本发明属于化学药物领域，涉及一种环肽类化合物及其制备方法和应用。
技术背景
鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb.)的新鲜全草或干燥地上部分，早在《本草纲目》和《新修本草》中便有记载。鱼腥草味辛、微寒、归肺经，具有清热解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、镇痛等多种功效。现代药理实验研究表明鱼腥草具有抗菌、抗炎、抗病毒等作用，临床上用于呼吸系统疾病、消化系统疾病、妇科疾病等的治疗，被誉为一种天然的抗生素。鱼腥草早已被国家卫生部正式确定为药食同源的极具开发潜力的资源之一。鱼腥草的挥发油类成分也已被证明为具有显著的抗菌活性的有效成分，其中鱼腥草素(癸酰乙醛)及其合成衍生物已被开发成药物应用于临床，如用于治疗慢性支气管炎及其他上呼吸道感染性疾病的鱼腥草素钠片。
环肽类化合物广泛存在于各种生命物质中，并且是一类具有多种生物活性的物质，如具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、子宫收缩等活性。天然环肽主要由常见氨基酸组成，较线型多肽有更为稳定的结构，因此具有多种生理功能和医药价值。第一个被报道的天然环肽是从细菌中被分离得到的，命名为Gramicidin S，并且实验证明其对G+菌有很好的抗菌活性。随后人们便开启了对环肽类物质的深入研究，从微生物、植物以及海洋生物等生物中陆续分离到很多具有生物活性的特殊结构的环肽类化合物。例如，从土壤丝状真菌发酵液中分离的环(亮氨酸-亮氨酸)对青霉菌和黑曲霉菌有较好的抗真菌活性。从小红参中分离的茜草科类型环肽是一类结构新颖的具有强抗肿瘤活性的双环环六肽，其显示出对P-388有很强的抗肿瘤活性。海洋生物中也富含环肽类物质，如从海鞘Lissoclinum patella中分离得到的环肽也具有很强的抗肿瘤活性。
抗菌是指采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程，包括灭菌、杀菌、消毒、抑菌、防霉、防腐等。细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。常见的革兰氏阳性菌包括：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤 风杆菌等，它们能产生外毒素使人致病；常见的革兰氏阴性菌包括：痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。临床上常用的杀菌剂有：β-内酰胺类、氨基糖甙类、氟喹诺酮类、磺胺类、多肽类等。如万古霉素，为一种环肽类抗生素，它通过抑制细菌细胞壁中磷脂和多肽的生成，来抑制细菌的生长和繁殖。
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症表现为红、肿、热、痛，引起组织功能障碍。由感染引起的炎症，称为感染性炎症，而不由感染引起的炎症，称为非感染性炎症。炎症与许多疾病都相关，例如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、退行性疾病等。因此寻找更为有效的抗炎药物刻不容缓。
因此临床上迫切需要此类环肽类的药物，既具有抗炎抗菌效果，最好由具有生物活性的分子组成，会具有更低的生物毒性和更高的安全性。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种从中药鱼腥草中分离提纯的环肽类化合物，具有广谱抗菌活性，对多种菌株均具有显著的抗菌效果，具体为，一种环肽类化合物，全部由亮氨酸组成，通式为环-leu-[leu]n-，其特征在于，所述环肽类化合物中亮氨酸以肽键相互连接成环，n为1到7的整数，依次构成环二肽到环八肽。结构式分别为：
其中进一步优选，n＝2，则该环肽类化合物为亮氨酸环三肽。
本发明进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括环二肽到环八肽共7种化合物或其药学上可接受的衍生物及盐类，该环二肽到环八肽依次按重量比为2-5：28-32：14-18：1-3：30-35：1：2-5。
本发明所述的该系列环肽化合物的组合物或其药理学上容许的盐，可以列举为无机酸：盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸；有机酸：马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、己二酸、对-苯甲磺酸、棕榈酸、单宁酸；金属离子：钠、钾、锂、钙、镁等成的盐。
本发明在采用萃取、硅胶柱色谱、正相高效液相色谱、反相高效液相色谱等多种分离手段得到该系列环肽的基础上，又对该系列环肽的组合物进行了1)抗菌活性研究，包括：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌、弗氏志贺菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆 菌、伤寒沙门杆菌，结果显示该系列环肽的组合物有良好的广谱抗菌活性，可作为潜在的抗菌药物。2)抗炎活性研究，结果显示该系列环肽的组合物有显著的抗炎活性，可作为潜在的抗炎药物。另外，通过研究发现环肽类化合物或其药学上可接受的盐的特定比例的组合，即A～G的比例为：A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5时具有预料不到的技术效果，相对单体化合物而言上述化合物的组合之间具有协同作用，显示优良的抗菌活性和抗炎活性。
所述重量比进一步优选，即A～G的比例为：A:B:C:D:E:F:G＝3：30：16：1：35：1：4。
本发明进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物为药物制剂，由环肽类化合物及其药学上可接受的衍生物和盐类作为活性成分和药学上可接受的赋形剂组成。
