一种双靶向超声造影剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及超声造影剂技术领域，尤其涉及一种双靶向超声造影剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]传统的超声造影剂是以磷脂、白蛋白等膜材料包裹气体制备而成的微泡，这些含气微泡的粒径大小约数个微米，在体内具有与红细胞类似的特征，能够通过体循环及肺循环，在临床上多用以显示整个血池系统的分布及完整性。靶向超声造影剂与普通造影剂最显著的区别就是能够在分子水平上识别靶组织的特异性抗原表位，并与之牢固结合，最终使靶组织特异性显影。为了达到这一目的，就必须对造影剂进行靶向修饰。
[0003]目前国内外研究中较常用的方法主要有以下两种:
[0004]—种方法是，在造影剂外膜成分中加入对某一疾病特异性位点具有亲和力的成分，以达到革G向的目的。Christiansen JP等人将磷脂酰丝氨酸添加入微泡外膜成分中，使其能够革巴向附着炎症区域中活化的中型粒细胞及单核细胞(Christiansen JP,Leong-PoiHjKlibanov AL,et al.Noninvasive imaging of myocardial reperfus1n injuryusing leukocyte-targeted contrast echocard1graphy circulat1n 2002；105(15):1764-1767)。而刘学兵等人在造影剂膜成分中加入了硫酸脑苷脂，后者对肿瘤细胞外基质的糖蛋白有特殊亲和力，从而成功制备了一种针对肿瘤组织的靶向造影剂(刘学兵，王志刚，许川山，等.纳米级靶向超声造影剂的制备及对兔VX2肝肿瘤的显影试验.中国超声医学杂志，2009;25(1):5-8)。但是总体而言，这种修饰方式适用的靶点有限，并不能在临床上得到广泛应用。微泡与靶细胞并非特异性结合，势必影响其对疾病的诊断及治疗效果。
[0005]另一种方法是，运用针对某种疾病特异位点的配体(如抗体、肽等)对造影剂微泡外壳进行修饰。抗原-抗体的结合具有高度的特异性及亲和性，因此，只要找到感兴趣疾病的特征性位点，制备出高特异性及敏感性的革G向造影剂就成为可能。Lindner JR等通过生物素-抗生物素的桥接作用，使结合有抗P-选择素抗体的脂类微泡与活化白细胞表面的P选择素特异结合，提高微泡在炎症区域的滞留，从而对小鼠肾脏的缺血后炎症损伤进行早期检测(Lindner JR , Song J , Chri stiansen J , et al.Ultrasound assessment ofinflammat1n and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin.Circulat1n 2001 ； 104( 17): 2107-2112.) offeller GE等以细胞黏附分子-1(ICAM-1)为靶点制备出靶向造影剂应用于接受心脏移植的大鼠体内发现，植入组织配型不合心脏的大鼠超声图像上造影剂信号强度明显高于植入组织配型匹配心脏的大鼠(WellerGER,Lu E,Csikari MM,et al.Ultrasound imaging of acute cardiac transplantreject1n with microbubbles targeted to intercellular adhes1n molecule-1.Circulat1n 2003; 108(2): 218-224.)。这种方法虽然通过单克隆抗体等特异性配体的使用，能够实现微泡与靶细胞的特异性结合，但是由于单一靶点的设计，微泡在靶组织内很难达到理想浓度，从而影响其携带基因在靶组织内的浓度，进而影响后续的基因治疗。
[0006]综上所述，目前的靶向造影剂能够实现与靶细胞的特异性结合，但是单靶点设计的微泡只能与单一靶点结合，受血流剪切力的影响，单靶向微泡与靶组织往往不能紧密黏附，靶向能力低。这种缺陷在针对乳腺癌的造影剂中表现明显。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种双靶向超声造影剂及其制备方法，通过不同靶点的联合应用，可以有效提高造影剂的靶向效能，大幅提高其携带基因在靶组织的富集程度。
[0008]根据本发明的第一方面，本发明提供一种双靶向超声造影剂，该造影剂是IntegrincOVMCP-1双靶向微泡，该双靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，上述脂质外壳的外表面连接有Integr?ηανβ3(整合素ανβ3)单克隆抗体和MCP-1 (单核细胞趋化蛋白-1，Monocyte Chemotactic Protein I)单克隆抗体。
[0009]作为本发明的优选方案，上述脂质外壳包括DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)、Stearic-PEI600(硬脂酸支链聚醚酰亚胺-600)、DSPE-PEG2000-B1tin(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素)。更优选地，上述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin的摩尔比为7.5?9.5:0.1?1:0.4?1.5，最优选为8.5:0.5:1。
