一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法与流程

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。
背景技术：
：神经母细胞瘤是发生于交感神经节的恶性肿瘤，由未分化的神经母细胞组成，主要起源于肾上腺髓质、腹膜后、后纵隔，盆腔及颈部交感神经节。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，40％神经母细胞瘤病例在就诊时存在肿瘤转移。研究发现，病人的诊断年龄、疾病程度以及基因改变都影响了神经母细胞瘤的治疗效果。神经母细胞瘤具有很强的异质性，可在不经治疗的情况下自行消退，也可表现极具侵袭的恶性表型，对多种治疗手段没有反应而迅速恶化，因此对神经母细胞瘤的早期诊断十分必要。目前神经母细胞瘤的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前采用RT-PCR方法检测神经母细胞瘤CTCs的标准还没有完全建立。我们通过检测神经母细胞瘤患者的CTCs特征基因，确定神经母细胞瘤CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物,包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测方法，通过联合检测PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT19个基因实现肿瘤的早期检测。本发明设计和运用靶点特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到98％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测神经母细胞瘤的引物组，包含：本发明的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。方法1：PCR方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于神经母细胞瘤早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT1基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测可使神经母细胞瘤检出率达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非神经母细胞瘤病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中非神经母细胞瘤患者外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中非神经母细胞瘤患者癌组织样本检测阴性PCR图。图4为实施例中神经母细胞瘤患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中神经母细胞瘤患者骨髓检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.B2M；2.PHOX2B；3.TH；4.CGA；5.DDC；6.DCX；7.MYCN；8.CCND1；9.ISL1；10.B4GALNT1。具体实施方式本发明针对目前神经母细胞瘤中的肿瘤驱动基因，通过联合检测PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT19个基因实现神经母细胞瘤的早期检测。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司等公司合成。下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-30％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。SusanA.Burchill等人(VipreyVF,GregoryWM,CorriasMV,etal.NeuroblastomamRNAspredictoutcomeinchildrenwithstage4neuroblastoma:aEuropeanHR-NBL1/SIOPENstudy[J].Journalofclinicaloncology,2014:JCO.2013.53.3604.)同时检测PHOX2B、TH、DCX基因，结果表明联合检测三个基因用于神经母细胞瘤早期诊断的敏感度为68％。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对神经母细胞瘤和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT1组成的基因组对神经母细胞瘤具有较高的检出率，达到98％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。实施例2:引物筛选(1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-I序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR检测引物(2)外周血样品的处理收集上海复旦儿科医院收治并经病理证实的神经母细胞瘤患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4小时。2.1将抗凝管中的全血样本加入等体积PBS(pH7.0)，于室温3000rpm离心5min，去除上层血浆；2.2向保留液体中，加入等体积氯化铵红细胞裂解液(可购自碧云天)，于室温200rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；2.3将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分离液，混合液与Ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；2.4吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混匀；3.2将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；3.3加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；3.4将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.5在RNeasyMinElute离心柱中加入700μLBufferRW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.6在RNeasyMinElute离心柱中加入500μLBufferRPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.7将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；3.8将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。(4)模板cDNA的获得4.1准确测得样品RNA浓度；4.2严格按照cDNA反转录试剂盒说明书在冰上制备反转录体系；成分体积5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；(5)普通PCR扩增用TaqDNA聚合酶配置反应体系，用引物为a-i和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物用1％凝胶检测；扩增体系成分体积2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。(6)荧光实时定量PCR扩增根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：成分体积2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；根据步骤5和6的PCR结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测神经母细胞瘤的引物组。实施例3：效果验证根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对100个肿瘤样本进行检测。序号多基因联合检测检出率1PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX70％2PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN72％3PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND176％4PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL179％5PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1、B4GALNT198％6PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1、CK883％7PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1、CK1881％8PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1、CK1981％9PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、、ISL1、CK2079％其中，CK8的正向引物为CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物为GTTGGCAATATCCTCGTACT；CK18的正向引物为GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物为CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；CK19的正向引物为AGCTGGCCTACCTGAAGAAG，反向引物为AGGCTTCAGCATCCTTCCGG；CK20的正向引物为GAAGAACTGAATAAAGACCT，反向引物为AAGGTTCTTCTGGGCCATGA。1～9号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～9号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6～9号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于神经母细胞瘤的检测。进一步通过研究发现，5号引物组中，作为原癌基因的MYCN在大部分肿瘤尤其是神经母细胞瘤中存在拷贝数的改变，PHOX2B和ISL1作为转录因子参与了肿瘤细胞生长因子受体等表达水平的改变，TH和DDC特异地参与神经细胞内多巴胺的合成，CCND1参与调控神经母细胞瘤的细胞周期，DCX作为细胞骨架相关蛋白影响肿瘤细胞的迁移，CGA存在于绝大多数神经内分细胞中，B4GALNT1作为糖基化酶调控了神经母细胞瘤细胞表面特异性标志物GD2的糖基化水平。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技术效果。综上所述，本专利中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出神经母细胞瘤的细胞生物学特征。实施例4：特异性分析根据实施例2的筛选结果，采用所述的引物组对正常人外周血样本、非神经母细胞瘤病人的外周血和肿瘤组织样本、神经母细胞瘤病人的外周血和骨髓样本进行检测。图中1-10基因分别为：1.B2M；2.PHOX2B；3.TH；4.CGA；5.DDC；6.DCX；7.MYCN；8.CCND1；9.ISL1；10.B4GALNT1。检测结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非神经母细胞瘤病人的外周血(图2)和肿瘤组织样本(图3)中均未检测到相应基因的表达。在神经母细胞瘤病人的外周血(图4)和骨髓样本中可检测到多个基因的表达(图5)，分别为7/9和9/9，说明本发明中所述引物组具有高度的特异性。当前第1页1 2 3