一种新颖魁蚶抗氧化活性肽的制备及其用途的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种海洋生物魁蚶(ArcainflataReeve)中的抗氧化活性多肽化合物，及其分离制备方法和该化合物的抗氧化医药用途。
背景技术：
：魁蚶(ArcainflataReeve)属于动物门，瓣鳃纲，蚶目，蚶科，属海洋软体动物门的一员，是一种大型海洋底栖经济贝类，主要分布于日本、朝鲜半岛和中国的渤海、黄海及东海沿岸的软泥底部，也是我国重要的经济贝类之一，其肉质鲜美，血液鲜红，具有高蛋白、低脂肪、维生素丰富等特点，自古以来就被人们当作滋补佳品、佐酒名菜，古书中记载魁蚶有“令人能食、益血色、消血块和化痰积”之功效。通过查阅相关文献资料发现，国外学者阐述了魁蚶中的一类具有抗菌作用和免疫调节作用的蛋白多肽活性组分，而提取具有抗氧化活性物质的研究未见报道。国内学者对魁蚶的研究主要集中于魁蚶生态习性、养殖技术及其营养成分分析等方面，对魁蚶蛋白多肽类物质的研究亦很少，如中国专利200610036488.9公开了“魁蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途”；专利201310619247.7公布了“从魁蚶中分离制备一种抗肿瘤多肽化合物的方法和用途”，他们均详细描述了从魁蚶天然产物中提取活性蛋白多肽类物质的方法及其抗肿瘤的医药用途，但罕见有从魁蚶水解物中提取具有抗氧化、抗衰老作用的活性蛋白多肽组分，也未见任何从魁蚶水解物中提取分离到高纯度且物质基础明确的抗氧化活性多肽化合物及其理化性质、结构解析的研究报道。故利用水解这一方法提取魁蚶中的活性物质进一步拓展了魁蚶中活性多肽组分的分离方法，也丰富了其他物种中活性多肽物质的提取途径，为合理利用海洋资源提供科学依据；此外，对多肽化合物进行深入的性质测定及基本结构解析将具有重要意义，为物质的药理作用机制提供理论基础。技术实现要素：本发明的目的在于借助多种现代蛋白分离纯化技术，从海洋生物魁蚶水解物中提取分离蛋白多肽类活性物质，特别是提供一种优化了的魁蚶水解工艺，并涉及了其制备方法、医药用途和结构表征等内容。本发明是通过以下的技术方法来实现的：将新鲜魁蚶去壳清洗，组织匀浆，水解工艺筛选及优化，离心取上清液干燥浓缩，得到活性多肽组分。将活性组分再依次进行超滤截留浓缩、离子交换层析、凝胶过滤及高效排阻色谱法，最终得到一个纯度为99%的抗氧化活性多肽，分子量为17578.31Da，并对其基本结构进行解析。体外抗氧化实验结果表明，该多肽化合物具有显著的抗氧化活性，体外清除DPPH、ABTS及羟基自由基IC50值分别为3.89、0.22和10.77mg/ml；体内抗氧化实验结果显示，可使秀丽隐杆线虫最长寿命延长至27天，平均寿命增加18.29%。因此该多肽化合物可用于抗氧化剂，药用化妆品或保健品的开发和应用。附图说明图1为实例1中用基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱测定活性多肽化合物的相对分子量图谱。图2为实例1中多肽化合物的圆二色谱图。图3为实例1中多肽化合物利用基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱测定活性多肽的指纹图谱。具体实施方式下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。实施例1选用一种商业蛋白酶对魁蚶组织进行水解，利用现代蛋白分离纯化技术，对魁蚶中活性多肽组分进行分离制备。