本发明涉及一种分离纯化邻羟基化合物的方法，尤其涉及一种基于温敏型嵌段聚合物的双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物的方法，属于天然产物分离纯化领域。
背景技术：
作为一类重要的天然产物，天然邻羟基化合物（如多糖，花青素，原花青素等）以其良好的抗氧化、抗癌及防衰老性能而备关注，因此被广泛应用于医药保健领域。当前在工业生产中广泛使用的分离提纯方法为有机溶剂萃取法。但是该方法过程中大量使用有机溶剂，必然会导致较高的物耗与严重的环境污染。更重要的是，大量有机溶剂使用可能会对天然邻羟基化合物的结构造成某些不可逆的损害，从而导致其变性与特殊生理作用的丧失。因此，寻找一种经济、绿色和高效的天然邻羟基化合物的新型分离纯化方法就显得非常重。
双水相浮选是在双水相萃取和溶剂浮选技术的基础上发展起来的一种新型的分离纯化技术。相较于传统有机溶剂萃取、双水相萃取以及溶剂浮选技术，双水相浮选技术具有环境友好、溶剂用量少、富集倍数和分离效率高的优点，在分离纯化领域展现了十分诱人的应用前景。目前，国内外有关双水相萃取的文献报道很多，而对双水相浮选的研究报道很少。对于已经报道的双水相浮选研究，主要是基于发酵液或是浸提液中目标物自身的憎水性或表面活性差异直接进行浮选分离，适用面窄，选择性不佳。
从天然产物提取料液中选择性浮选分离水溶性目标产品长期以来一直是双水相浮选分离的技术难点，限制了这一技术在水溶性天然产物分离纯化领域的应用，浮选捕集剂对于实现这一目标至关重要，合适的补集剂可以与目标物结合，基于补集剂的表面活性，不具备疏水性或表面活性的目标物就可以被双水相浮选体系成功浮选分离。众所周知，作为一种亲水性极强的染料，茜素红在水中具有良好的溶解性，所以，在正丙醇—盐双水相浮选体系中，大部分茜素红更倾向于分配在水相中，而目前也未见报道合适高效的补集剂运用于浮选茜素红，因此无法达到理想的浮选分离茜素红的效果。本发明中合成一种苯硼酸功能化嵌段聚合物PEO20PPO60PEO20，以这种苯硼酸功能化聚合物作为浮选捕集剂：一方面苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20中的硼酸基团可与茜素红有效结合；同时，改性PEO20PPO60PEO20作为一种表面活性剂其疏水嵌段PPO可以在疏水性气泡界面有效吸附。茜素红分子在捕集剂的作用下形成了具有表面活性的复合物，最终成功实现了水溶性茜素红的浮选分离。这一研究工作的成功开展为后续亲水性较强的邻羟基化合物的选择性浮选分离奠定了基础，具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服传统有机溶剂萃取、双水相萃取和溶剂浮选技术物耗大、效率低、污染大和破坏生物活性等缺点，并解决从天然产物提取料液中难以选择性浮选分离水溶性目标的问题，提供一种以温敏型嵌段聚合物为捕集剂的双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物的方法，实现模型化合物水溶性茜素红的浮选分离。该方法具有富集倍数大、分离效率高、环境友好和溶剂用量少等优点。
本发明的技术方案概述如下：
一种分离纯化邻羟基化合物的方法，按照下述步骤进行：
（1）向50 mL比色管中加入一定量的茜素红以及K2HPO4，接着加入一定量的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量到一定值并开始浮选。一段时间后，体系分为两相。
其中，茜素红加入量为0.1-1 mg，K2HPO4量为8-16 g，苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20量为0.05-0.4 g；气体流速为5-25 mL/min；浮选时间为10-50 min。
其中，所述的硼酸功能化PEO20PPO60PEO20的合成方法按照如下步骤进行：
将间羧基苯硼酸加入一定量的二氯甲烷中，充分溶解后向其中加入草酰氯，并滴加少量N,N-二甲基甲酰胺以引发反应；所得溶液在固定温度下搅拌反应一段时间，接着减压旋转蒸馏除去溶剂得到黄色液态产物，即3-甲酰氯苯硼酸；将全部产物3-甲酰氯苯硼酸溶于一定量的二氯甲烷中得到溶液A；将PEO20PPO60PEO20溶于一定量的二氯甲烷中，并向其中加入三乙胺得到溶液B；接着在冰水浴冷却下，将溶液A滴入溶液B中；滴加完全后撤去冰水浴，混合溶液体系在固定温度下搅拌反应一段时间；接着减压旋转蒸馏除除去溶剂，向体系中加入水，并加热分相，收集下相干燥可得产品。
其中，所述的间羧基苯硼酸与二氯甲烷的用量为0.12g：5-30mL；
所述间羧基苯硼酸与草酰氯、N,N-二甲基甲酰胺的用量比例为0.12g：124μL：1-20 滴；
所述溶液搅拌反应为15-40 ℃，反应2-13 h；
所述溶解3-甲酰氯苯硼酸的二氯甲烷的为5-30mL，优选为3-甲酰氯苯硼酸与二氯甲烷用量为0.12g：17.5mL；
所述溶解PEO20PPO60PEO20的二氯甲烷与PEO20PPO60PEO20、三乙胺的用量为5-60mL：0.50 g：150 μL；
所述溶液A与溶液B的体积比为1:2；
所述混合溶液体系搅拌反应为15-40 ℃反应2-13 h。
