[0629] 表40和表44显示；血液目-氨基己糖巧酶水平与各过敏阳性物质过敏反应症状 表现之间的关系同血液组胺。
[0630] 4. 4.血液类膜蛋白酶水平：
[0631] 表41和表45显示；血液类膜蛋白酶水平与各过敏阳性物质过敏反应症状表现之 间的关系亦同血液组胺。
[0632] 4. 5.血液I姐水平：
[0633] 表42和表46显示：致敏期末；不加佐剂0VA、BSA、TCS组、加佐剂0VA、BSA组大鼠 血液（PCA抗体血清）I姐水平均呈显著升高（P<0. 05或P<0. 01)。激发后30min ;不加佐剂 0VA、BSA组大鼠血液（ASA血清）I姐水平仍呈显著升高状态，加佐剂的动物均死亡，可能为 加佐剂导致血液I姐水平升高过甚导致由I姐介导的肥大细胞脱颗粒过强所致。
[0634] 4. 6. PCA藍斑直径和藍染OD值：
[063引表47、表48显示；不同稀释比例的不同阳性药物抗体血清对同种PCA大鼠皮肤藍 染OD值或藍斑直径大小均呈明显的"量-效"关系，而同种PCA大鼠皮肤藍染OD值或藍斑 直径大小又与不同过敏阳性药物大鼠抗体血清中I姐水平高低呈高度相关，提示：同种PCA 大鼠皮肤藍染OD值或藍斑直径大小与阳性药物抗体血清中I姐水平高度相关，即阳性药物 抗体血清中I姐水平决定了同种PCA大鼠皮肤藍染OD值或藍斑直径大小。
[0636] 结合ASA试验结果，经综合分析后认为：在阳性过敏物质致敏期末，大鼠血液（PCA 抗体血清）和组织呈高度敏感状态，表现为血液I姐水平大大上升，但无表观过敏症状表 现；阳性药物激发后，大鼠血液（ASA血清）、组织W及整体均呈现爆发性的过敏反应状态， 表现为脱颗粒成分如血液组胺、目-氨基己糖巧酶、类膜蛋白酶等水平均急剧升高，I姐水 平与激发前（抗体血清）比，变化不大或有所下降，表观过敏症状表现明显，甚而发生动物 死亡。PCA抗体血清和ASA血清的指标变化与动物各自所处的高敏感状态或发生爆发性过 敏反应症状的临床表现完全吻合。
[0637] 实验提示；只有当受试动物致敏期末的血清I姐水平升高时，尾静脉注射阳性药 物才能使动物在整体水平出现全身过敏反应（ASA试验）；只有将含有特异高I姐水平的受 试物抗体血清注入动物皮下，才能出现皮肤藍染斑块（PCA试验）。过敏性试验（ASA和PCA) 检测药物过敏性的关键指标无疑为在致敏期末的血清I姐水平。
[063引实施例8使用注射类药物过敏性检测试剂盒对中药注射剂过敏性的检测和评价
[0639] 1实验材料
[0640] 1. 1.实验动物
[0641] 同实施例7。
[0642] 1.2.药品及主要试剂
[064引喜炎平注射液（简称喜炎平。江西青峰药业药业有限公司，批号2013032103);注 射用双黄连（冻干）（简称双黄连。哈药集团中药二厂，批号1302008) ;0VA =Sigma产品，批 号D册15 - 4,购于北京鼎国生物技术有限责任公司；伊文思藍；批号WC20080125 ;组胺试 剂盒（Histamine EIA，Demeditec, 12743);大鼠 I姐试剂盒（Rat I姐 Elisa Kit, E-2祀， 10);目-己糖巧酶（Si卵日，SLBB4917V);膜蛋白酶（Si卵日，101M7013V) ;BAPNA(Si卵日， BCBG8835V)0
[0644] 1. 3.药品及主要试剂配制
[0645] 喜炎平：①喜炎平致敏液；抽取喜炎平原液与Al (OH) 3凝胶佐剂按体积1 ;1混合而 成；②喜炎平激发液：即抽取喜炎平原液与NS按体积1 ;1混合而成。
[0646] 双黄连：①双黄连致敏液；称取双黄连加生理盐水配成300mg/ml浓度，与Al (OH) 3 凝胶佐剂按体积1 ;1混合而成；②双黄连激发液；称取双黄连加生理盐水配成150mg/ml浓 度。
[0647] Al (OH) 3凝胶佐剂（alum)配制：称取1. 7g无水AlCls缓慢加入25ml蒸傭水中，不 断揽拌使其溶解，在不断揽拌下缓慢滴加 lOmol/L化OH溶液，使之形成絮状沉淀，调PH值 至8~9,终浓度为4%。
[0648] OVA ;① OVA致敏液：称取OVA加生理盐水配成20mg/ml浓度，与Al (OH) 3凝胶佐剂 按体积1 ;1混合而成；②OVA激发液：称取OVA加生理盐水配成lOmg/ml浓度。
[0649] NS =NS致敏液和激发液；量取生理盐水，与Al (0H)3凝胶佐剂按体积1 ;1混合而 成。
[0650] 伊文思藍；取适量伊文思藍加生理盐水配成I %浓度。
[0651] 1.4.主要仪器
[0652] 同实施例1。
[0653] 2实验方法
[0654] 取Wistar大鼠70只，称重，随机分为空白组、溶剂组、喜炎平组、双黄连组、阳性药 组共5组，每组14只。空白组给予等容量NS,溶剂组给予NS致敏液，喜炎平和双黄连组分 别给予喜炎平和双黄连致敏液，阳性药组给予OVA致敏液，致敏体积为0. 5ml/只。其中， 致敏给药方式均为皮下注射，隔日一次，共给3次。末次致敏后第14天，每组随机等分成2 批，每批每组动物7只。第一批分别尾静脉注射各对应药物的激发液0. 5ml/只，激发后观察 和记录30分钟内的症状变化，按照大鼠致敏性评价标准对大鼠过敏性进行评价，并作为评 判标准，30分钟后，W 25 %乌拉坦Ig/kg对动物实施腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，350化/ min,离必lOmin，分离血清，分装于EP管中，一2(TC保存备用。第二批致敏11天但未激发 的动物同样W 25%乌拉坦Ig/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血制备抗体血清。次日，使用 注射类药物过敏性检测试剂盒对2批血清样本的组胺、目-氨基己糖巧酶、类膜蛋白酶、I姐 等指标进行检测，并行统计学处理和分析。统计方法同实施例1。
