具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种从枸杞中提取分离得到的具有抗氧化活性的精制多糖及其应用。

背景技术：

枸杞系落叶灌木，果实枸杞子味甘、性平，有滋肾补髓、养肝明目和祛风的作用，是传统滋补中药。枸杞多糖(LBP,Lycium Bar-barum Polysaccharides)是枸杞中重要的有效成分，是研究最多的化学成分之一，具有很好的医药和保健价值。医学研究已经表明，枸杞多糖具有免疫调节、抗氧化、神经保护、降血糖、抗肿瘤等作用。近年来，枸杞多糖已经在临床和保健食品方面有很大应用。

抗氧化是枸杞多糖的一大药理作用，且枸杞多糖的诸多药效都与抗氧化相关。已有研究表明，枸杞多糖在心血管系统、肝脏、生殖系统、神经系统、内分泌系统等方面具有相应的抗氧化作用。因其作用多样性，枸杞多糖的抗氧化在当今研究中亦非常热门，例如ABTS法测抗氧化、羟基自由基清除率测定、DPPH自由基清除活性测验等。其中羟基自由基是一种重要的活性氧，其具有极强的得电子能力也就是氧化能力，而多糖显著的抗氧化能力也吸引着很多人研究其对羟基自由基的清除率，目前已有一些专利报道表明了粗多糖对羟基自由基有明显的清除效果。

但是关于枸杞多糖的进一步纯化和精制未见报道。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，通过大量实验筛选出枸杞精制多糖的制备方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)枸杞精制多糖的提取粗制：

取枸杞加无水乙醇回流进行脱脂，过滤，取脱脂后滤渣，加入超纯水回流提取，取回流提取液，浓缩，浓缩液加乙醇，静置过夜；分离得沉淀物，干燥，得粗多糖；

(2)枸杞精制多糖的脱色脱蛋白：

取步骤(1)制备好的粗多糖，加入体积比为1：1的丙酮-石油醚混合液，在55～65℃回流脱色1～2h，然后过滤得沉淀，烘干，得到脱色的枸杞粗多糖；

取脱色的枸杞粗多糖，加水稀释成糖液置于分液漏斗中，加入三氯甲烷和正丁醇的混合溶液，反复震摇，然后离心收集上层糖液；重复操作以上步骤直至分液漏斗下层无明显沉淀析出，然后烘干得脱色脱蛋白枸杞精制多糖；

(3)枸杞精制多糖的分离纯化：

取步骤(2)脱色脱蛋白枸杞精制多糖溶于蒸馏水中，加样于Cellulose DE－52色谱柱中，先后依次用蒸馏水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl和蒸馏水洗脱，流速为2mL/min，分步收集洗脱液，将收集的洗脱液浓缩后置于透析袋中，放置冰箱里透析，然后取透析袋中多糖，浓缩，冻干，保存；

(4)枸杞精制多糖的酶解：

取步骤(3)得到的多糖，加入α-淀粉酶，加热酶解，得到酶解多糖；

(5)枸杞精制多糖的再分离纯化：

取步骤(4)得到的酶解多糖，上样于Sephadex G－100凝胶色谱柱，用蒸馏水洗脱，分段收集洗脱液，并用苯酚-硫酸法跟踪检测每份洗脱液的糖含量，用酶标仪检测595nm处吸收值，最后根据吸收值绘制总洗脱曲线，收集合并多糖洗脱液，浓缩，冻干，得具有抗氧化活性的枸杞精制多糖。

作为优选方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法，

步骤(2)枸杞精制多糖的脱色脱蛋白：

取步骤(1)制备好的粗多糖，按重量体积比1：10加入体积比为1：1的丙酮-石油醚混合液，在55℃回流脱色1.5h，然后过滤得沉淀，烘干，得到脱色的枸杞粗多糖；

取脱色的枸杞粗多糖，加水配制2％浓度的糖液于分液漏斗中，加入糖液1/5体积的三氯甲烷和糖液1/25体积的正丁醇，反复震摇10min，然后于高速离心机中，以4℃，3500RPM离心15min；收集上层糖液，需要反复10～15次，直至分液漏斗下层无明显沉淀析出，烘干得脱色脱蛋白枸杞精制多糖。

