鉴别药物急性过敏反应类型的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物临床前安全性评价和检测技术领域，具体涉及一种药物致敏性的 鉴别方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 药物急性过敏反应（acute hypersensitive reaction)是临床常见的药物不良反 应，主要表现为过敏性休克、过敏性哮喘或呼吸困难W及皮疹等其他过敏反应。
[0003] 急性过敏反应中的主要类型是I型过敏反应。I型过敏反应是机体首次接触抗原 后产生相应抗体，当机体再次接触该抗原后触发的一种快速的异常或病理性免疫反应，属 I姐介导的抗原特异性免疫反应。I型过敏反应的发生是一个相对复杂的过程，大致分成 H个阶段；（1)致敏阶段：机体接触抗原诱使B细胞产生抗体应答，分泌的大量抗体（I姐） 与组织或粘膜的肥大细胞（Mast cell, MC)、血液的嗜碱性粒细胞的Fc e RI受体交联；（2) 激发阶段：当抗原再一次进入机体时，通过与致敏的MC或嗜碱性粒细胞表面特异性抗体结 合，致使细胞脱颗粒释放如组胺、目-氨基己糖巧酶、类膜蛋白酶、前列腺素、白H帰等生物 活性物质；（3)效应阶段;MC或嗜碱性粒细胞脱颗粒释放的组胺等生物活性物质作用于血 管、平滑肌等组织或器官，引起组织或全身水平的过敏反应。
[0004] 然而人们发现，许多临床所使用的药物既不是抗原也不是半抗原，送些药物进入 人体内，不经过潜伏期，无抗原与抗体的结合过程，迅速发生与I型过敏反应相同的临床表 现。由于送种反应只发生于极少数接受治疗剂量药物的个体，没有致敏过程，患者血清I姐 浓度也未见升高，但表现为典型的速发性过敏反应症状，因此Dukor称之为假药物过敏反 应或类过敏反应（anaphylactoid reactions)。目前，对类过敏反应在过敏反应中的定位仍 未明确，但研究者们趋向于认为它和I型过敏反应为急性过敏反应的两个亚类。
[0005] 药物I型过敏反应和类过敏反应是临床上注射剂最常见并可造成休克或死亡等 严重后果的不良反应。有研究显示，77%的药物急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发 生率远高于I型过敏反应。但在临床不良反应申报和处理上，常常将"类过敏反应"与"过 敏反应"相混淆。由于I型过敏反应和类过敏反应临床症状类似而发生过程和机制不同， 其应激处理对策等亦存在很大差别，故而鉴别和检测药物的致过敏/类过敏性具有重要意 义。
[0006] 关于药物过敏反应的检测，目前S抑A推荐使用豚鼠主动全身过敏试验和大鼠被 动皮肤过敏试验，前者评价指标为豚鼠全身过敏反应症状，如皮肤瘦痒、过敏性皮疹、黏膜 水肿、高热、呼吸困难、休克死亡等；后者评价指标为大鼠皮肤藍染直径或藍染OD值（国家 食品药品监督管理局，中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原 则，2005, P15-28)。
[0007] 关于药物类过敏反应的检测，抑A在其相关的指导原则（抑A. Guidance化r Industry-Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs, 2002)中对类 过敏反应的建议是"当动物实验出现类过敏症状时，应进行进一步研究，W区分I姐介导的 过敏反应"。但迄今，包括经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)在内尚未制定相关的技术指南对类过敏试验给予规范和指导。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的旨在提供一种鉴别药物引起的急性过敏反应类型的方法及其试剂 盒。
[0009] 具体地说，本发明的第一方面是提供了一种鉴别药物引起的急性过敏反应类型的 方法，包括W下步骤：
[0010] 单次给药的步骤，即给实验动物单次注射合适剂量的受试药物，在注射完毕后的 0~60min内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类膜蛋白酶和I姐的 含量；
[0011] 多次给药的步骤，即给实验动物隔日注射合适剂量的受试药物3~5次，在注射完 毕后的4~28天内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类膜蛋白酶和 I姐的含量；
[0012] 分析判定的步骤，即根据上述步骤中测得的实验动物体内活性物质、类膜蛋白酶 和I姐的含量变化判定受试药物在实验动物体内引起急性过敏反应的类型；
[0013] 其中，所述合适剂量为所述受试药物的说明书所推荐的人临床使用最高剂量的 (0. 5~4) n倍，所述n为W体表面积折算的动物与人的等效剂量比；
[0014] 所述活性物质选自组胺或目-氨基己糖巧酶；且
[0015] 所述急性过敏反应包括I型过敏反应和类过敏反应。
[0016] 在一优选例中，所述实验动物为大鼠、小鼠或豚鼠。
[0017] 在一优选例中，所述合适剂量为所述受试药物的说明书所推荐的人临床使用最高 剂量的（1~2) n倍。
[0018] 在一优选例中，所述单次给药步骤中取实验动物的全血制备血清或血浆是在其单 次注射完毕后的10~30min内。
[0019] 在一优选例中，所述多次给药步骤中取实验动物的全血制备血清或血浆是在其隔 日注射完毕后的7~14天内。
[0020] 在一优选例中，所述分析判定步骤包括将测得的实验动物体内活性物质、类膜蛋 白酶和I姐的含量与对照组动物体内活性物质、类膜蛋白酶和I姐的含量进行比较，并根据 如下标准判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类型：
[0021]
[0022] 注；t (含量升高）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量> 1.5,类膜蛋白酶含量> 1.2, I姐含量> 2 ;
