本发明涉及生物、医药及食品工业技术领域，尤其是一种从鸡蛋清中分离制备溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)是一种糖苷水解酶，又称胞壁质酶或N－乙酰胞壁质聚糖水解酶，作用于N－乙酰葡萄糖氨和N－乙酰氨胞壁酸之间的β－1，4键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成份分解，从而水解细菌细胞壁，在细胞内则对吞噬后的病原菌起破坏作用。所以它具有抗炎功效，并以保护机体不受感染。溶菌酶不仅能分解稠厚的粘蛋白，使脓性创口渗出物液化而易于排出，并能清除坏死粘膜，加速粘膜组织的修复和再生。溶菌酶与抗菌素合用具有良好的协同、增效作用。在临床上溶菌酶可用来制消炎药，用于五官科多种粘膜疾病，如副鼻窦炎，慢性鼻炎、渗出性中耳炎等。在食品工业中，溶菌酶可以用作婴儿食品的添加剂。溶菌酶还是基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。用溶菌酶制成的漱口液及牙膏可防龋齿。溶菌酶的用处如此广泛，所以实现溶菌酶的工业化分离与纯化具有重要的经济价值。
当前从鸡蛋清中分离纯化溶菌酶的方法有直接结晶法、亲和色谱法、超滤法、反胶团萃取法与离子交换法等。用结晶法生产溶菌酶时容易发生共晶问题。亲和分离技术只能处理小量原材料，而且各种昂贵的亲和柱介质也会导致较高的生成成本。色谱技术虽然选择性好、分离速度快、效率高，容易实现自动化控制，但是存在纯度和得率较低的缺陷。使用单一的分离纯化方法在分离和纯化溶菌酶时很难获得较高的纯度和得率，所以对溶菌酶的分离和纯化应该将两种或者几种方法结合起来，按照一定的顺序进行分离。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种蛋清溶菌酶的分离纯化方法。该方法将离子交换法、双水相萃取法和膜分离法结合使用，克服了单一分离纯化方法难以获得较高纯度和得率的缺陷。
为了实现上述目的，本发明采用以下步骤：
(1)收集新鲜鸡蛋清，按蛋清与缓冲液体积比为1∶2的比例加入PH4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，冷处静置过夜；
(2)8000rpm离心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氢氧化钠溶液将pH调到6；
(3)将CM－琼脂糖离子交换介质装柱，预处理成钠型后用pH6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液平衡；
(4)按照上样液和介质体积比为3∶1的比例上柱，用去离子水清洗未交换蛋白，最后用1M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，并收集洗脱液；
(5)用1M盐酸将洗脱液调至pH5.5，均匀搅拌1小时，8000rpm离心去除沉淀，收集上清液B；
(6)向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的质量浓度达20～25％，再搅拌1小时，8000rpm离心，收集上清液C；
(7)向所得上清液C中加入饱和硫酸钠溶液，至硫酸钠的质量浓度达到15～20％，混匀后于6000rpm离心，收集上清液D；
(8)对所得上清液D，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，对超滤所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(6)中的聚乙二醇的质量浓度达25％，步骤(7)中的硫酸钠的质量浓度达到15％。
本发明的有益效果是：相对于现有技术，该方法具有如下优点：
(1)该方法将离子交换法、双水相萃取法和膜分离法结合使用，克服了单一分离纯化方法存在的纯度和得率低下的缺陷；
(2)本发明所用工艺操作简单易行，生产周期短，无需复杂设备，成本低廉，易于大规模工业化生产；
(3)本发明所用工艺未使用任何有毒有害化学物质，确保产品质量的安全性；
(4)本发明各分离步骤中条件温和，无相变发生，有利于保护溶菌酶的生物学活性，可以获得高纯度与高生物活性的溶菌酶。
附图说明
图1为采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白质电泳法测定按照实施例1～4的方法制得的溶菌酶的电泳色谱图。
其中：1、溶菌酶标准蛋白质；2、按实施例1方法制得的溶菌酶；3、按实施例2方法制得的溶菌酶；4、按实施例3方法制得的溶菌酶；5、按实施例4方法制得的溶菌酶。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例一