[0655] 3实验结果
[0656] 3. 1.中药注射剂血液指标水平的变化
[0657] 第一批动物血清（致敏期末的抗体血清）检测结果显示：双黄连、OVA组I姐水平 显著提高（P<〇. 01)，喜炎平、双黄连、OVA组组胺、目-氨基己糖巧酶和类膜蛋白酶水平均无 明显变化（P>〇. 05);第二批动物血清（激发后血清）检测结果显示；0VA、双黄连动物血清 中的组胺、目-氨基己糖巧酶、类膜蛋白酶和I姐水平有所提高，其中组胺、目-氨基己糖巧 酶和I姐水平与NS组比差异显著（P<0. 05或P<0. 01)，喜炎平组组胺、目-氨基己糖巧酶、 类膜蛋白酶和I姐水平均无明显变化（P > 0. 05)。见表49-52。
[065引表49中药注射剂PCA抗体血清与ASA激发血清中组胺水平的变化（n = 7)
[066"注：与 NS 组比；冲<0. 05, *冲<0.0 l ;与 NS+alum 组比：? P<0. 05, ? ? P<0.0 l
[0662] 表50中药注射剂PCA抗体血清与ASA激发血清中目-氨基己糖巧酶水平的变化 (為8, n = 7)
[0664] 注：与 NS 组比；冲<0. 05, *冲<0.0 l ;与 NS+alum 组比：? P<0. 05, ? ? P<0.0 l
[0665] 表51中药注射剂PCA抗体血清与ASA激发血清中类膜蛋白酶水平的变化（x±s， n = 7)
[0667]注：与 NS 组比；冲<0. 05, *冲<0.0 l ;与 NS+alum 组比：? P<0. 05, ? ? P<0.0 l [066引表52中药注射剂PCA抗体血清与ASA激发血清中I姐水平的变化（n = 7)
[067"注：与 NS 组比；冲<0. 05, *冲<0.0 l ;与 NS+alum 组比：? P<0. 05, ? ? P<0.0 l
[0672] 3. 2.中药注射剂ASA全身症状表现
[0673] 静脉注射过敏阳性药0VA，中药注射剂喜炎平和双黄连，ASA试验结果显示，喜炎 平过敏反应为阴性，双黄连过敏反应为强阳性。见表53。
[0674] 表53中药注射剂ASA试验大鼠全身症状表现（I±s，n = 7)
[067引 4实验小结
[0677] 使用注射类药物过敏性检测试剂盒对中药注射剂喜炎平和双黄连致敏期末的抗 体血清和激发后血清进行检测，结果显示；双黄连致敏期末的抗体血清I姐水平、激发后血 清中的组胺、目-氨基己糖巧酶、I姐等水平均大帖提局，提W其具有明显的过敏性；而喜炎 平两批血清组胺、目-氨基己糖巧酶、类膜蛋白酶和I姐水平均未发生明显变化，提示其过 敏反应阴性。此检验结果与中药注射剂喜炎平和双黄连ASA试验结果相一致。
[067引本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神 之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请 所附权利要求的覆盖范围。
【主权项】
1. 一种鉴别药物引起的急性过敏反应类型的方法，包括以下步骤： 单次给药的步骤，即给实验动物单次注射合适剂量的受试药物，在注射完毕后的O~ 60min内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含 量； 多次给药的步骤，即给实验动物隔日注射合适剂量的受试药物3~5次，在注射完毕后 的4~28天内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类胰蛋白酶和IgE 的含量； 分析判定的步骤，即根据上述步骤中测得的实验动物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE 的含量变化判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类型； 其中，所述合适剂量为所述受试药物的说明书所推荐的人临床使用最高剂量的 (0. 5~4) η倍，所述η为以体表面积折算的动物与人的等效剂量比； 所述活性物质选自组胺或β-氨基己糖苷酶；且 所述急性过敏反应包括I型过敏反应和类过敏反应。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实验动物为大鼠、小鼠或豚鼠。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合适剂量为所述受试药物的说明书 所推荐的人临床使用最高剂量的（1~2)n倍。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单次给药步骤中取实验动物的全血 制备血清或血浆是在其单次注射完毕后的10~30min内。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多次给药步骤中取实验动物的全血 制备血清或血浆是在其多次注射完毕后的7~14天内。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析判定步骤包括将测得的实验动 物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量与对照组动物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE 的含量进行比较，并根据如下标准判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类 型：注：丨（含量升高）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质β -氨 基己糖苷酶含量> 1. 