其中固体制剂包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；液体制剂包括：注射剂等；眼用制剂包括：滴眼剂、眼用凝胶剂等。
本发明还提供了环肽类化合物的提取方法，由以下步骤组成：
1)取鱼腥草全草粉碎，用水蒸汽蒸馏法得挥发油粗品，晾干，再用乙醚溶解，加硫酸溶液萃取多次，合并上层有机相，得到混合溶液；
2)向混合溶液中加氢氧化钠溶液萃取多次，合并下层水相，再加硫酸溶液和乙醚萃取多次，合并上层有机相，减压蒸去溶剂即得鱼腥草挥发油；
3)将鱼腥草挥发油进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，每固定体积为一馏分，收集多个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并馏分；馏分经正相制备高效液相色谱梯度洗脱分离得到多个馏分，所述梯度洗脱馏分经反相制备高效液相色谱梯度洗脱分离，蒸发回收溶剂，得到所述环肽类化合物。
本发明进一步提供一种提取方法，由以下步骤组成：
1)取鱼腥草全草6000g，用水蒸汽蒸馏法加热2～5小时，得挥发油粗品，再用20～50倍乙醚溶解，置分液漏斗中加浓度8％～15％硫酸20～30ml萃取1～5次，取上层有机相，得到混合溶液；
2)向混合溶液中加质量体积分数1％～3％氢氧化钠溶液20～30ml萃取1～5次，取下层水相，再加浓度8％～15％硫酸20～30ml与相较挥发油粗品20～50倍的乙醚萃取1～5次，取上层有机相，减压蒸干溶剂即得挥发油样品100～300g；
3)挥发油样品进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，所述石油醚的沸程为30～ 60℃，或60～90℃，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶剂分别为体积比100:1、50:1、30:1、20:1、0:1五种流动相,分别逐次进行洗脱，柱子填料为200-300目柱层析凝胶，每300～500ml体积为一馏分，共收集到40～60个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到5个馏分；5个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经正相制备高效液相色谱正己烷-异丙醇等度洗脱，正己烷-异丙醇体积比为0.35％:1，流速1-3ml/min分离，色谱柱为安捷伦ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8个馏分，8个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经反相制备高效液相色谱进行梯度洗脱，所述反相制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水，洗脱流程为：0min，乙腈：水的体积比20％：80％到30min，乙腈：水为100％：0，流速0.5-1.5ml/min,柱子为Thermo C18 ODS柱,，旋转蒸发去除溶剂，得到环肽类化合物A～G。。
本发明还提供一种提纯方法，所述正己烷-异丙醇的流速优选2ml/min,
本发明还提供一种提纯方法，所述反相制备高效液相色谱的流速优选1ml/min。
所述活性测试为抗菌活性测试，为实施例26抗菌试验的精简版，目的为快速筛选活性最高的馏分。
本发明的现有技术为如专利CN102816212中提供了一种茜草科类型环肽及其药物组合物和应用，取茜草属植物的根茎，经干燥、粉碎后，进行环肽提取，经过我们的验证，现有方法并不能用于提取本环肽化合物，并且本环肽化合物首次使用正相高效液相色谱法，进过上述步骤的梯度洗脱，才可以直观的看到色谱峰的分布情况，较硅胶柱色谱峰、制备薄层色谱峰分离效果，避免各组分分叉严重的问题，因此本方法既是首次提取该类新化合物的方法，也属于一种直观高效提出该类化合物的新方法，具有突出的特点和实质的进步。
本发明还提供一种合成方法，由以下步骤组成：
a)L-亮氨酸和Boc-亮氨酸为初始原料合成保护型二肽；
b)在步骤a)保护型二肽基础上，再与一分子Boc-亮氨酸合成保护型三肽；
c)在步骤a)保护型二肽基础上，由一分子脱Boc-保护基的二肽和一分子脱酯基的二肽，合成保护型四肽；依次合成保护型五肽到八肽；
d)所述步骤a所述保护型二肽脱去Boc-保护基，在甲醇中回流，环合成环二肽；
e)将步骤b)，c)所述的保护下三肽到八肽分别进行进一步脱去Boc保护基和甲酯保护基，在缩合剂的作用下，依次合成环三肽到环八肽。
本发明进一步提供了一种合成方法，由以下步骤组成：
a)L-亮氨酸与甲醇和氯化亚砜在低温的下反应成亮氨酸甲酯盐酸盐，亮氨酸甲酯盐酸盐与BOC-亮氨酸以DIEA为缚酸剂，DCC与HOBT为混合缩合剂，二氯甲烷为溶剂缩合成保护型二肽；
b)保护型二肽在三氟乙酸：二氯甲烷，体积比1:4的作用下脱掉BOC-保护基，生成二肽的三氟乙酸盐；在低温的条件下，以DIEA为缚酸剂，DCC与HOBT为混合缩合剂，二氯甲烷为溶剂与Boc-亮氨酸缩合成保护型的三肽；
c)上步的保护型三肽再在三氟乙酸：二氯甲烷，体积比1:4的作用下脱掉Boc-保护基；脱去BOC-保护基的三肽甲酯在氢氧化钠和水，体积比1:1的作用下脱去甲酯保护，生成三肽，三肽再在HATU与PyBOP缩合剂的存在下，以DIEA为缚酸剂，以四氢呋喃和二氯甲烷为溶剂，缩合成环三肽。
以下为各个化合物具体合成路线：
(1)本发明进一步提供一种合成方法，由以下步骤组成：以L-亮氨酸、Boc-亮氨酸为初始原料合成保护型二肽：
(2)在保护型二肽基础上，再与一分子Boc-亮氨酸合成保护型三肽：
(3)在保护型二肽基础上，由一分子脱Boc-保护基的二肽和一分子脱酯基的二肽，合成保护型四肽：
(4)在保护型二肽、三肽的基础上，由一分子脱Boc-保护基的三肽和一分子脱酯基的二肽，合成保护型五肽：
(5)在保护型三肽的基础上，由一分子脱Boc-保护基的三肽和一分子脱酯基的三肽， 合成保护型六肽：