作为优选方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法，步骤(3)枸杞精制多糖的分离纯化：

取步骤(2)脱色脱蛋白枸杞精制多糖溶于蒸馏水中，加样于Cellulose DE－52色谱柱中，先后依次用蒸馏水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl和蒸馏水洗脱，流速为2mL/min，收集0.25mol/LNaCl洗脱下来的酸性多糖，将酸性多糖洗脱液浓缩后置于透析袋中，放置于4℃冰箱里透析72h，然后取透析袋中多糖，浓缩，冻干。

作为优选方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法，步骤(4)枸杞精制多糖的酶解：

取步骤(3)得到的多糖，加入α-淀粉酶溶液，先加热至在50℃水解1.5小时，然后升温至80℃水解20～30min，得到酶解多糖。

本发明制备得到的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖在制备抗氧化保健品或药品中的应用。

可将本发明提供的枸杞精制多糖和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或口服液等制剂。

有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：

本发明通过大量实验筛选出最佳的枸杞精制多糖的制备工艺，方法包含枸杞多糖的提取粗制、枸杞多糖的脱色脱蛋白、枸杞多糖的分离纯化、枸杞多糖的酶解、枸杞多糖的再分离纯化等步骤，制备得到的枸杞多糖经过ABTS法测抗氧化、羟基自由基清除率测定、DPPH自由基清除活性等测验表明，本发明制备得到的枸杞精制多糖具有很好的抗氧化活性，尤其对羟基自由基清除有显著效果。

附图说明

图1为各实验组ABTS法测总抗氧化曲线图；

图2为各实验组羟基自由基清除率曲线图；

图3为各实验组DPPH自由基清除率曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将枸杞以每100g加入300ml体积浓度80％乙醇回流水浴(80℃)2h，过滤取滤渣，重复2次。而后向滤渣中以每100g加入1000ml超纯水回流水浴(100℃)2h，过滤取滤液，重复1次，并合并滤液。将滤液浓缩至总体积的五分之一，用乙醇醇沉并静置过夜，取沉淀物，而后用乙醇、丙酮充分脱水，最后置于烘箱中干燥若干小时得粗多糖。

(2)枸杞多糖的脱色：

取步骤(1)制备好的粗多糖，按比例1：10(W：V)加入丙酮-石油醚(以1：1体积比混合)混合液，于55℃回流脱色1.5h，过滤得沉淀，于真空干燥箱内烘干，得到脱色的枸杞粗多糖。

枸杞多糖的脱蛋白：

取脱色的枸杞粗多糖，加水配制2％浓度的糖液于分液漏斗中，加入1/5体积的三氯甲烷，1/25体积的正丁醇，反复震摇10min，然后于高速离心机中，以4℃，3500RPM离心15min。收集上层糖液，反复14次以上，直至下层无明显沉淀析出。用BCA法测蛋白质含量，与原液进行比较。

(3)枸杞多糖的分离纯化：

取脱蛋白枸杞粗多糖粉末溶于蒸馏水中，硫酸-苯酚法测量其糖含量，根据柱体积计算上样量。然后加样于Cellulose DE－52色谱柱中，洗脱液先后依次为蒸馏水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl、蒸馏水，流速为2mL/min，分步收集洗脱液，每管约收集洗脱液10mL，用苯酚-硫酸法跟踪检测每一管的糖含量，用酶标仪检测595nm处吸收值，最后根据吸收值绘制总洗脱曲线，收集0.25mol/LNaCl洗脱下来的酸性多糖，将收集的洗脱液浓缩至适当体积并置于透析袋中放置在4℃冰箱里透析72h，每天换水三次，浓缩，冻干保存。

(4)枸杞多糖的酶解：

取步骤(3)得到的多糖，分别加入α-淀粉酶溶液溶液，然后先加热至在50℃水解1.5小时，然后升温至80℃水解30min，分别得到α-淀粉酶的酶解多糖。

α-淀粉酶溶液的制备：称取10mgα-淀粉酶溶解于10ml 0.2M PH6.9PBS缓冲液(PBS制备：0.312g磷酸二氢钠溶于10ml水中得A液，0.12g磷酸氢二钠溶于10ml水中得B液，A液4.5ml+B液5.5ml混匀)；

