 年5月29日公开；和美国专利号7, 708, 152, Dorian等，2010年5月4日公开。
[0116] 除了 〇?51<血小板浓缩和分离系统，多种其它市售可得装置能用于分离富血小 板血衆，包括Magellan?自体血小板分离器系统，可购自美敦力公司（Medtronic, Inc.) (美国明尼苏达州明尼阿波利斯）；SmartPReP?，可购自Harvest技术公司（Harvest Technologies Corporation)(美国马萨诸塞州普利茅斯）；AutoloGel?法，可购自 Cytomedix公司（Cytomedix, Inc.)(美国马里兰州罗克维尔）；GenesisCS系统，可购自 EmCyte公司（EmCyte Corporation)(美国佛罗里达州迈尔斯堡）；PCCS系统，可购自巴奥 米特3i公司（Biomet 3i, Inc.)(美国佛罗里达州棕榈滩花园）；和Arthrex ACP?双注射 器系统，可购自Arthrex公司（Arthrex, Inc.)(美国佛罗里达州那不勒斯）。
[0117] 再次参考图1，获取自患者的血可在一个或多个步骤115、120、125和130中与抗凝 剂混合，从而有利于加工。合适的抗凝剂包括肝素、枸橼酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD)、乙二胺四 乙酸（EDTA)、抗凝柠檬酸葡萄糖溶液（ACD)和其混合物。例如，所述抗凝剂可置于用于从对 象采血的注射器中，或可在抽取后与血液混合。
[0118] 通过混合细胞与合适液体可制备含白细胞的液体，如步骤125所示，使用本领域 已知方法。例如，白细胞可如下从全血分离：通过裂解红细胞或用密度梯度离心全血，其 中白细胞沉淀到离心管底部。密度离心示例包括Ficoll-Paque? Plus (美国新泽西州皮 斯卡塔韦的通用电气医疗集团生命科学部（GE Healthcare Bio-Sciences))。一些情况 下，密度离心可用于进一步分离单核细胞与多形核细胞。白细胞还可用过滤从全血制备； 示例包括Acelere? MNC收获系统（美国密歇根州安阿伯市的颇尔生命科学（Pall Life Sciences))。白细胞还能从骨髓获得。随后，白细胞悬于适当介质如血浆，从而维持其活力。
[0119] 其它方法可用于产生富血小板血浆或含白细胞的其它液体。例如，白细胞能进行 离心，而不需用浮标系统，白细胞可在多个阶段中离心，能使用连续离心法，还能用过滤。另 外，含富血小板血浆的血液组分能如下生成：用慢速离心步骤分离血浆与红细胞以防止血 小板成团。在其它实施方式中，从离心血液形成的白膜层可与剩余血浆分离并重悬形成富 血小板血浆。
[0120] 从脂肪组织获得细胞因子细胞悬液
[0121] 在包括使用脂肪组织的实施方式中，所述脂肪组织可直接用于接触固相提取材 料，如图1的步骤140所示例，或所述脂肪组织可处理成提供步骤110的经分离脂肪细胞。 本方法还使用含脂肪来源干细胞的细胞部分。在一些实施方式中，脂肪组织源自通过躯干 抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。基质细胞可用任何合适方法从脂肪组织 和/或组织部分分离，包括本领域已知方法如机械和分解离心。基质细胞还可用酶消化分 离。例如，基质细胞能从脂肪组织提取物中分离，通过超声波和/或酶消化处理，离心富集。 分离自脂肪组织的基质细胞可洗涤和成团。
[0122] 例如，在专用收集容器内通过躯干抽吸辅助肿胀吸脂术能收集脂肪组织，所述容 器连接吸入软管和吸脂管。收集容器可具有纱布型网格，允许肿胀液通过并保留固体脂肪 组织。收集脂肪组织后，收集容器从抽吸装置中移出并重新连接离心装置。过滤单元还可 包含孔径约100微米的滤器。一旦含脂肪组织的收集容器连接离心装置，对组织进行超声 波处理。超声波处理后，将完整设备插入离心桶并以例如300xg离心5分钟。离心后，收集 容器与过滤单元一起分离且可弃去。随后，含基质细胞的团块能重悬于生物相容性溶液，如 血浆、血浆浓缩物和富血小板血浆。
[0123] 用于分离和/或分级分离脂肪组织及脂肪细胞的多种方法和装置包括以下 专利所述的那些：美国专利号7, 374, 678, Leach, 2008年5月20日公开；美国专利号 7, 179, 391，Leach 等，2007 年 2 月 20 日公开；美国专利号 7, 992, 725, Leach 等，2011 年 8月9日公开；美国专利号7,806,276，Leach等，2010年10月5日公开；和美国专利号 8, 048, 297, Leach等，2011年11月1日公开。诸如GPS?血小板浓缩系统的装置市售获自 巴奥米特公司（美国印第安纳州华沙），可用于分离脂肪细胞。
[0124] 从骨髓获得含白细胞的液体
[0125] 在包括使用骨髓的实施方式中，所述骨髓可直接用于接触固相提取材料，如图1 的步骤140所示例，或可处理成提供步骤135的骨髓浓缩物。获得和浓缩骨髓的许多装置 及方法为本领域已知。
[0126] -种分离和产生骨髓浓缩物（cBMA)的不例性过程如图6所不。一般，方法600可 起始于步骤605,获得骨髓抽吸物体积。骨髓抽吸物（BM)可以任何选定或一般已知方式获 得。例如，选定骨区域如接近外科手术的部分，能用于获得骨髓抽吸物。一般，进入装置如 注射器和针能用于进入选定骨的髓内区域。可从多个位置抽取小体积的选定部分以获得适 当体积的BM或选定BM部分。
[0127] -旦步骤605获得选定体积的BMA，其可用重力分离器分离并浓缩。本文所用 的分离器可操作分离多组分流体，所述流体一般包括混杂或混合在一起的不同密度的多 种组分或成分，包括上述用于分离来自血液和脂肪组织的部分的那些。分离器可包括相 对于BMA具有选定密度的浮标。这种分离器包括上述用于浓缩和分离来自血液和脂肪 组织的部分的那些，包括以下专利所述的那些：美国专利号7, 374, 678, Leach, 2008年 5月20日公开；美国专利号7,