[0010]作为本发明的优选方案，上述气体内芯是全氟丙烷内芯。
[0011 ]作为本发明的优选方案，上述Integrinaj3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体为生物素化单克隆抗体;上述脂质外壳与上述单克隆抗体通过亲和素和生物素连接在一起。
[0012]作为本发明的优选方案，上述Integrinaj3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体的摩尔比为0.5?2:0.5?2，更优选为1:1。
[0013]作为本发明的进一步优选方案，上述脂质外壳包括DSPCX二硬脂酰磷脂酰胆碱)、Stearic-PEI600(硬脂酸支链聚醚酰亚胺-600)、DSPE-PEG2000-B1tin(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素)，上述气体内芯是全氟丙烷内芯，上述单克隆抗体是生物素化单克隆抗体，上述DSPE-PEG2000_B1tin连接亲和素，上述亲和素连接上述单克隆抗体。
[0014]根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备第一方面的双靶向超声造影剂的方法，该方法包括如下步骤:
[0015](I)将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin溶解在三氯甲烷中；
[0016](2)在惰性气流作用下除去上述三氯甲烷，使上述DSPC'Stearic-PEieOCKDSPE-pEGSOOO-B1tin 在容器壁上形成均匀薄膜；
[0017](3)加入水性溶液后振荡至透明，然后分装于密封瓶中；
[0018](4)用全氟丙烷置换瓶内空气，振荡后制得生物素化微泡；
[0019](5)向上述生物素化微泡中加入亲和素，并在室温下孵育；
[0020](6)加入Integrinaj3和MCP-1的生物素化单克隆抗体，室温下孵育，制得上述双靶向超声造影剂。
[0021]作为本发明的优选方案，上述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin 的摩尔比为7.5?9.5:0.1?1:0.4?1.5，更优选为8.5:0.5:1。
[0022]作为本发明的优选方案，上述Integrinaj3和MCP-1的生物素化单克隆抗体的摩尔比为0.5?2:0.5?2，更优选为1:1。
[0023]作为本发明的最优选的方案，上述方法包括如下步骤:
[0024](I)将摩尔比为 8.5:0.5:1 的 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000_B1tin 溶解在三氯甲烷中；
[0025](2)在他气流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在试管壁上形成均匀薄膜；
[0026](3)加入0.1M Tris缓冲溶液后置于水浴式超声振荡器中振荡至透明，分装于洁净西林瓶中密封；
[0027](4)用全氟丙烷置换瓶内空气，置于机械振荡器振荡30s后制得生物素化微泡；
[0028](5)将其加入PBS离心清洗后，取1mL微泡加入50yg亲和素，室温下孵育20min;
[0029](6)再次离心后加入过量的摩尔比为1:1生物素化Integrinaj3及MCP-1单克隆抗体，室温下孵育20min，即制得Integrinav03/MCP-l双革E向微泡的造影剂。
[0030]根据本发明的第三方面，本发明提供一种双靶向载基因超声造影剂，该双靶向载基因超声造影剂包括如第一方面的双靶向超声造影剂以及包裹于上述双靶向超声造影剂的微泡内的重组质粒。
[0031]根据本发明的第四方面，本发明提供一种制备第三方面的双靶向载基因超声造影剂的方法，该方法包括将如第一方面的双靶向超声造影剂与重组质粒混合并孵育。
[0032]相比现有技术，本发明的超声造影剂具有如下优势:本发明采用IntegrinavP3和MCP-1双靶向设计，将这两个在乳腺癌组织中高表达的位点结合起来，使得微泡的靶向效率得以提高，能够大幅提高其携带基因在靶组织的富集程度。同时，本发明的造影剂是一种兼具显影和治疗双功能的超声造影剂，通过超声成像系统可实时、准确地观察肿瘤成像;通过高强度超声辐照实现基因转染后，可达到肿瘤基因治疗的效果。此外，在本发明的优选的方案中，将Stearic-PEI600加入成膜材料中，制得的微泡表面带正电荷，与质粒的吸附作用更强。
【附图说明】
[0033]图1为本发明一个实施例的双靶向载基因超声造影剂的结构示意图。
[0034]图2为本发明一个实施例制备的双靶向超声造影剂混悬液。
[0035]图3为本发明一个实施例制备的双靶向超声造影剂超声显影成像图。
[0036]图4为本发明一个实施例中4组超声造影剂与MCF-7细胞靶向结合情况，其中A显示非靶向微泡组:未见微泡与MCF-7黏附;B显示Integrinaj3单靶向微泡组:可见少量微泡与MCF-7黏附；C显示MCP-1单靶向微泡组:可见少量微泡与MCF-7黏附；D显示IntegrinaJ3/MCP-1双靶向微泡组:可见大量微泡与MCF-7黏附。
[0037]图5为本发明一个实施例中4组超声造影剂的靶向显影效果情况，其中A显示非靶向