（2）分相后，记录上相体积并测定其中茜素红浓度。茜素红浓度测量方法如下：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度。最后计算茜素红的回收率。
其中，茜素红回收率计算如下：
E = CTVT/Mb
式中，E——茜素红回收率；
CT——浮选后上相中的茜素红浓度；
VT——浮选后上相体积。
Mb——向浮选体系中加入的茜素红的总量。
（3）在最优化的浮选条件下，进行对比试验：分别对不加入捕集剂和加入0.3 g的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20两种体系进行浮选，得到两种体系中茜素红回收率，以此对比浮选效果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明建立了双水相浮选体系浮选分离邻羟基化合物茜素红。由于该模型化合物茜素红不具备疏水性与表面活性，很难从浮选体系中分离出，本发明加入了合成的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为补集剂，可与茜素红有效结合，同时，功能化PEO20PPO60PEO20作为一种表面活性剂其疏水嵌段PPO可以在疏水性气泡界面有效吸附，实现了水溶性茜素红的浮选分离。这样得到的茜素红富集倍数大，纯度高，非常有利于提高产品的收率。
（2）本发明使用双水相浮选法分离邻羟基化合物，与传统有机溶剂萃取法相比，浮选不需要使用大量的有机溶剂，更重要的是避免对天然邻羟基化合物的结构造成某些不可逆的损害，从而保护了其性质与特殊生理作用不被破坏。
（3）本发明采用正丙醇—K2HPO4双水相浮选，两相组成均具有绿色环保、保护目标天然产物活性、成本低的优点，这种简单方便的体系和操作方法也有利于放大生产。
（4）本发明采用碱性盐K2HPO4作为成相物质，随着K2HPO4加入量的提高，盐析作用增强，体系分相完全得到更大的上相体积，且K2HPO4浓度的增大使得溶液pH值升高，更有利于捕集剂-茜素红复合物的生成，由此可获得更高的茜素红的回收率。
（5）本发明考虑到浮选体系的浮选效果会随着浮选时间的延长而提升的效果以及考虑到时间成本，考察了10-50 min不同时间的浮选效果，在40 min内可得到最大的茜素红回收率，选择该浮选时间既能得到最好浮选效果又节约了时间。相比于一般双水相萃取，选择该浮选体系所需时间较短，效率更高。
附图说明
图1是苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20 H1NMR图。
具体实施方式
下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本发明的保护范围。
下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
实施例1：苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20的合成
将0.12 g间羧基苯硼酸加入17.50 mL二氯甲烷中，充分溶解后向其中加入124 μL草酰氯，并滴加4滴N,N-二甲基甲酰胺以引发反应。所得溶液在室温下搅拌反应12 h，接着减压旋转蒸馏除去溶剂得到黄色液态产物即3-甲酰氯苯硼酸0.12 g。将0.12 g产物3-甲酰氯苯硼酸溶于17.50 mL二氯甲烷中得到溶液A；将0.50 g PEO20PPO60PEO20溶于35.00 mL二氯甲烷中，并向其中加入150 μL三乙胺得到溶液B。接着在冰水浴冷却下，将全部17.50 mL溶液A滴入35.00 mL溶液B中。滴加完全后撤去冰水浴，体系在室温下搅拌反应12 h。接着减压旋转蒸馏除除去溶剂，向体系中加入5 mL水，并加热分相。收集下相干燥得苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20产品。
该实施例下得到的产物H1NMR图如图1所示，由图可知，苯硼酸基团对应的氢证实了苯硼酸基团的成功引入。
（2）苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20的性能鉴定：
浊点测定：分别向两个25.00 mL比色管中加入0.10 g的PEO20PPO60PEO20和0.10 g功能化PEO20PPO60PEO20，与10 mg山梨醇（一种邻二羟基化合物），向比色管中加入一定量的蒸馏水，使体系总质量达到20 g。将溶液充分混合摇匀后，再调节溶液pH至8。用浊度法测得PEO20PPO60PEO20浊点为58.1 ℃，用浊度法和紫外法分别测得功能化PEO20PPO60PEO20的浊点为42.4 ℃和41.8 ℃。可以发现，PEO20PPO60PEO20的浊点不受山梨醇加入量的影响，而两种浊点测量方法结果基本一致，都显示了改性后的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20的浊点随山梨醇加入量的增加发生了显著的升高；该结果也证实了硼酸基团的成功引入。