5,类胰蛋白酶含量> 1. 2, IgE含量彡2 ; I (含量下降）：给药组与对照组之比：类胰蛋白酶含量彡〇. 8, IgE含量彡0. 8 ; ± (含量无变化）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质β -氨基 己糖苷酶含量< 1. 5,类胰蛋白酶含量< 1. 2且> 0. 8, IgE含量< 2且> 0. 8 ; + :反应阳性；一：反应阴性； 情况Α: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性； 情况B : 单次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量下降，且 IgE含量无变化或含量下降； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性； 情况C : 单次给药：活性物质含量升高，且IgE含量无变化，类胰蛋白酶含量或升高或下降或无 变化。 多次给药：活性物质含量升高或含量无变化，且IgE含量升高，类胰蛋白酶含量或升高 或下降或无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性； 情况D: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性； 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法之分析判定步骤前还包括一 多次给药加再次给药的步骤，即在给实验动物隔日注射合适剂量的受试药物3~5次完毕 后的4~28天内，给其再次注射合适剂量的受试药物，在再次注射完毕后的0~60min内， 取其全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述给实验动物再次注射合适剂量的受 试药物是在给其隔日注射合适剂量的受试药物3~5次完毕后的7~14天内。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述取实验动物全血制备血清或血浆是 在给所述实验动物再次注射完毕后的30~60min内。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析判定步骤包括将测得的实验动 物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量与对照组动物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE 的含量进行比较，并根据如下标准判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类 型：注：丨（含量升高）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质β -氨 基己糖苷酶含量> 1. 5,类胰蛋白酶含量> 1. 2, IgE含量彡2 ; I (含量下降）：给药组与对照组之比：类胰蛋白酶含量彡〇. 8, IgE含量彡0. 8 ; ± (含量无变化）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质β -氨基 己糖苷酶含量< 1. 5,类胰蛋白酶含量< 1. 2且> 0. 8, IgE含量< 2且> 0. 8 ; + :反应阳性；一：反应阴性； 情况Α: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶含量均无变化； 多次给药加再次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性； 情况B : 单次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量下降，且 IgE含量无变化或含量下降； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药加再次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量 下降，且IgE含量无变化或含量下降； 同时满足上述三项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性； 情况C: 单次给药：活性物质含量升高，且IgE含量无变化，类胰蛋白酶含量或升高或下降或无 变化。 多次给药：活性物质含量升高或含量无变化，且IgE含量升高，类胰蛋白酶含量或升高 或下降或无变化； 多次给药加再次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性； 情况D: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药加再次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性； 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。11. 一种应用如权利要求1或7所述方法的药物致敏性检测试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒包括： (a) 检测实验动物体内活性物质含量的试剂，所述活性物质选自组胺或β-氨基己糖 苷酶； (b) 检测实验动物体内类胰蛋白酶含量的试剂； (c) 检测实验动物体内IgE含量的试剂；和 (d) 使用说明书，所述使用说明书上记载了如下用于判定受试药物在实验动物体内引 起的急性过敏反应的类型的标准：注：丨（含量升高）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质β -氨 基己糖苷酶含量> 1. 