(6)在保护型五肽的基础上，由一分子脱Boc-保护基的五肽和一分子脱酯基的二肽，合成保护型七肽：
(7)在保护型六肽的基础上，由一分子脱Boc-保护基的六肽和一分子脱酯基的二肽，合成保护型八肽：
(7)保护型二肽脱去Boc-保护基，在甲醇中回流，环合成环二肽(A)：
(8)在脱去Boc-保护基的三肽的基础上进一步脱去甲酯保护基，在缩合剂的作用下，环合成环三肽(B)：
(9)在脱去Boc-保护基的四肽的基础上进一步脱去甲酯保护基，在缩合剂的作用下，环合成环四肽(C)：
(10)在脱去Boc-保护基的五肽的基础上进一步脱去甲酯保护基，在缩合剂的作用下，环合成环五肽(D)：
(11)在脱去Boc-保护基的六肽的基础上进一步脱去甲酯保护基，在缩合剂的作用下，环合成环六肽(E)：
(12)保护型七肽脱去两端的保护基，在缩合剂的作用下，环合成环七肽(F)：
(13)保护型八肽脱去两端的保护基，在缩合剂的作用下，环合成环八肽(G)：
以上合成路线所涉及缩写分别代表：
BOC叔丁氧羰基
TFA三氟乙酸
BOP-Cl双(2-氧代-3-恶唑烷基)次磷酰氯
PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMF四氢呋喃
目前也有环肽类化合物的报道，但均不适用与本环肽类化合物的合成，或者合成产物不理想，由于亮氨酸的侧链基团较大的环合时空间位阻也较大，因此其中本方法创新性使用了PyBOP和HATU，这两种缩合剂的使用，可以高效地合成亮氨酸环肽，并提高化合物的纯度和产量，具有很好的创新性和实用性。
本发明进一步提供了所述的环肽类化合物在制备治疗炎症或细菌性疾病的药物中的应用。
本发明的优点为：
1)首次从鱼腥草的挥发油类成分中提取到一系列新型环肽类化合物。
2)首次提供了该类化合物的提取方法，采用正相制备高效液相色谱法来对挥发油等小极性物质进行分离，该方法快速、高效，可得到微量环肽，避免了一些不稳定的物质的分解。
3)提供了该类化合物的制备方法，制备方法简单易行，可快速得到该类环肽类化合物，并为相似结构化合物的合成提供了合成路线，也解决了极性物质因极性小且极性相似而造成的分离难、分离效果差的问题。
4)提供了该类化合物在制剂上的应用，包含多种制剂的制备。
5)提供了该类化合物在制备抗炎和抗菌药物中的应用，该药物具有光谱抗菌活性，具有广阔的市场应用前景和实用性。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：该系列环肽的提取分离及结构鉴定
取鱼腥草全草6000g，用水蒸汽蒸馏法加热3小时，得挥发油粗品，再用30倍乙醚溶解，置分液漏斗中加浓度10％10％硫酸溶液25ml萃取一次，取上层有机相，加质量体积比2％2％氢氧化钠溶液25ml萃取一次，取下层水相，再加浓度10％10％硫酸溶液25ml和相当于挥发油粗品的30倍乙醚萃取，取上层有机相，减压旋干溶剂即得挥发油样品220g。
将挥发油样品进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、30:1、20:1、0:1,V/V)混合溶剂梯度洗脱，硅胶(200-300目)柱色谱，每400ml体积为一馏分，即100:1(4000ml)、50:1(4000ml)、30:1(5200ml)、20:1(5200ml)、0:1(800ml),V/V，共收集到48个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到5个馏分；5个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经正相制备高效液相色谱正己烷-异丙醇等度洗脱，正己烷-异丙醇体积比为0.35％:1，流速2ml/min分离，色谱柱为安捷伦ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8个馏分，8个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经反相制备高效液相色谱进行梯度洗脱，所述反相制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水，洗脱流程为：0min，乙腈：水的体积比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子为Thermo C18 ODS柱,，旋转蒸发去除溶剂，得到一系列环肽类化合物A(3.3mg),B(30.7mg),C(16.2mg),D(1.3mg),E(31.5mg),F(1.1mg),G(4.9mg)。
环肽类化合物A～F的结构解析如下：
cyclo(leu-leu)(A)：白色固体，MS:m/z 227.1738[M+H]+,m/z 249.1537[M+Na]+,calcd for C12H23N2O2m/z 227.1754；MS2:m/z 209(M+H-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.24(2H,S,-NH-×2),3.99(2H,m,N-CH×2),1.54(4H,m,CH2×2),1.81(2H,m,CH×2),0.88～0.90(12H,over,CH3×4)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9(C＝O×2),52.9(N-CH×2),43.4(CH2×2),23.7(CH×2),22.8(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu)(B)：白色固体，MS:m/z 340.2566[M+H]+,m/z 362.2357[M+Na]+, calcd for C18H34N3O3m/z 340.2568；MS2:m/z 322(M+H-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.11～7.67(3H,over,-NH-×3),3.72～3.99(3H,m,N-CH×3),1.49～1.51(6H,over,CH2×3),1.76(3H,over,CH×3),0.88～0.90(18H,over,CH3×6)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:170.3(C＝O×3),56.4(N-CH),56.3(N-CH×2),42.8(CH2×2),42.7(CH2),24.1(CH×3),21.9(CH3×4),22.0(CH3×2)。
