-SG的LC-MS谱；图 13顺式-SG的LC-MS谱；
[0134]SG抗糖尿病作用动物研究中使用的三种溶液的HPLC色谱。图14纯反式-SG;图 15PM根粉60%乙醇提取物（顺式-SG与反式-SG比例大约是1 :20);图16溶液B用紫外 光富集顺式-SG(顺式-SG的反式-SG的比例大约是2:3)。
[0135] 图17不同比例的反式-SG和-顺式-SG的抗糖尿病作用。使用高脂肪饮食诱导 KK小鼠产生2型糖尿病，并纪录所有组的体重和血糖值。
[0136] 从结果来看，和糖尿病对照组相比，上述三种溶液没有显著降低高脂诱导的体重 增加。对于血糖值，它呈现出一种趋势：顺式-SG含量越高，该组中血糖水平越低。唯-- 组表现出显著降血糖作用的是顺式-SG富集的提取物，而另两个则没有。由于两种提取物 之间的唯一差别是顺式-SG的水平，该数据强烈支持其可能的抗糖尿病作用。但是在这一 点上，不明确该作用是来自顺式-SG还是顺式-SG和反式-SG之间的相互作用。
[0137] 纯反式-SG和顺式-SG在高脂饮食诱导的雄性CF-1小鼠种的抗糖尿病作用。纯的 反式-SG和顺式-SG在饮用水种浓度为0. 01 %，咖啡因被用作对照。图18 12周高脂肪饮 食后小鼠血清葡萄糖水平；图19 12周高脂肪饮食后小鼠血清胰岛素水平；图20反式-SG 和顺式-SG对雄性CF-1小鼠的葡萄糖耐受性的影响；图21反式-SG和顺式-SG对从Η0ΜΑ 模型近似胰岛素抵抗（IR)的影响。计算是基于以下方程：H0MA-IR=葡萄糖*胰岛素/405， 并使用空腹血糖和空腹胰岛素水平。
[0138] 从图16,我们可以看到，两种SG都可以显著降低高脂肪饮食12周后雄性的CF-1 小鼠的血糖水平，但在改善葡萄糖耐受不良方面，顺式SG很有效而反式-SG没有任何效果。 对于血清胰岛素，高脂小鼠和对照组相比水平更高，而所有治疗组中的的胰岛素水平都降 低了。所以，当我们用方程H0MA-IR=葡萄糖*胰岛素/405计算H0MA-IR后，胰岛素抵抗 在糖尿病对照组中大大提高了，但在顺式-SG和反式-SG中都有缓解。顺式-SG再次表现 出比反式-SG更好的效果。
[0139] 图22PEPCKmRNA用β-肌动蛋白标准化后的表达。!fepG2细胞用500nM的地塞米 松和0.lmM8-CTP的cAMP(地塞米松-cAMP)处理8小时诱导PEPCK基因表达，同时用5ηΜ 反式-SG或顺式-SG处理。（Α)实时荧光定量PCR测定不同浓度的顺式和反式SG对PEPCK mRNA表达的影响；(B)比较CT法得到的结果。
[0140] 实时PCR技术，也称为定量PCR或定量PCR，为确定靶序列或基因的存在量提供了 一个简单而优雅的方式。PEPCK测定法使用肝Η印G2细胞，并且实时PCR得到的PEPCKmRNA 表达水平用β-肌动蛋白进行标准化。地塞米松/cAMP可诱导PEPCK基因的转录，顺式SG 和反式-SG均可以有效地抑制该转录的上调，然而没有发现剂量依赖。这和比较Ct法的结 果符合。顺式SG持续性地呈现出比反式SG更好的效果。
[0141] 4.结论
[0142] 到目前为止，成功地证实了PM提取物的降血糖作用，并建议该机制是通过维持β 细胞的功能；负责这种效果的成分是顺式-SG。使用KKCgAy/J雌性转基因2型糖尿病模 型小鼠，我们评估了从大孔树脂柱PM根提取物中40 %树脂分馏的抗糖尿病作用，发现糖尿 病小鼠的高血糖症在用PM提取物治疗后被顺利抑制，这表明其在2型糖尿病中有显著的降 血糖作用。为了找出该作用机制，我们首先通过测定促炎细胞因子和胰岛素信号通路的标 记水平研究了PM提取物对胰岛素抵抗的作用；然而，我们的实验结果以及从HOMA模型近似 结果来看，认为该效果不是通过抗胰岛素介导的。
[0143] 另一方面，PM组小鼠的血清胰岛素水平显著增加，因此我们提出，刺激胰岛素分 泌的胰腺β细胞起着降低糖尿病小鼠的血糖值的关键作用。我们首先使用相同的动物模 型和实验设计排除了（反式）SG，它是ΡΜ提取物中的主要峰也是主要活性化合物。我们还 发现，SG(反式）可被紫外光诱导至顺式-SG，继而用制备HPLC纯化顺式-SG，并用NMR和 LC-MS鉴定其结构。为了探索顺式SG的抗糖尿病作用，我们测试了纯的反式-SG，主要成分 为反式-SG的提取物和含顺式-SG和反式-SG的提取物，发现最后一组提取物有显著的降 血糖作用。此外，用CF-1雄性小鼠的另一个动物研究和Η印G2细胞培养的PEPCK测试法都 得出了与顺式-SG有比反式-SG更强的抗糖尿病作用的结论。我们的研究表明，ΡΜ提取物 作为抗糖尿病药具有很大的潜力，也表明我们可以通过诱导反式SG异构为顺式以获得更 大的活性。
