高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法与流程

文档序号:11061783阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,包括以下步骤:

a、对人胚胎干细胞来源的具有色素团块的混合细胞进行酶处理成单细胞,离心后弃上清,添加培养基重悬并接种于培养皿中悬浮培养;

b、培养1天后形成黑白混合的细胞悬球,定期换液并培养;

c、培养7天混合的细胞悬球会形成黑白两个部分,然后机械分离得到两种类型的细胞悬球;

d、收集不同细胞悬球并分别接种到培养皿中,放置培养并定期换液即可分别得到成熟的RPE细胞和RPC。

2.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤a中所述人胚胎干细胞来源的具有色素团块的混合细胞为人胚胎干细胞通过诱导分化或者自发分化的方法得到的混合细胞。

3.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤a中所述酶处理成单细胞为应用0.25%胰酶在37℃条件下处理20分钟,并用移液器吹打成单细胞然后终止胰酶反应。

4.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤a所述培养基成分为:DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇,其中,血清替代物的体积分数为20%,非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L,青霉素的浓度为100U/ml,链霉素的浓度为100ug/ml,谷氨酰胺的浓度为1mmol/L,β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。

5.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤b中所述定期换液为每天换液,收集细胞悬球至15毫升离心管,用水平离心机400rpm离心3分钟,弃上清加入新鲜培养基。

6.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤c中所述形成黑白两个部分为混合悬球中的黑白细胞分别聚集并分离形成两个粘连的黑色悬球与白色悬球;所述机械分离为用灭菌的刀片在黑白悬 球的粘连出切割使两悬球分离。

7.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤d中所述收集不同细胞悬球为用移液器根据颜色收集黑色与白色两种细胞悬球。

8.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤d中所述培养皿为100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿;所述定期换液为隔天换液。

9.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,步骤d中所述成熟的RPE细胞为具有鹅卵石样形态,色素积累,表达相关蛋白并具有吞噬功能的细胞;所述RPC为表达相关蛋白的神经元细胞。

10.根据权利要求1所述的一种高效分离体外诱导的RPE细胞和RPC的方法,其特征在于,各步骤中所述培养是在37℃和5%CO2培养箱中进行。

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