cyclo(leu-leu-leu-leu)(C)：白色固体，MS:m/z 453.3423[M+H]+,m/z 475.3208[M+Na]+,calcd for C24H45N4O4m/z 453.3435；MS2:m/z 435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O)； 1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.47～7.52(4H,over,-NH-×4),4.15～3.88(4H,m,N-CH×4),1.45～1.49(8H,over,CH2×4),1.75～1.73(4H,over,CH×4),0.86～0.87(24H,over,CH3×8)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.4(C＝O×4),55.5(N-CH×4),41.0(CH2×4),23.8(CH×2),23.6(CH×2),22.6～22.3(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu)(D)：白色固体，MS:m/z 566.4242[M+H]+,m/z 588.4062[M+Na]+,calcd for C30H56N5O5m/z 566.4276；MS2:m/z 548(M+H-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),322(b3LL-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.41～7.44(5H,over,-NH-×5),4.25～4.17(5H,m,N-CH×5),1.50～1.48(10H,over,CH2×5),1.77～1.73(5H,m,CH×5),0.90～0.92(30H,over,CH3×10)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:171.6～173.5(C＝O×5),56.3(N-CH×4),56.0(N-CH),41.2～41.0(CH2×5),24.3(CH×5),22.4(CH3×4),22.3(CH3×2),22.2(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu)(E)：白色固体，MS:m/z 679.5077[M+H]+,m/z 701.4913[M+Na]+,calcd for C36H67N6O6m/z 679.5117；MS2:m/z 661(M+H-H2O),548(b5LL-H2O),435(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.22～7.49(6H,over,-NH-×6),4.30～4.27(6H,m,N-CH×6),1.50～1.47(12H,over,CH2×6),1.77～1.74(6H,over,CH×6),0.87～0.90(36H,over,CH3×12)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.9～172.4(C＝O×6),56.3(N-CH),56.1(N-CH×3),56.0(N-CH×2),41.4(CH2×6),24.4(CH×2),24.0(CH×4),22.5(CH3×4),22.6(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(F)：白色固体，MS:m/z 792.5931[M+H]+,m/z814.5742[M+Na]+,calcd for C42H78N7O7m/z 792.5957,MS2:m/z 774(M+H-H2O),661(b6LL-H2O),548(b5LL-H2O),453(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.99～7.66(7H,over,-NH-×7),4.44～4.40(7H,m,N-CH×7),1.58～1.55 (14H,over,CH2×7),1.81～1.79(7H,over,CH×7),0.90～0.92(42H,over,CH3×14)； 13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:174.3～174.0(C＝O×7)，56.9(N-CH×2),56.8(N-CH×4),55.9(N-CH),41.2(CH2×5),41.2(CH2×2),5.2(CH×7),22.6～22.1(CH3×14)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(G)：白色固体，MS:m/z 452.3314[M+2H]+,calcd for C48H88N8O8m/z 904.6714,MS2:m/z 792(b7LL),774(b7LL-H2O),679(b6LL),661(b6LL-H2O),566(b5LL),548(b5LL-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O),227(b2LL),209(b2LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.95～7.50(8H,over,-NH-×8),4.19～4.17(7H,over,N-CH×8),1.49～1.51(14H,over,CH2×8),1.74～1.70(7H,over,CH×8),0.89～0.91(48H,over,CH3×16)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9～173.7(C＝O×8),56.3(N-CH×8),41.6(CH2×4),41.3(CH2×4),25.4(CH×3),24.7(CH×2),24.6(CH×2),24.2(CH),22.5～22.2(CH3×16)。
