一种胰蛋白酶制备方法与流程

本发明属于生物领域，更具体地讲，涉及一种胰蛋白酶制备方法。
背景技术：
：胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一种应用广泛的蛋白水解酶，通过识别精氨酸或者赖氨酸等侧链上的正电荷，特异性水解其羧基端的肽键，是一种肽链内切酶。根据带点性质的不同可分为阳离子型胰蛋白酶，阴离子型胰蛋白酶，中性胰蛋白酶。胰蛋白酶主要用于糜蛋白酶原，羧肽酶原等的激活。Orsolyakiraly等开始在大肠杆菌中表达人阳离子型胰蛋白酶原，Vasquez等人利用pho前导序列在大肠杆菌周质中表达了具有活性的小鼠胰蛋白酶，但是产量很低，Buswell等人通过该方法复性了重组的牛胰蛋白酶取得了较好的效果，提高了复性率。另外HubertusHohenblum等人也通过相似的方法成功地复性了重组人胰蛋白酶原。现有方法中，胰蛋白酶的来源是动物脏器提取，胰蛋白酶原的激活方式是胰蛋白酶的自我激活，这些方法要么是有潜在的被污染的可能，要么是激活方式不可控。另外，现有方法胰蛋白酶产量较低，均一性有待提高。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种能够人为可控的激活胰蛋白酶和提高胰蛋白酶均一性的胰蛋白酶制备方法。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种胰蛋白酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胰蛋白酶表达载体的克隆构建：利用Psumo3-AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸；(2)过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体；(3)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的清洗、溶解；(4)胰蛋白酶融合蛋白包涵体的复性：复性液的组分为1.5-2.5M尿素(Urea)，30-100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)PH8.5,10-20mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，1-5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)；(5)胰蛋白酶的激活和纯化：充分复性后，经阳离子交换层析纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3-trypsin，经过Sumo特异性蛋白酶2切去Sumo3标签蛋白，经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶。作为一个优选方案，所述复性液还包括10-50mM氯化钙。作为一个优选方案，所述复性液的组分为2M尿素，50mM三羟甲基氨基甲烷PH8.5，15mM还原型谷胱甘肽或者半胱氨酸，1mM氧化型谷胱甘肽或者胱氨酸，50mM氯化钙。作为一个优选方案，所述胰蛋白酶种属来源为人源、猪源、牛源或鼠源。作为一个优选方案，所述连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸是指连接胰蛋白酶氨基酸序列第24位到最后一位氨基酸的野生型全长形式，或者第24位到最后一位氨基酸之前的任意截短形式，以及全长形式和截短形式对应的氨基酸任意突变形式。Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸是指取Sumo3标签蛋白1-92位氨基酸与胰蛋白酶的第24位至最后一位或保留胰蛋白酶活性的最后一位氨基酸连接。比如取Sumo3标签蛋白1-92位氨基酸与人源胰蛋白酶的第24-247位氨基酸的连接。本文所述Sumo3标签蛋白，胰蛋白酶氨基酸的编号方式参考Uniport，本文使用的Sumo3标签蛋白基于Uniport中氨基酸序列稍作改变，本文使用的胰蛋白酶均指阳离子型胰蛋白酶。将克隆完成的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)等菌株中，培养细菌，在OD600为0.8-1时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导过表达形成包涵体蛋白。破碎细菌，提取胰蛋白酶融合蛋白包涵体。在依次经过缓冲液A(10mMTrispH7.4，150mMNacl，1％Triton-X100,10mMEDTA)，缓冲液B(10mMTrispH7.4，150mMNacl，10mMEDTA)洗涤后，将包涵体溶解到8M盐酸胍，10mMDTT中，最后滴加到不断搅拌的复性液中复性。在4摄氏度静置24-48小时充分复性后，用1M冰醋酸将复性液的pH值调节到6，经阳离子交换层析法纯化出正确折叠的融合蛋白Sumo3-trypsin(胰蛋白酶),经过Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切去Sumo3标签蛋白。最后经过镍亲和层析纯化出有生物活性的胰蛋白酶。本发明的优点在于：(1)传统的胰蛋白酶的主要来源于动物脏器，缺点是原料成分复杂，易收到病毒等污染。本技术是利用基因工程原理，表达重组的胰蛋白酶，原料来源明确，蛋白质量可控；(2)现有的重组胰蛋白酶激活方法主要是胰蛋白酶原的自我激活，这种激活方式是一种级联放大反应，激活过程很难控制，本技术采用的是Sumo3融合蛋白的形式，经特异性高的Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切除Sumo3标签得到有生物活性的胰蛋白酶，本方法中胰蛋白酶的激活速率可控，折叠效率高且所得蛋白均一性好。