靶向显影效果情况，其中图5中的白色箭头指示原始荧光图像中的绿色荧光信号。图5所示的结果显示，本发明设计的双靶向微泡靶向显影效果明显优于空白对照及IntegrincO^或MCP-1单靶向微泡组。然后取肿瘤组织行冰冻切片，利用共聚焦显微镜观察各组微泡在肿瘤内荧光显示强度，比较各组微泡靶向效率。
[0076]实施例3成功构建AKT-shRNA表达质粒，并将其包裹于双靶向微泡上
[0077]1.重组质粒的鉴定及筛选:委托基因公司根据基因库中AKT基因序列设计两对RNA干扰的靶点序列，合成shRNA重组质粒AKT2-1和AKT2-2 (序列5 ’ -3 ’: CACCTTTGTCATACGCTGC和GGGCTAAAGTGACCATGAATG)，采用脂质体法(Lipofectamine 2000)转染MCF-7乳腺癌细胞，运用荧光显微镜、流式细胞仪、CCK8法检测转染效果，筛选最佳质粒用于后续实验中。
[0078]2.载质粒双靶向微泡的制备:制备IntegrincOVMCP-1双靶向微泡，方法同实施例1。将制备的AKT-shRNA重组质粒与双靶向微泡混合，充分孵育30min，制备双靶向载基因微泡。
[0079]实施例4双靶向载基因微泡在超声辐照下介导AKT-shRNA转染的体外实验
[0080]1.培养MCF-7细胞，方法同实施例2。
[0081 ] 2.实验分组:①MCF-7+AKT-shRNA裸质粒组；②MCF-7 +空白微泡；③MCF-7 +Integrinaj3单靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组;④MCF-7+MCP-1单靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组;⑤MCF-7+IntegrinaJ3/MCP-l双靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组。
[0082] 3.根据分组将质粒(2yg)、单靶向微泡(3 X 17)或微泡复合物(2yg+3 XlO7)加入培养板孔中，培养板于培养箱中静置孵育15分钟，使微泡附着于细胞。
[0083]4.通过聚焦超声探头(探头直径2.0cm，焦距2.5cm)给予超声辐照，辐照时间20s/孔。所用的超声参数为:频率1MHz，脉冲重复频率1kHz，占空比20%，声强1.65W/cm2。
[0084]5.孵育6h后吸弃转染复合溶液，更换为含血清和抗生素的培养基，放入37 °C、5 %CO2培养箱中继续培养。
[0085]6.转染效应检测方法:利用RT-PCR、Western-blot印迹法观察AKT mRNA及蛋白表达水平，运用MTT比色法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡。
[0086]图6示出了不同的载基因微泡在超声辐照下介导AKT-shRNA转染的体外实验结果，其中图6中的白色箭头指示原始荧光图像中的绿色荧光信号。根据实验结果，本实施例设计的双革El向微泡革El向基因转染效果明显优于空白对照及Integrinaj3或MCP-1单革El向微泡组。[0087 ]实施例5双靶向载基因微泡在超声辐照下介导AKT-shRNA转染的体内实验
[0088]1.建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，方法同实施例2。
[0089]2.实验分组:①AKT-shRNA裸质粒组;②空白微泡对照组;③Integrinaj3单靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组;④MCP-1单靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组;⑤Integrinaj3/MCP-l双靶向微泡携带AKT-shRNA重组质粒转染组。
[0090]3.根据分组将质粒(5mg)、单靶向微泡(I X 19)或微泡复合物(5mg+l X 19)经尾静脉注入荷瘤鼠体内。
[0091 ] 4.通过聚焦超声探头(探头直径2.0cm，焦距1.5cm)置于肿瘤处给予超声辐照，辐照时间50 s。所用的超声参数为:频率IMHz，脉冲重复频率I kHz，占空比30 %，声强1.85W/
Cm20
[0092]5.肿瘤抑制效果观察。具体观察指标如下:①肿瘤体积及瘤重测量:于实验后不同时间点(3、6、9、12、15、18，21天)定期用游标卡尺测量肿瘤长径及短径。按以下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积=0.5 X肿瘤长径X肿瘤短径2，并绘制肿瘤生长曲线。实验最后处死裸鼠，摘出移植瘤并称取瘤重，计算抑瘤率:抑瘤率=(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重X 100%。②评价AKT mRNA含量:实时定量PCR法(RT-PCR)分析肿瘤组织中AKT mRNA的表达量。③评价AKT蛋白表达情况:免疫组化染色或蛋白印迹杂交法分析瘤组织中AKT蛋白的表达。④微血管密度测量(MVD):每一肿瘤随机观察三张切片，每张切片选取密度较高的三个视野观察，最终以每高倍视野内微血管数的平均值作为微血管密度。⑤TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡:TUNEL染色，光镜下观察细胞凋亡情况并计算凋亡指数:凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数X 100%。
[0093]5.安全性评价:行半数致死量(LD50)测定及最大耐受量试验，用以评估体内生物毒性作用。