实施例2：该系列环肽的提取分离
取鱼腥草全草6000g，用水蒸汽蒸馏法加热4小时，得挥发油粗品，再用20倍乙醚溶解，置分液漏斗中加浓度8％硫酸溶液20ml萃取3次，取上层有机相，加质量体积分数2％氢氧化钠溶液30ml萃取3次，取下层水相，再加浓度8％硫酸溶液30ml和相当于挥发油粗品的20倍乙醚萃取3次，合并上层有机相，减压旋干溶剂即得挥发油样品282g。
将挥发油样品进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合溶剂梯度洗脱，每300ml体积为一馏分，即100:1(3300ml)、50:1(3300ml)、30:1(4500ml)、20:1(4200ml)、0:1(600ml),V/V，硅胶(200-300目)柱色谱
共收集到53个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到5个馏分；5个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经正相制备高效液相色谱正己烷-异丙醇等度洗脱，正己烷-异丙醇体积比为0.35％:1，流速2ml/min分离，色谱柱为安捷伦ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8个馏分，8个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经反相制备高效液相色谱进行梯度洗脱，所述反相制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水，洗脱流程为：0min，乙腈：水的体积比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子为Thermo C18ODS柱,，旋转蒸发去除溶剂，得到一系列环肽类化合物A(2.1mg),B(28.1mg),C(6.8mg),D(1.7mg),E(27.8mg),F(8.8mg),G(15.2mg)。
实施例3：该系列环肽的提取分离
取鱼腥草全草6000g，用水蒸汽蒸馏法加热3小时，得挥发油粗品，再用20倍乙醚溶解，置分液漏斗中加浓度15％硫酸溶液20ml萃取一次，取上层有机相加质量体积分数5％氢氧化钠溶液30ml萃取2次，合并下层水相，再加浓度15％硫酸溶液30ml和相当于挥发油粗品的30倍乙醚萃取2次，合并上层有机相，减压旋干溶剂即得挥发油样品137g。
将挥发油样品进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合溶剂梯度洗脱，每500ml体积为一馏分，即100:1(5000ml)、50:1(5000ml)、30:1(6500ml)、20:1(6500ml)、0:1(1000ml),V/V，共收集到48个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到5个馏分；5个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经正相制备高效液相色谱正己烷-异丙醇等度洗脱，正己烷-异丙醇体积比为0.35％:1，流速2ml/min分离，色谱柱为安捷伦ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8个馏分，8个馏分分别进行生物活性测试，选用活性最高的馏分经反相制备高效液相色谱进行梯度洗脱，所述反相制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水，洗脱流程为：0min，乙腈：水的体积比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子为Thermo C18ODS柱,，旋转蒸发去除溶剂，得到一系列环肽类化合物A(4.0mg),B(29.9mg),C(4.3mg),D(1.1mg),E(30.7mg),F(1.4mg),G(3.6mg)。
实施例4：亮氨酸甲酯盐酸盐的制备
在装有滴液漏斗、带CaCl2干燥管和回流管的二口瓶中加入15ml甲醇和40mmol L-亮氨酸,于冰-盐浴中冷至-5℃,磁力搅拌下缓慢滴加50mmol氯化亚砜,维持温度0℃以下,继续反应1h,加热升温至45℃搅拌30min,使固体全溶,冷却,旋干溶剂,剩余物用10ml热甲醇溶解,冷却，加入大量的乙醚,有大量白色结晶析出,抽滤，再用少量甲醇洗涤滤饼。滤液会继续析出大量结晶，再进行抽滤，直至不再出现结晶为止。合并两次滤饼，即为白色亮氨酸甲酯盐酸盐，产率：95.1％。
实施例5：保护型二肽的制备
在0℃下,将二异丙基乙胺(DIEA)20mmol缓慢滴加到7mmol亮氨酸甲酯盐酸盐的 30ml二氯甲烷中,并调PH 7-8,然后再加入Boc-Leu 7mmol与1-羟基苯并三唑(HOBT)7mmol,在0℃下再反应15min,然后再加入DCC 7mmol,室温下反应17h(TLC跟踪反应),停止反应后，过滤，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析进行纯化,产率：90.7％。
实施例6：保护型二肽脱Boc-保护基的制备