[0023] I (含量下降）；给药组与对照组之比：类膜蛋白酶含量《0. 8, I姐含量《0. 8 ;
[0024] ±(含量无变化）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量< 1.5,类膜蛋白酶含量< 1.2且> 0.8, I姐含量< 2且> 0.8 ; [002引 +;反应阳性；一；反应阴性；
[0026] 情况 A :
[0027] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0028] 多次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶含量均无变化；
[0029] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性；
[0030] 情况 B :
[0031] 单次给药；活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶含量下降， 且I姐含量无变化或含量下降；
[0032] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0033] 同时满足上述两项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性；
[0034] 情况 C :
[0035] 单次给药；活性物质含量升高，且I姐含量无变化，类膜蛋白酶含量或升高或下降 或无变化。
[0036] 多次给药；活性物质含量升高或含量无变化，且I姐含量升高，类膜蛋白酶含量或 升高或下降或无变化；
[0037] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性；
[0038] 情况 D :
[0039] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0040] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0041] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性；
[0042] 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。
[0043] 在一优选例中，在所述方法之分析判定步骤前还包括一多次给药加再次给药的步 骤，即在给实验动物隔日注射合适剂量的受试药物3~5次完毕后的4~28天内，给其再次 注射合适剂量的受试药物，在再次注射完毕后的0~60min内，取其全血制备血清或血浆， 检测其中活性物质、类膜蛋白酶和I姐的含量。
[0044] 在一优选例中，所述给实验动物再次注射合适剂量的受试药物是在给其隔日注射 合适剂量的受试药物3~5次完毕后的7~14天内。
[0045] 在一优选例中，所述取实验动物全血制备血清或血浆是在给所述实验动物再次注 射完毕后的10~30min内。
[0046] 在一优选例中，所述分析判定步骤包括将测得的实验动物体内活性物质、类膜蛋 白酶和I姐的含量与对照组动物体内活性物质、类膜蛋白酶和I姐的含量进行比较，并根据 如下标准判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类型：
[0049] 注；t (含量升高）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量> 1.5,类膜蛋白酶含量> 1.2, I姐含量> 2 ;
[0050] i (含量下降）繪药组与对照组之比：类膜蛋白酶含量《0. 8, I姐含量《0. 8 ;
[0051] ± (含量无变化）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量< 1.5,类膜蛋白酶含量< 1.2且> 0.8, I姐含量< 2且> 0.8 ; [005引 +;反应阳性；一;反应阴性；
[0053] 情况 A :
[0054] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0055] 多次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶含量均无变化；
[0056] 多次给药加再次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量 升高；
[0057] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性；
[0058] 情况 B :
[0059] 单次给药；活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶含量下降， 且I姐含量无变化或含量下降；
[0060] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0061] 多次给药加再次给药：活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶 含量下降，且I姐含量无变化或含量下降；
[0062] 同时满足上述H项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性；
[0063] 情况 C :
[0064] 单次给药；活性物质含量升高，且I姐含量无变化，类膜蛋白酶含量或升高或下降 或无变化。
[0065] 多次给药；活性物质含量升高或含量无变化，且I姐含量升高，类膜蛋白酶含量或 升高或下降或无变化；
[0066] 多次给药加再次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量 升局；