5,类胰蛋白酶含量> 1. 2, IgE含量彡2 ; I (含量下降）：给药组与对照组之比：类胰蛋白酶含量彡〇. 8, IgE含量彡0. 8 ; ± (含量无变化）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质β -氨基 己糖苷酶含量< 1.5,类胰蛋白酶含量< 1.2且> 0.8, IgE含量< 2且> 0.8 ; + :反应阳性；一：反应阴性； 情况Α: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性； 情况B : 单次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量下降，且 IgE含量无变化或含量下降； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性； 情况C : 单次给药：活性物质含量升高，且IgE含量无变化，类胰蛋白酶含量或升高或下降或无 变化。 多次给药：活性物质含量升高或含量无变化，且IgE含量升高，类胰蛋白酶含量或升高 或下降或无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性； 情况D : 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述两项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性； 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述实验动物为大鼠、小鼠或豚鼠。13. 根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述使用说明书上记载的判定标准 为：注：丨（含量升高）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量> 2或活性物质β -氨 基己糖苷酶含量> 1. 5,类胰蛋白酶含量> 1. 2, IgE含量彡2 ; I (含量下降）：给药组与对照组之比：类胰蛋白酶含量彡〇. 8, IgE含量彡0. 8 ; ± (含量无变化）：给药组与对照组之比：活性物质组胺含量< 2或活性物质β -氨基 己糖苷酶含量< 1. 5,类胰蛋白酶含量< 1. 2且> 0. 8, IgE含量< 2且> 0. 8 ; + :反应阳性；一：反应阴性； 情况Α: 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶含量均无变化； 多次给药加再次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应阳性，类过敏反应阴性； 情况B : 单次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量下降，且 IgE含量无变化或含量下降； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药加再次给药：活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高或类胰蛋白酶含量 下降，且IgE含量无变化或含量下降； 同时满足上述三项条件者，判定为类过敏反应阳性，I型过敏反应阴性； 情况C : 单次给药：活性物质含量升高，且IgE含量无变化，类胰蛋白酶含量或升高或下降或无 变化。 多次给药：活性物质含量升高或含量无变化，且IgE含量升高，类胰蛋白酶含量或升高 或下降或无变化； 多次给药加再次给药=IgE含量升高，且活性物质和类胰蛋白酶中至少一个含量升高； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阳性； 情况D : 单次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 多次给药加再次给药：活性物质、类胰蛋白酶和IgE含量均无变化； 同时满足上述三项条件者，判定为I型过敏反应和类过敏反应双阴性； 所述对照组动物为注射等量受试药物溶剂的实验动物。
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别药物引起的急性过敏反应类型的方法，包括以下步骤：单次给药的步骤，即给实验动物单次注射合适剂量的受试药物，在注射完毕后的0～60？min内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量；多次给药的步骤，即给实验动物隔日注射合适剂量的受试药物3～5次，在注射完毕后的4～28天内，取实验动物的全血制备血清或血浆，检测其中活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量；分析判定的步骤，即根据上述步骤中测得的实验动物体内活性物质、类胰蛋白酶和IgE的含量变化判定受试药物在实验动物体内引起的急性过敏反应的类型；本发明还提供了应用上述方法的检测试剂盒。<!-- 2 -->
【IPC分类】G01N33/50, A61K49/00
【公开号】CN105477646
【申请号】CN201410476507
【发明人】谢家骏, 易娟娟, 康黎静, 赵琳
【申请人】上海中医药大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月18日