取2.8mmol Boc-Leu-Leu-OCH3溶解于圆底烧瓶中,用12ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反应4h,反应结束后,在减压下旋走二氯甲烷与未反应的三氟醋酸,得到白色固体，产率：86.4％。
实施例7：保护型三肽的制备
在0℃下,将DIEA 21mmol缓慢滴加到Leu-Leu甲酸三氟醋酸盐7mmol的30ml二氯甲烷中,搅拌10min,然后再加入Boc-亮氨酸7mmol与HOBT 7mmol,在0℃下再反应15min,然后再加入DCC 7.5mmol,然后升到室温反应18h(TLC跟踪反应),停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化，产率：88.3％。
实施例8：保护型二肽脱甲酯保护基的制备
取2mmol Boc-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下皂化3h,点板至原料点消失，加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用无水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥2h,过滤浓缩，得白色固体,产率：88.8％。
实施例9：保护型四肽的制备
向装有2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml单口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA,搅拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,缓慢升至室温后反应16h,停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化,产率：37.7％。
实施例10：保护型三肽脱Boc-保护基的制备
取2.5mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圆底烧瓶中,用15ml二氯甲烷溶 解，并冷却到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋走二氯甲烷与未反应的三氟醋酸,得到白色固体,产率：84.6％。
实施例11：保护型五肽的制备
向装有2.2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml单口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,搅拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,缓慢升至室温后反应16h,停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化。产率：45.8％。
实施例12：保护型三肽脱甲酯保护基的制备
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下皂化3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用无水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有机相,用饱和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥3h,过滤浓缩,得白色固体,产率：81.7％。
实施例13：保护型六肽的制备
向装有2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OH的25ml单口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,搅拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,缓慢升至室温后反应12h,停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化，产率：45.5％。
实施例14：保护型五肽脱Boc-保护基的制备
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圆底烧瓶中,用15ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋干溶剂,得到白色固体，产率：68.9％。
实施例15：保护型七肽的制备
向装有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml单口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入1.7 mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,搅拌下加入2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,缓慢升至室温后反应16h(TLC跟踪反应),停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化,产率：34.8％。
实施例16：保护型六肽脱Boc-保护基的制备
取3mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圆底烧瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃，然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋干溶剂,得到白色固体，产率66.4％。
实施例17：保护型八肽的制备