[0067] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性；
[0068] 情况 D :
[0069] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0070] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0071] 多次给药加再次给药：活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0072] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性；
[0073] 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。
[0074] 本发明的第二方面是提供了一种应用上述方法的药物致敏性鉴别试剂盒，所述试 剂盒包括：
[00巧](a)检测实验动物体内活性物质含量的试剂，所述活性物质选自组胺或目-氨基 己糖巧酶；
[0076] 化）检测实验动物体内类膜蛋白酶含量的试剂；
[0077] (C)检测实验动物体内I姐含量的试剂；和
[0078] (d)使用说明书，所述使用说明书上记载了如下用于判定受试药物在实验动物体 内引起的急性过敏反应的类型的标准：
[0079]
[0081] 注；t (含量升高）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量>2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量> 1.5,类膜蛋白酶含量> 1.2, I姐含量> 2 ;
[0082] I (含量下降）；给药组与对照组之比：类膜蛋白酶含量《0. 8, I姐含量《0. 8 ;
[0083] ±(含量无变化）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量< 1.5,类膜蛋白酶含量< 1.2且> 0.8, I姐含量< 2且> 0.8 ;
[0084] +;反应阳性；一;反应阴性；
[0085] 情况 A :
[0086] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0087] 多次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶含量均无变化；
[0088] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性；
[0089] 情况 B :
[0090] 单次给药；活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶含量下降， 且I姐含量无变化或含量下降；
[0091] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0092] 同时满足上述两项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性；
[0093] 情况 C :
[0094] 单次给药；活性物质含量升高，且I姐含量无变化，类膜蛋白酶含量或升高或下降 或无变化。
[0095] 多次给药；活性物质含量升高或含量无变化，且I姐含量升高，类膜蛋白酶含量或 升高或下降或无变化；
[0096] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性；
[0097] 情况 D :
[0098] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0099] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0100] 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性；
[0101] 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。
[0102] 在一优选例中，所述实验动物为大鼠、小鼠或豚鼠。
[0103] 在一优选例中，所述使用说明书上记载的判定标准为：
[0106] 注；t (含量升高）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量>2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量> 1.5,类膜蛋白酶含量> 1.2, I姐含量> 2 ;
[0107] I (含量下降）；给药组与对照组之比：类膜蛋白酶含量《0. 8, I姐含量《0. 8 ;
[0108] ± (含量无变化）；给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质 目-氨基己糖巧酶含量< 1.5,类膜蛋白酶含量< 1.2且> 0.8, I姐含量< 2且> 0.8 ; [010引 +;反应阳性；一；反应阴性；
[0110] 情况 A:
[0111] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0112] 多次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶含量均无变化；
[0113] 多次给药加再次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量 升局；
[0114] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性；
[0115] 情况 B:
[0116] 单次给药；活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶含量下降， 且I姐含量无变化或含量下降；
[0117] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0118] 多次给药加再次给药：活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量升高或类膜蛋白酶 含量下降，且I姐含量无变化或含量下降；
[0119] 同时满足上述H项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性；
[0120] 情况 C:
[0121] 单次给药；活性物质含量升高，且I姐含量无变化，类膜蛋白酶含量或升高或下降 或无变化。
[0122] 多次给药；活性物质含量升高或含量无变化，且I姐含量升高，类膜蛋白酶含量或 升高或下降或无变化；
[0123] 多次给药加再次给药；1姐含量升高，且活性物质和类膜蛋白酶中至少一个含量 升高；
[0124] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性；
[0125] 情况 D:
[0126] 单次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0127] 多次给药；活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[012引多次给药加再次给药：活性物质、类膜蛋白酶和I姐含量均无变化；
[0129] 同时满足上述H项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性；
[0130] 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。
[0131] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得W详尽描述。通过下文W及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【具体实施方式】
[0132] 本发明人通过对动物的I型过敏与类过敏反应特征的比较研究，发现喃齿类动物 I型过敏或类过敏反应不仅有其共性特征，其异性特征也相当明显，包括非损伤性的血液 指标。进而，本发明人从药物过敏反应的致敏、激发和效应H个阶段W及药物类过敏反应的 刺激、效应两个阶段着手，W单次或多次给药后抗体分泌水平、组胺等活性物质的释放浓度 等模拟全身过敏或类过敏反应的体内动态过程，W血液中过敏或类过敏反应共性和异性的 生物标志物的水平变化作为检测指标，对受试药物的致过敏性或致类过敏性进行了综合评 定，并W经典模型和整体动物过敏或类过敏反应效应对本发明的方法进行了可靠性验证。
[0133] 喃齿类动物全身类过敏试验模型和检测方法的建立
[0134] 在摸索可用于鉴别药物引起的急性过敏反应类型的检测方法的过程中，本发明人 首先尝试建立喃齿类动物全身类过敏试验模型W建立一种检测药物致类过敏性的方法。本 发明人W类过敏反应症状作为金指标，通过大量实践总结和分析后，划分出喃齿类动物类 过敏反应症状表（见下表1)，模拟出能评定类过敏反应强度的类过敏反应症状强度系数及 其计算公式。同时，选用如C48/80、Tween-80(聚山梨醋-80)等类过敏阳性反应药物，检测 了由其引起类过敏反应小鼠或大鼠血液中类过敏反应生物标志物的水平，分析了症状强度 系数与血液生物标志物水平的相关性，在此基础上，选用造影剂及中药注射剂对模型的适 用性进行了评价，最后W小鼠耳廓血管通透性试验模型为对照，证实本发明的方法对于检 测静脉注射类药物的致类过敏性具有极高的灵敏度和可靠度，且具有操作简单、实验周期 短、检测重现性好和结果贴近临床等诸多优点。
[0135] 具体而言，本发明人首先是公开了一种检测药物的致类过敏性的方法，即W实验 动物为受试对象，通过静脉注射给予不同剂量的受试药物，观察用药后一定时间内实验动 物所表现的类过敏反应症状，根据症状严重程度将类过敏反应症状分成不同类过敏反应症 状等级，按照强度系数公式计算类过敏反应症状强度系数，得出不同剂量的受试药物的致 全身类过敏反应强度等级。
[0136] 优选的，所述实验动物的类过敏反应症状包括活动减少，竖毛，发抖，搔鼻，搔耳， 呼吸急促，口鼻肿胀，流泪，呼吸困难，步态不稳，跳跃，疫李，旋转，W及死亡。更优选的，所 述根据症状严重程度将类过敏反应症状分成不同类过敏反应症状等级具体为，将实验动物 的类过敏反应症状按照严重程度划分为五个等级：
[0137] 第一等级包括前述活动减少，竖毛，发抖，搔鼻，W及搔耳的症状一种或多种；
[013引第二等级包括前述呼吸急促，口鼻肿胀，W及流泪的症状一种或多种；
[0139] 第H等级包括前述呼吸困难，步态不稳，跳跃，疫李，W及旋转的症状一种或多 种；
[0140] 第四等级的症状为死亡；
[0141] 零等级即无前述的任何一种症状，属无类过敏反应症状的正常动物。
[0142] 按症状等级对实验动物进行打分，症状分值为：仅出现第一等级症状者为1分；仅 出现第二等级症状者，或者出现第二等级并且也同时出现第一等级症状者为2分；仅出现 第H等级症状者，或者出现第H等级症状并且也同时出现第一等级和/或第二等级症状者 为3分；仅出现第四等级症状者，或者出现第四等级症状并且也同时出现第一等级、第二等 级和/或第H等级症状者为4分；未出现第一、第二、第H、第四等级症状中的任何一种症状 的零等级者为0分。具体见下表1。
[0143] 表1类过敏反应症状评价标准
[0146] 即动物的类过敏反应症状的分值W每只动物出现的类过敏反应症状的最高等级 为评定标准。例如，如果动物既出现活动减少（第一等级症状），又出现口鼻肿胀（第二等 级症状），郝么该动物的症状分值为2分。
[0147] 优选的，所述类过敏反应症状强度系数W K表示，其计算公式如下：
[0148] 类过敏反应症状强度系数，其计算公式：