[0144] 我们用ELISA和Westernblot探索了此种降血糖效果的可能机制，并建议此作用 是通过维持β细胞功能达到的。
[0145] 使用同样的动物模型评估了提取物中的主要峰，也是ΡΜ提取物中主要的活性化 合物，反式-2, 3, 5,4'-四羟基-2-0-β-吡喃葡糖苷（反式-SG)，没有发现降糖作用。在 探索有效的化合物的过程中，我们在ΡΜ提取物中发现了顺式-SG，并用紫外光诱导了从反 式-SG到顺式-SG的异构。在高脂肪诱导的2型糖尿病小鼠模型中，含顺式-SG和反式-SG 2:3比例的ΡΜ粗提取物表现出显著降血糖的能力，而纯的反式SG和1:20比例的粗提物则 没有此效果。另外高脂肪诱导2型糖尿病雄性CF-1小鼠证实，纯的顺式-SG具有比反式-SG 更强的抗糖尿病作用。同样的结论也在IfepG2细胞中得到，因为顺式-SG具有比反式-SG 在抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)的基因表达更强的活性。
【主权项】
1. 一种治疗糖尿病的活性物质，其特征在于，所述活性物质为二苯乙烯苷。2. 如权利要求1所述活性物质，其特征在于，所述二苯乙烯苷为顺式二苯乙烯苷和反 式二苯乙烯苷的混合物。3. 如权利要求2所述治疗糖尿病的活性物质，其特征在于，所述二苯乙烯苷为何首乌 提取得到的顺式二苯乙烯苷和反式二苯乙烯苷的混合物。4. 如权利要求3所述治疗糖尿病的活性物质，其特征在于，所述反式二苯乙烯苷和顺 式二苯乙烯苷的重量百分比比为0~99% :100%~1%。5. 如权利要求4所述活性物质，其特征在于，所述顺式二苯乙烯苷是由反式二苯乙烯 苷通过紫外诱导而得。6. 制备如权利要求1-5中任意一项所述活性物质的方法，其特征在于， A、 所述反式二苯乙烯苷的制备： 先将何首乌的干根粉碎，在室温下放置2天； 接着用乙醇提取；植物材料滤出后，将乙醇萃取液合并，并用旋转蒸发器减压浓缩；所 述乙醇的体积百分百浓度为60%，何首乌干根粉与乙醇的固液比为1:10 ; 再将所得到的干提取物用填充有孔树脂的开柱层析进行分离，乙醇逐步洗脱，得到含 水乙醇馏分在减压下用旋转蒸发器浓缩，得到的粉末； 最后用HPLC对二苯乙烯苷进行量化提取得到反式二苯乙烯苷； B、 顺式二苯乙烯苷的制备： 将步骤A制得的所述反式二苯乙烯苷溶解在水中，放置在紫外光下照射0. 5~24小 时，制得纯顺式二苯乙烯苷；其中所述紫外光的波长为200~450nm。7. 如权利要求6所述活性物质的制备方法，其特征在于，顺式二苯乙烯苷的制备中，先 将步骤A制得的所述反式二苯乙烯苷溶解在水中，放置在紫外光下过夜；然后将溶液浓缩 过滤后用制备性HPLC对溶液进行分离；接着用HYPERSIL-Cls柱洗脱，合并浓缩、冷冻干燥机 干燥制得纯顺式二苯乙烯苷； 所述用HYPERSIL-Cls柱洗脱的条件是流动相的梯度为15分钟内，乙腈浓度从40%升 至65 %，流速保持在8毫升/分钟。8. -种治疗糖尿病的药物，其特征在于，含有权利要求1-8中任意一项所述的活性物 质。9. 如权利要求9所述治疗糖尿病的药物，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。10. -种保健品，其特征在于，含有权利要求1-8中任意一项所述的活性物质。
【专利摘要】本发明属于药物技术领域，具体涉及一种治疗糖尿病的活性物质及其制备方法和药物，特别是2型糖尿病。本发明活性物质为PM提取物二苯乙烯苷，更优为顺式二苯乙烯苷和反式二苯乙烯苷的混合物。在高脂肪诱导的2型糖尿病小鼠模型中，含顺式-SG和反式-SG的PM粗提取物表现出显著降血糖能力。
【IPC分类】A61K31/7034, A23L33/00, C07H1/08, A61P3/10, C07H15/203
【公开号】CN105362282
【申请号】CN201510439787
【发明人】李士明
【申请人】黄冈师范学院
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年7月23日