向装有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml单口瓶中加入5.0ml二氯甲烷,再加入1.7mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,搅拌下加入2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,缓慢升至室温后反应16h(TLC跟踪反应),停止反应后,过滤,减压蒸去溶剂,用硅胶柱层析进行纯化,产率：32.4％。
实施例18：环二肽的制备
2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA加适量乙酸乙酯溶解，使用5％Na2CO3洗涤至PH 7-8，除去溶剂，再加入20ml甲醇，加热回流72h，减压除去大部分甲醇，加入冰冷的30ml无水乙醚，立即放冰箱中快速冷却至-5℃冷藏3h，过滤，用少量无水乙醚洗涤滤饼，真空干燥得白色粉末，产率：71.3％。
实施例19：环三肽的制备
取实施例10所得(Leu)3-OCH3 3.2mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,过滤浓缩,得白色固体，将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：32.9％。
实施例20：环四肽的制备
取实施例9所得Boc-(Leu)4-OCH3 3.8mmol于圆底烧瓶中,用30ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃,然后加入10ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋干溶剂,得到白色固体,再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,过滤浓缩,得白色固体，再将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：30.7％。
实施例21：环五肽的制备
取实施例14所得(Leu)5-OCH3 3mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,过滤浓缩,得白色固体，将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：31.1％。
实施例22：环六肽的制备
取实施例16所得(Leu)6-OCH3 3mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,过滤浓缩,得白色固体，将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：28.0％。
实施例23：环七肽的制备
取实施例15所得Boc-(Leu)7-OCH3 3mmol于圆底烧瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃,然后加入5ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋干溶剂,得到白色固体，再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下4h, 点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,过滤浓缩,得白色固体，将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：28.2％。
实施例24：环八肽的制备
取实施例17所得Boc-(Leu)8-OCH3 3mmol于圆底烧瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷却到0℃,然后加入5ml三氟醋酸,在0℃反应2h,反应结束后,在减压下旋干溶剂,得到白色固体，再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后让其在室温下3h,点板至原料点消失,加HCl调PH 7-8,停止反应旋去甲醇。在冰浴下加HCl调PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,过滤浓缩,得白色固体，并将其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常温搅拌反应36h。减压浓缩除去溶剂，在残余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相。经硅胶柱层析纯化，产率：27.2％。
实施例25：抗炎活性的测定
a：实验方法
SD大鼠，体重180-200g，雌雄各半，按右后足周长长度分组，每组6只。分为模型组，样品组(每组给药0.2g)和扶他林组(0.2g)。于每只大鼠右后足趾部皮下注射1％角叉菜胶溶液0.1ml致炎，致炎半小时后，按上述各组剂量将药物均匀涂抹于右后足趾部，于给药0.5，1，2，3，4.5h后分别测量右后足的周长。计算致炎前后的右后足周长差值，再计算足肿胀率，结果见表1。
表1各组化合物角叉菜胶致炎后大鼠足肿胀
*P<0.05 **P<0.01与模型组相比
注：组合物1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；组合物2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；组合物3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；组合物4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)。
b、结论：
结果显示：给药后，样品组和扶他林组都有显著的抗炎活性，化合物A～G单独使用时，抗炎活性较弱且低于扶他林组。当7个化合物组合使用时，抗炎活性较强且强于扶他林组，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的比例范围内活性更好，显示协同作用效果。