将魁蚶剥壳，取其组织团块，蒸馏水清洗三次，控干后称重，按照1：3（w/v）的比例加入双蒸水，采用高速组织捣碎机，以3000rpm，每间隔30sec匀浆1min，总计3min，将匀浆液置于低频超声仪中超声40min，加入5%（g/100g蛋白底物）比例中性蛋白酶，维持温度45℃，pH7.0反应5h，1MNaOH调节pH，沸水浴10min终止反应，冷却至室温，然后8000rpm，4℃条件下离心30min去沉淀，取上清液冷冻干燥；利用截留分子量为3kD和10kD的超滤膜离心管于4℃，3000rpm条件下离心60min，将活性多肽组分为三部分；目的活性肽组分过DEAE-SephoroseFastFlow阴离子交换柱，并分别采用含有0、0.1、0.3、0.5、1.0MNaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行阶段梯度洗脱，流速为1ml/min，280nm处检测吸收峰；收集0.3MNaCl洗脱下的多肽组分，过Sephadex-G100葡聚糖凝胶柱，0.3ml/min超纯水洗脱，280nm处检测吸收峰；收集Sephadex-G100凝胶柱分离活性多肽组分，利用高效液相分子排阻法，使用TSK-GelG2000SWxl色谱柱，以含有0.1MNa2SO4，pH6.8的0.05M的PBS缓冲溶液为流动相，流速1ml/min；检测波长280nm，分离制备出一种纯度高达99%的活性多肽。采用MALDI-TOF/TOF-MS（基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱）法测定该多肽的分子量为17578.31Da，并测定多肽的指纹图谱；用圆二色谱和Jasco蛋白二级结构评估软件分析其二级结构组成。表1.活性多肽化合物的二级结构组成分析结果表1二级结构类型组成(%)α-螺旋40.8β-折叠24.7β-转角15.9无规卷曲18.6实施例2采用三种体外自由基清除实验，对魁蚶水解物中活性多肽化合物进行抗氧化活性分析。（1）DPPH自由基清除活性测定：双蒸水配制浓度为1、2、4和8mg/ml的样品溶液，取10μL不同浓度的样品溶液和190μL0.2mM的DPPH溶液，加入96孔培养板中，避光于水平摇床上室温反应30min，酶标仪517nm波长处测定其吸光度值，每个浓度设定三组平行试验，结果取其平均值，还原型谷胱甘肽为阳性对照。（2）ABTS自由基清除活性测定：双蒸水配制浓度为1、2、4和8mg/ml的样品溶液，取10μL不同浓度的样品溶液和190μL10mMpH7.4的ABTS自由基工作液，加入96孔培养板中，避光于水平摇床上室温反应10min，酶标仪734nm波长处测定其吸光度值，试验设4组平行，结果取平均值，并重复实验三次，还原型谷胱甘肽为阳性对照。（3）羟基自由基清除活性测定：分别配制0.1mol/LPH7.4的磷酸钠缓冲液（PBS）、5.0mmol/L邻二氮菲溶液、5.0mmol/L的FeSO4溶液、0.3%H2O2溶液和1、2、4和8mg/ml的样品溶液，在96孔板中按照表3依次加入相应的溶液，反应总体积为200μL，将上述各组样品反应体系摇匀后置于恒温培养箱中，37℃反应60min，然后酶标仪510nm波长处测定吸光度值（A），至少设3组平行试验，结果取平均值，谷胱甘肽为阳性对照。表3.羟基自由基清除活性测定操作步骤表4.三种体外自由基清除实验测定结果实施例3采用模式动物秀丽隐杆线虫，进行活性多肽的体内抗衰老作用分析。选用同步化的L4期秀丽线虫进行给药，给药剂量分别为2、4和8mg/ml，于20℃条件下培养48h，分别挑取对照组及实验组线虫至涂有E.coliOP50的新鲜NGM培养皿中培养，每天将存活的秀丽线虫转移到新鲜NGM培养皿中，并准确记录下当天秀丽线虫的死亡数和丢失数，直到没有活的秀丽线虫为止，确认其死亡的标准是线虫不能对外部刺激产生应答反应，空白组及实验组最后一条秀丽线虫死亡的时间即为该组线虫的最长寿命；至少重复进行平行实验两次，对照组和实验组的线虫数均为50±2条。表5.多肽化合物对秀丽隐杆线虫的寿命影响（±S，n=3，*p<0.05）当前第1页1 2 3