1.一种大量提取细菌质粒的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)筛选获得含有质粒的原核细胞,具体为:
首先,在将目的质粒转化原核细胞后,挑取含有质粒的原核细胞的单菌落接种于含有抗性抗生素的液体培养基中,进行扩大培养;
其次,吸取扩大培养后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固体培养基的平板上,培养过夜;
最后,在平板上加入无菌水和灭菌的玻璃珠摇晃,利用玻璃珠悬起菌落;待培养基中无菌落残留时,将含有菌落的无菌水吸出,置于离心管中,离心弃上清,保留沉淀,即为含有质粒的原核细胞;
(2)裂解细胞,具体为:
向步骤(1)中离心后沉淀中加入溶液I,震荡重悬菌体,静置3~5min;然后加入溶液II ,混匀后,冰上放置3~5min;再加入溶液III,混合均匀,并冰上放置3~5min;
所述溶液I,每升溶液中的组份为:1M Tris-HCL、50mL,0.5M EDTA、20mL,其余为ddH2O,pH=7.5,灭菌;
所述溶液II,每升溶液的配制方法为:0.4M 的NaOH的ddH2O溶液与质量浓度2%的SDS的ddH2O溶液的等体积混合液;
所述溶液III,每升溶液的制备方法为:在600mL的ddH2O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸,溶解并混合均匀后,乙酸调节pH=4.8,然后用ddH2O定容至1L;
(3)提取质粒,具体为:
将步骤(2)中冰上放置后的溶液离心,弃沉淀,取上清液于离心管中,加入氯仿-异戊醇混合液,混合均匀,放置15~25min;
将放置后混合液离心,取上清液置于预先加有无水乙醇的离心管中,离心,弃上清,再用乙醇漂洗沉淀后,即为所提取的质粒。
2.如权利要求1所述提取大量细菌质粒的方法,其特征在于,所述原核细胞为大肠杆菌细胞。
3.如权利要求1所述提取大量细菌质粒的方法,其特征在于,步骤(3)中,离心管中预先加入的无水乙醇的量为上清液2倍体积的量,所加入无水乙醇为-20℃预冷的无水乙醇。
4.如权利要求1所述提取大量细菌质粒的方法,其特征在于,步骤(3)中,所提取的质粒在干燥后,溶于TE缓冲液中,-80℃保存备用。