[0094]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种双革El向超声造影剂，其特征在于，所述造影剂是Integrin av03/MCP_l双革El向微泡，所述双革G向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Integrin avβ3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的双靶向超声造影剂，其特征在于，所述脂质外壳包括DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-Bi。tin;优选地，所述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin的摩尔比为7.5-9.5:0.1-1:0.4-1.5，优选为8.5:0.5:1。3.根据权利要求1所述的双靶向超声造影剂，其特征在于，所述气体内芯是全氟丙烷内芯。4.根据权利要求1所述的双革E向超声造影剂，其特征在于，所述Integrinανβ3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体为生物素化单克隆抗体;所述脂质外壳与所述单克隆抗体通过亲和素和生物素连接在一起;优选地，所述Integrin ανβ3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体的摩尔比为0.5?2:0.5-2，更优选为1:1。5.根据权利要求1-4任一项所述的双靶向超声造影剂，其特征在于，所述脂质外壳包括DSPC、Stear ic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1t in，所述气体内芯是全氟丙烷内芯，所述单克隆抗体是生物素化单克隆抗体，所述DSPE-PEG2000-B1tin连接亲和素，所述亲和素连接所述单克隆抗体。6.—种制备权利要求1-5任一项所述的双靶向超声造影剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)将DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin溶解在三氯甲烷中； (2)在惰性气流作用下除去所述三氯甲烷，使所述DSPC'Stearic-PEieOCKDSPE-pEGSOOO-B1tin 在容器壁上形成均匀薄膜； (3)加入水性溶液后振荡至透明，然后分装于密封瓶中； (4)用全氟丙烷置换瓶内空气，振荡后制得生物素化微泡； (5 )向所述生物素化微泡中加入亲和素，并在室温下孵育； (6)加入Integrin ανβ3和MCP-1的生物素化单克隆抗体，室温下孵育，制得所述双靶向超声造影剂。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin 的摩尔比为 7.5-9.5:0.1-1:0.4-1.5，优选为 8.5:0.5:1; 优选地，所述Integrin ανβ3和MCP-1的生物素化单克隆抗体的摩尔比为0.5-2:0.5-2，优选为1:1。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)将摩尔比为8.5:0.5:1的DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin溶解在三氯甲烷中； (2)在他气流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在试管壁上形成均匀薄膜； (3)加入0.1M Tris缓冲溶液后置于水浴式超声振荡器中振荡至透明，分装于洁净西林瓶中密封； (4)用全氟丙烷置换瓶内空气，置于机械振荡器振荡30s后制得生物素化微泡； (5)将其加入PBS离心清洗后，取1mL微泡加入50yg亲和素，室温下孵育20min; (6)再次离心后加入过量的摩尔比为1:1生物素化Integrin ανβ3及MCP-1单克隆抗体，室温下孵育20min，即制得Integrin av03/MCP_l双革E向微泡的造影剂。9.一种双靶向载基因超声造影剂，其特征在于，所述双靶向载基因超声造影剂包括如权利要求1-5任一项所述的双革El向超声造影剂以及包裹于所述双革El向超声造影剂的微泡内的重组质粒。10.—种制备如权利要求9所述的双靶向载基因超声造影剂的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1-5任一项所述的双靶向超声造影剂与重组质粒混合并孵育。
【专利摘要】本发明公开了一种双靶向超声造影剂及其制备方法，所述造影剂是Integrin？αvβ3/MCP-1双靶向微泡，所述双靶向微泡包括脂质外壳和气体内芯，所述脂质外壳的外表面连接有Integrin？αvβ3单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体。本发明通过不同靶点的联合应用，可以有效提高造影剂的靶向效能，大幅提高其携带基因在靶组织的富集程度。此外，本发明的造影剂是一种兼具显影和治疗双功能的超声造影剂，通过超声成像系统可实时、准确地观察肿瘤成像；通过高强度超声辐照实现基因转染后，可达到肿瘤基因治疗的效果。
【IPC分类】A61K49/22, A61K48/00
【公开号】CN105617410
【申请号】CN201610017740
【发明人】徐金锋, 刘莹莹, 严飞, 郑海荣, 周玉丽, 曾欣欣
【申请人】深圳市人民医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月12日