收集新鲜鸡蛋清，按蛋清与缓冲液体积比为1∶2的比例加入PH4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，冷处静置过夜；8000rpm离心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氢氧化钠溶液将pH调到6；将CM－琼脂糖离子交换介质装柱，预处理成钠型后用pH6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液平衡；按照上样液和介质体积比为3∶1的比例上柱，用去离子水清洗未交换蛋白，最后用1M氯化钠 溶液洗脱2个柱体积，并收集洗脱液。用1M盐酸将洗脱液调至pH5.5，均匀搅拌1小时，8000rpm离心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的质量浓度达20％，再搅拌1小时，8000rpm离心，收集上清液C；向所得上清液C中加入饱和硫酸钠溶液，至硫酸钠的质量浓度达到15％，混匀后于6000rpm离心，收集上清液D；对所得上清液D，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，对超滤所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白质电泳法对所得溶菌酶检测为单一条带，用比浊法测得酶活可达到25000U/mg，收率为每1kg蛋清得3.3～3.6g溶菌酶。
实施例二
收集新鲜鸡蛋清，按蛋清与缓冲液体积比为1∶2的比例加入PH4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，冷处静置过夜；8000rpm离心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氢氧化钠溶液将pH调到6；将CM－琼脂糖离子交换介质装柱，预处理成钠型后用pH6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液平衡；按照上样液和介质体积比为3∶1的比例上柱，用去离子水清洗未交换蛋白，最后用1M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，并收集洗脱液。用1M盐酸将洗脱液调至pH5.5，均匀搅拌1小时，8000rpm离心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的质量浓度达20％，再搅拌1小时，8000rpm离心，收集上清液C；向所得上清液C中加入饱和硫酸钠溶液，至硫酸钠的质量浓度达到20％，混匀后于6000rpm离心，收集上清液D；对所得上清液D，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，对超滤所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白质电 泳法对所得溶菌酶检测为单一条带，用比浊法测得酶活可达到25000U/mg，收率为每1kg蛋清得3.4～3.7g溶菌酶。
实施例三
收集新鲜鸡蛋清，按蛋清与缓冲液体积比为1∶2的比例加入PH4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，冷处静置过夜；8000rpm离心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氢氧化钠溶液将pH调到6；将CM－琼脂糖离子交换介质装柱，预处理成钠型后用pH6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液平衡；按照上样液和介质体积比为3∶1的比例上柱，用去离子水清洗未交换蛋白，最后用1M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，并收集洗脱液。用1M盐酸将洗脱液调至pH5.5，均匀搅拌1小时，8000rpm离心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的质量浓度达25％，再搅拌1小时，8000rpm离心，收集上清液C；向所得上清液C中加入饱和硫酸钠溶液，至硫酸钠的质量浓度达到20％，混匀后于6000rpm离心，收集上清液D；对所得上清液D，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，对超滤所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白质电泳法对所得溶菌酶检测为单一条带，用比浊法测得酶活可达到25000U/mg，收率为每1kg蛋清得3.5～3.8g溶菌酶。
实施例四
收集新鲜鸡蛋清，按蛋清与缓冲液体积比为1∶2的比例加入PH4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，冷处静置过夜；8000rpm离心去除沉淀，收集上清液A，用0.5M氢氧化钠溶液将pH调到6；将CM－琼脂糖离子交换介质装柱，预处理成钠型后用pH6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液平衡；按照上样液和介 质体积比为3∶1的比例上柱，用去离子水清洗未交换蛋白，最后用1M氯化钠溶液洗脱2个柱体积，并收集洗脱液。用1M盐酸将洗脱液调至pH5.5，均匀搅拌1小时，8000rpm离心去除沉淀，收集上清液B；向所得上清液B中加入聚乙二醇2000，至聚乙二醇的质量浓度达25％，再搅拌1小时，8000rpm离心，收集上清液C；向所得上清液C中加入饱和硫酸钠溶液，至硫酸钠的质量浓度达到15％，混匀后于6000rpm离心，收集上清液D；对所得上清液D，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，对超滤所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)蛋白质电泳法对所得溶菌酶检测为单一条带，用比浊法测得酶活可达到25000U/mg，收率为每1kg蛋清得4.1～4.4g溶菌酶。