)实验设计与统计分析
[0069] ①单因素实验
[0070] 准确称取粉碎的沉香叶2.Og,选用不同的浸提时间、液料比、浸提溫度、乙醇浓度 进行水浴浸提单因素试验，每个条件设置=个平行样，反复=次浸提，并按步骤2)所述的 方法计算提取液中的茶多酪含量；结果见图1至图4。
[0071] 由图1可知，随着时间增加，提取的茶多酪含量先逐渐增加后减少，运是由于随着 时间增加茶多酪在水中逐渐溶出，提取液的茶多酪含量增加；当时间过长，茶多酪长时间暴 露在空气中并处于高溫之下，部分被氧化或发生降解反应，浸出率下降。因此，茶多酪最佳 浸提时间为30min。
[007引由图2可知，随着液料比增加，提取的茶多酪含量逐渐增加，当液料比为35mL?g1 时，达到最大值。当液料比大于35mL-gi，茶多酪含量减少，最后趋于稳定。因此，茶多酪 提取的最佳液料比为35mL?g1。
[0073] 由图3可知，随着溫度升高，提取的茶多酪含量逐渐增加后减少。可能是随着溫度 上升，有效成分溶解度增大；当溫度过高，较高溫度使得茶多酪类化合物分解，提取率下降。 因此，茶多酪提取的最佳溫度为80°C。
[0074] 由图4可知，当乙醇浓度增大，茶多酪含量先略有上升后逐渐下降。可能是高浓度 乙醇容易引起茶叶中蛋白质等物质变性，茶叶颗粒渗透性降低，从而导致茶多酪的浸提率 下降。因此，茶多酪提取的最佳乙醇浓度为40%。
[00巧]②响应面法优化设计
[0076]W单因素试验结果为基础，采用SAS软件应用Box-Behnken设计方法，选择浸提时 间（A)、液料比度）、浸提溫度似、乙醇浓度做作为响应变量，编码水平为-UO和1，且W 沉香叶茶多酪含量（Y)作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酪提取条件进行优化。 响应面试验因素编码及水平设计见表1。
[0077] 表1响应曲面试验因素水平设计
[0079] 模型建立与显著性检验：选取浸提时间（A)、液料比度）、浸提溫度（C)、乙醇浓度 值)4个因素作为自变量，W沉香叶茶多酪含量为响应值。Box-Benhnken实验设计与结果如 表2所示。
[0080] 表2Box-Benhnken试验设计与结果
[0081]
[0083] 方差分析及显著性检验：用软件Desi即-Expert. 8. 05对所得数据进行回归分析， 分析结果如表3所示。对各因素进行回归拟合之后，得到回归方程：
[0084] 茶多酪含量（％)=-17.50450-0.39913八+1.296278+0.010700〔+0.591770-0. 014800AB+9. 32500X10 3AC+3. 85000X10 3AD+ 3. 5000X10 4BC+2.IX10 化0 - 9. OOOOOX 10 4CD+1. 05917X 10 3八2- 0. 013763B 2-1. 67833X 10 3〔2- 8. 90333X 10化2
[0085] 表3回归模型方差分析
[0086]
[008引注：模型的确定系数R2= 0. 9865;模型的调整确定系数Rw2= 0. 9729 ;**差异极 显著（P< 0. 01) ;*差异显著（P< 0. 05)
[0089]由表3可知，回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著（P< 0. 0001)，失拟 项不显著（P= 0. 2488 > 0. 05)，该模型具有统计学意义。模型的确定系数R2= 0. 9865， 调整确定系数Rw2= 0.9729,说明模型拟合度较好。模型的失拟项差异不显著，说明回归 方程拟合程度高，可用来对浸提沉香叶茶多酪的工艺参数进行初步分析和预测。分析结果 还表明，方程的一次项中A对响应值的影响极显著，二次项82、(：2、02，交互项48、4(：、40对响 应值的影响极显著。
[0090] 从各因素影响程度分析，各因素的F值可W反映出各因素的影响大小，F值越大， 对响应值影响越大。从表3可知，Fa= 176. 67,FB= 0.014,FC= 0.28,FD= 1.00,各因素 对沉香叶茶多酪含量影响大小顺序为：浸提时间 > 乙醇浓度> 浸提溫度>液料比。
[0091] 4)实验结果分析与优化
[0092] 通过软件Design-Expert8. 0. 5求解方程，得出最优提取工艺条件得到浸提沉香 叶茶多酪最佳工艺条件为：浸提时间40min，液料比30. 05mL，g1，浸提溫度90°C，乙醇浓度 40. 75%。出于对条件可操作性考虑，将最佳提取工艺条件修正为：浸提时间40min，液料比 30mL?g1，浸提溫度90°C，乙醇浓度40%，采用此浸提条件提取茶多酪进行验证试验，重复 =次，茶多酪含量为13. 72%，与预测值13. 46%相近。说明通过响应面优化后的提取条件 参数可靠，具有实践指导意义。
【主权项】