盐析实验：分别向两个5.00 mL比色瓶中加入0.20 g PEO20PPO60PEO20和0.20 g功能化PEO20PPO60PEO20，并加入适量蒸馏水使体系总质量达到2.00 g。接着向体系中加入一定量的K2HPO4，使体系中K2HPO4终浓度为30%，充分震荡体系，待K2HPO4完全溶解后，将体系静置15min后，观察到PEO20PPO60PEO20没有析出，而功能化PEO20PPO60PEO20有大量析出。说明此时功能化PEO20PPO60PEO20受盐浓度影响，析出效果很好，疏水性很强；两种聚合物不同析出情况也证明了苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20的成功改性。
实施例2：双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物
（1）向50 mL比色管中加入0.1 mg茜素红以及8 g的K2HPO4，接着加入
0.05g实施例1中制备的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量至5 mL/min并开始浮选。10 min后，体系分为两相。
（2）待分相后，记录上相体积为2.9 mL，并用如下方法测定茜素红浓度：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度为0.0104 mg/mL。最后计算茜素红的回收率为30.2%。
实施例3：双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物
（1）向50 mL比色管中加入1 mg茜素红以及16 g的K2HPO4，接着加入
0.4 g实施例1中制备的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量至25 mL/min并开始浮选。50 min后，体系分为两相。
（2）待分相后，记录上相体积为4.1 mL，并用如下方法测定茜素红浓度：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度为0.1310 mg/mL。最后计算茜素红的回收率为53.7%。
实施例4：双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物
（1）向50 mL比色管中加入0.2 mg茜素红以及12 g的K2HPO4，接着加入
0.3 g实施例1中制备的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量至15 mL/min并开始浮选。50 min后，体系分为两相。
（2）待分相后，记录上相体积为4.4 mL，并用如下方法测定茜素红浓度：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度为0.0396 mg/mL。最后计算茜素红的回收率为87.1%。
实施例5：双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物
（1）向50 mL比色管中加入0.6 mg茜素红以及12 g的K2HPO4，接着加入
0.3 g实施例1中制备的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量至10 mL/min并开始浮选。40 min后，体系分为两相。
（2）待分相后，记录上相体积为4.4 mL，并用如下方法测定茜素红浓度：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度为0.1252 mg/mL。最后计算茜素红的回收率为91.8%。
实施例6：双水相浮选体系分离纯化邻羟基化合物
（1）向50 mL比色管中加入0.6 mg茜素红以及12 g的K2HPO4，接着加入0.3 g实施例1中制备的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20作为浮选捕集剂并用蒸馏水稀释至50 mL，充分震荡溶液体系混合均匀。所得溶液静置15min后倒入浮选柱中，接着加入5 mL正丙醇，调节气体流量至15 mL/min并开始浮选。40 min后，体系分为两相。
（2）待分相后，记录上相体积为4.0 mL，并用如下方法测定茜素红浓度：取1.00 mL待测样品与9.00 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4）混合于10.00 mL塑料离心管中，充分震荡溶液使其混合均匀。接着以蒸馏水作为空白试剂，并于424nm处测定样品吸光度。重复上述测定三次，并记录其平均值。并根据紫外-可见分光光度法得到茜素红浓度为0.1461 mg/mL。最后计算茜素红的回收率为97%。
（3）在此最优浮选条件下，进行对比试验：分别对不加入捕集剂和加入0.3 g的苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20两种体系进行浮选，得到两种体系中茜素红回收率分别为20%和97%。可以观察到模型化合物茜素红回收率由最初的20%显著提高至97%，表明了浮选捕集剂苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20与茜素红的有效结合，对茜素红的分离回收效果明显，同时也验证了苯硼酸功能化PEO20PPO60PEO20对于亲水性邻二羟基化合物选择性浮选分离的重要意义。