(5)枸杞多糖的再分离纯化：

分别取α-淀粉酶酶解多糖，用硫酸苯酚法测其糖含量，计算其上样量后，上样于Sephadex G－100凝胶色谱柱，将洗脱液蒸馏水置于超声波清洗机中脱气，然后用其洗脱，流速为0.5mL/min，分步收集洗脱液，每管约收集2mL，用苯酚-硫酸法跟踪检测每一管的糖含量，用酶标仪检测595nm处吸收值，最后根据吸收值绘制总洗脱曲线，收集合并多糖洗脱液，浓缩，冻干，得具有抗氧化活性的枸杞精制多糖。

实施例2ABTS法测总抗氧化

总抗氧化能力检验试剂盒(ABTS法)中一共包括三种试剂-ABTS溶液、氧化剂溶液和Trolox溶液(10mM),其中ABTS溶液和氧化剂溶液分别为1ml，Trolox溶液(10mM)为0.5ml。

实验前准备：

(1)ABTS工作液的配制：通过参考说明书，根据待测样品的数量，各取ABTS溶液和氧化剂溶液100μl混合均匀即为ABTS工作母液(绿色)室温存放12-16h后即可使用，此时还不能直接使用，需要用PBS稀释一定的倍数，使得ABTS工作液的吸光度减去PBS的空白吸光度后A734在0.65-0.75之间，通过实验，稀释35倍后吸光度在适合范围之内，此时的ABTS溶液即可作为工作液来使用；

(2)标准曲线的制备：用PBS将原Trolox溶液(10mM)分别稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM；

(3)样品准备:

精密称取待测样品：实施例1得到的精制多糖(α+C)和实施例1步骤(1)制备得到的枸杞粗多糖(C)溶解于适量超纯水中，再稀释至所需浓度。

基本步骤：

(1)使用96孔板，在每个检测孔中加200μl ABTS工作液；

(2)空白对照孔中加入10μl PBS，标准曲线检测孔中依次加入不同浓度的Trolox溶液10μl，样品检测孔中依次加入不同浓度的样品溶液，加完样后轻轻摇匀；

(3)室温放置2-6min后测定A734，平行测定两次取平均值

实验结果如图1所示，本发明精制多糖均在极少量含量下具备抗氧化能力，且随浓度提高，清除率提高。

实施例3羟基自由基清除率测定：

在反应体系中分别加入100μl9mM硫酸亚铁溶液、100μl9mM水杨酸-乙醇溶液和100μl待测样品溶液(实施例1得到的精制多糖α+C和实施例1步骤(1)制备得到的枸杞粗多糖C)，最后加入8.8mM双氧水启动反应，混合均匀后于37℃水浴60min，水浴完取出于510nm处测得吸光度A，空白孔中将待测样品改成水，其他条件都不变，510nm处测吸光度A0，由于多糖本身也具有吸光度，所以在实验过程中检测了每个样品相应的对照孔，在孔内分别加入不同浓度的样品以及8.8mM H₂O₂、9mM的硫酸亚铁、9mM水杨酸-乙醇溶液等体积的超纯水作为对照，测得510nm处的吸光度Ax。

样品对羟基自由基的清除率用以下公式表示：R(％)＝[1-(A-Ax)/A0]*100％

实验结果如图2所示，检测得出本发明制备得到的精制多糖与粗多糖相比自由基清除率效果大大提高，其抗氧化活性大大提高，在含量很低的情况下即可达到100％的清除率，显示出了非常好的抗氧化活性。

实施例4DPPH自由基清除活性试验：

实验前准备：

(1)0.4mMDPPH溶液配制：精密称取0.0158gDPPH粉末于100ml容量瓶中，加入95％乙醇至容量瓶刻度，充分溶解，溶解完全之后分装到离心管中，并用铝箔纸包装密封好，放于4℃冰箱中避光保存，待用；

(2)待测样品溶液的配制：精密称取待测样品(实施例1得到的精制多糖α+C)溶解于适量超纯水中，再稀释至所需浓度。

加样表

DPPH组、样品组、空白组所测得的吸光度分别表示为A1、A2、A0

样品对DPPH自由基的清除率用以下公式表示：R(％)＝[1-(A2-A0)/A1]*100％

实验结果如图3所示，本发明精制多糖对于DPPH自由基有很好的清除作用。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。