1. 一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，其特征在于：包括如下步骤： 1) 供试液的制备 将沉香叶粉碎，用包装袋装好备用；准确称取粉碎的沉香叶2. Og，用体积分数为 30-70%的乙醇溶液进行水浴浸提，浸提时间为10-50min，液料比为20-40mL *g \浸提温度 为50-90°C ;将粗提取液以转速3500r/min离心6min后，取上清液并加入与上清液等体积 的氯仿混匀脱色，在黑暗条件中静置Ih后取上层清液即茶多酚母液；移取Iml茶多酚母液 于100mL容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀，待测； 2) 提取液中茶多酚含量测定 ① 沉香叶样品中干物质的含量测定 按照GB/T8302-2013的方法进行沉香叶的精准取样，称取5g样品于烘皿中，置于120°C 干燥箱中，加热Ih后加盖取出，于干燥器内冷却至室温，称量，干物质含量为： 100% 式中：m。:试样的原始质量，单位为克 m1:干燥后的试样质量，单位为克 ② 制备测试液 a、 配制10 %福林酚试剂 将25ml福林酚试剂转移到250ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀； b、 配制质量分数为7. 5%的碳酸钠溶液 称取37. 50g Na2CO3，用适量水溶解后移至500ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀； c、 配制没食子酸标准储备液 称取0.1 lOOg没食子酸，用适量水溶解后移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇 匀； d、 配制没食子酸工作液 分别移取〇. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. OmL的没食子酸标准储备液于 IOOmL容量瓶中，分别定容至刻度线，摇匀，得到浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50 μ g/mL的没食子酸工作液； ③ 茶多酚含量测定及结果计算 分别移取已配制的一系列梯度没食子酸工作液、供试液、水各1.0 OmL于25mL比色管 内，在每个比色管管内分别加入5. OmL福林酚试剂，摇匀，反应3-8分钟，加入4. OmlNa2CO3 溶液，加水定容后摇匀，在室温下遮光放置60min，用紫外可见分光光度计进行波长扫描及 吸光度的测定； 比较试样和标准工作液的吸光度，式中： A :供试液吸光度；V :样品提取液体积；d :稀释因子；SLOPEstd :没食子酸标准曲线的 斜率;M :样品中干物质的含量（％ ) ;M1:样品质量（g); 3) 实验设计与统计分析 ①单因素实验 准确称取粉碎的沉香叶2. Og，选用不同的浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度进行 水浴浸提单因素试验，每个条件设置三个平行样，反复三次浸提，并按步骤2)所述的方法 计算提取液中的茶多酚含量； ②响应面法优化设计 以单因素试验结果为基础，采用SAS软件应用Box-Behnken设计方法，选择浸提时间 (A)、液料比（B)、浸提温度（C)、乙醇浓度（D)作为响应变量，编码水平为_1、0和1，且以沉 香叶茶多酚含量（Y)作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化；对 各因素进行回归拟合之后，得到回归方程： 茶多酚含量（％)= -17. 50450-0. 39913A+1. 29627B+0. 010700C+0. 59177D - 0· 0148 00AB+9. 32500 X 10 3AC+3. 85000 X 10 3AD+3. 5000 X 10 4BC+2. I X 10 3BD - 9. 00000 X 10 4CD+ I. 05917 X 10 3A2 - 0. 013763B 2-l. 67833 X 10 3C2 - 8. 90333 X 10 3D2; 4)实验结果分析与优化 通过Design-Expert. 8. 05软件对回归方程进行计算，得到浸提沉香叶茶多酸最佳工 艺条件。
【专利摘要】本发明提供了一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，包括如下步骤：1)制备供试液；2)提取液中茶多酚含量测定；3)实验设计与统计分析：①单因素实验，②响应面法优化设计：以单因素试验结果为基础，选择浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度作为响应变量，以沉香叶茶多酚含量作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化；4)实验结果分析与优化：通过Design-Expert.8.05软件对回归方程进行计算，得到浸提沉香叶茶多酚最佳工艺条件。
【IPC分类】G01N21/33, A61K36/835, G01N21/78
【公开号】CN105343335
【申请号】CN201510789239
【发明人】潘军辉, 张国文, 谢雨婷, 李明智, 万宇俊, 喻芸
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月17日