实施例26：抗菌活性的测定
a：细菌培养
金黄色葡萄球菌(MRSA、MSSA)、表皮葡萄球菌(MRSE、MSSE)、枯草芽孢杆菌、 粪肠球菌、大肠杆菌、弗氏志贺菌、肺炎克雷伯氏杆菌、普通变形杆菌、伤寒沙门杆菌和铜绿假单胞菌在Mueller-Hinto(M-H)肉汤培养基中过夜培养并稀释使其接种量控制为105-106CFU。
肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌在含5％去纤维羊血的M-H肉汤培养基中过夜培养并稀释使接种量控制为105-106CFU。
b：方法
抗菌活性的测定采用世界卫生组织推荐的琼脂稀释法。药物浓度采用连续倍数稀释法，加入到50-60℃M-H琼脂中混合均匀。上述稀释后的实验菌悬液用多头接种仪接种于含不同浓度化合物的培养皿中，在35℃培养18-24小时。其中稀释后的肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌加入到含5％去纤维羊血的M-H琼脂中，在5％CO2、35℃培养18-24小时。
肉眼观察结果，抑制实验细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)，结果见表1。
表2临床分离菌株的最小抑菌浓度(μg/ml)
注：1：化合物A；2:化合物B；3:化合物C；4:化合物D；5:化合物E；6:化合物F；7:化合物G；8：组合物1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；9：组合物2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；10：组合物3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；11：组合物4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)；12：替考拉宁；13：氧氟沙星。
c：结论
结果显示：给药后，化合物A～G和他们的组合物对多种临床分离菌株均有抗菌作用，化合物A～G单独使用时，抗菌活性较弱且低于替考拉宁、氧氟沙星。当7个化合物组合使用时，抗菌活性显著增加且强于替考拉宁、氧氟沙星，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的比例范围内活性更好，显示协同作用效果。
实施例27：片剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按3:30:16:1:35:1:4比例混合，共50g，粉碎后过80目筛，与淀粉100g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材，干燥后加入硬脂酸镁1g，干淀粉10g混匀后，总重量共计171g，制成1000片。
实施例28：胶囊剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按2:33:15:3:32:1:5比例混合，共50g，粉碎后过80目筛，与淀粉100g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材，用20目筛制粒后，置60℃-70℃干燥后于18目筛整粒，套入1号空心胶囊中，共装1000粒。
实施例29：丸剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按3:28:14:2:33:1:3比例混合，共50g，粉碎后过100-120目筛，适量蜂蜜作黏合剂制成丸。
实施例30：颗粒剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按3:30:16:1:35:1:4比例混合，共50g，粉碎后过80目筛，加10％淀粉浆制成软材，用20目筛制粒后，置60℃-70℃干燥后于18目筛整粒，分装，密封，包装既得。
实施例31：注射剂的制备
其中注射剂包括小针剂、粉针剂、大输液。
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按 5:28:16:1:35:1:5比例混合，共20g，加入甘露醇30g，加入乙醇5Kg、甘油1Kg和丙二醇4Kg，过滤除菌，分装1000瓶，灌封，灭菌即得小针剂。
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混合，共10g，加入右旋糖酐20 30g，加水20L，溶解，过滤除菌，分装1000瓶，冷冻干燥，得粉针剂。
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混合，共50g，加入乙醇2Kg、丙二醇3Kg、甘油2Kg、聚乙二醇5Kg溶解，加入氯化钠900g、注射用水100Kg，溶解、混匀，过滤除菌，分装1000瓶，灌装，灭菌即得大输液。
实施例32：滴眼剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按4:28:15:1:33:1:4比例混合，共0.5g，溶解于适量注射用水中，加入甘油15g，丙二醇13g，磷酸氢二钠2g，EDTA 0.1g，羟苯乙酯0.3g，搅拌溶解，用注射用水补全量至1000g，微孔滤膜过滤，分装容器中，封口，得成品。
实施例33：眼用凝胶剂的制备
取上述实施例1～3任一方法或实施例4～24方法所得的化合物A～G，按5:32:18:3:35:1:5比例混合，共0.5g，加入甘油15g，丙二醇13g，磷酸氢二钠2g，EDTA0.1g，羟苯乙酯0.3g，溶解于适量注射用水中，加入溶胀后的1％羟丙甲纤维素400g中搅拌，用注射用水补全量至1000g，微孔滤膜过滤，分装容器中，封口，得成品。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。