附图说明图1是本发明的胰蛋白酶制备的总体流程图。图2是本发明的Sumo3标签蛋白与野生型人源胰蛋白酶连接方式示意图。图3是尿素浓度对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的复性效果影响示意图。图4a是本发明的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白阳离子交换层析峰谱图。图4b是本发明的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白阳离子交换层析蛋白质电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1.野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的克隆构建借助商业化的Psumo3-AMP载体克隆质粒，该DNA序列翻译形成的蛋白序列特征是：Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸(Sumo3标签蛋白1-92序列如SEQIDNO.1所示)，胰蛋白酶可以是不同种属来源的，比如常用的人源，猪源，牛源，鼠源等。胰蛋白酶氨基酸序列包括第24位到最后一位氨基酸的野生型全长形式，包括第24位到最后一位氨基酸之前的任意截短形式，以及全长形式和截短形式对应的氨基酸任意突变形式。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增编码野生型人源胰蛋白酶24-247位氨基酸(人源胰蛋白酶24-247位序列如SEQIDNO.2所示)的核苷酸序列，并在序列两段引入BamH1,Xho1限制性内切酶酶切位点。37℃中，将扩增的核苷酸片段和商业化的Psumo3-AMP载体用10个单位的高保真限制性内切酶酶BamH1-HF,Xho1-HF在37℃处理1小时。然后，利用T4DNA连接酶将编码野生型人源胰蛋白酶24-247位氨基酸的核苷酸序列插入到Psumo3-AMP载体上。最后，利用突变的方法删除载体上第411-413核苷酸序列，即得到用于表达的质粒DNA。SEQIDNO.1：MGHHHHHHGSLQEEKPKEGVKTENDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRFRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGG。SEQIDNO.2：IVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINALVSTISLPTAPPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS。实施例2.尿素浓度对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白复性的影响将溶于8M盐酸胍的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白逐滴加入到以下几组复性液中:恒定量为50mMTrispH8.5,1mMCystine,15mMCysteine,变量为1ML-arginine,0.5MUrea,1MUrea，1.5MUrea，2MUrea，2.5MUrea,，3MUrea。折叠正确的野生型人源胰蛋白酶在激活后会与抗胰蛋白酶(antitrypsin,AT)形成共价复合物，此方法可用于检测胰蛋白酶的活性和复性效果。复性24小时后，检测结果表明：2MUrea是最佳的复性浓度(图3)。实施例3.Cystine-Cysteine的比例对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白复性的影响将溶于8M盐酸胍的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白逐滴加入到以下几组复性液中:恒定量为50mMTrispH8.5,2MUrea,变量为10mMCystine-1mMCysteine，5mMCystine-1mMCysteine，1mMCystine-1mMCysteine，1mMCystine-5mMCysteine，1mMCystine-10mMCysteine，1mMCystine-15mMCysteine，1mMCystine-20mMCysteine，1mMCystine-25mMCysteine。折叠正确的野生型人源胰蛋白酶在激活后会分解Nα-Benzoyl-L-arginineethylesterhydrochloride(BAEE)形成Nα-Benzoyl-L-arginine，该发色基团在253nm处有吸收峰值，单位时间内吸收值的变化即表征胰蛋白酶的活力。结果表明，在1mMCystine-15mMCysteine条件下，胰蛋白酶的活力较高(表1)。表1：Cystine-Cysteine的比例对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白复性的影响Cystine(mM)1051111125Cysteine(mM)111510152025胰蛋白酶活力0.53E‐30.55E‐30.73E‐31.21E‐31.44E‐32.35E‐31.2E‐31.5E‐3实施例4.CaCl2对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白复性的影响将溶于8M盐酸胍的野生型人源胰蛋白酶融合蛋白逐滴加入到以下几组复性液中:恒定量为50mMTrispH8.5,2MUrea,1mMCystine，15mMCysteine，变量是0mMCacl2，10mMCacl2，20mMCacl2，30mMCacl2，40mMCacl2，50mMCacl2，100mMCacl2。参照实例3的方法检测野生型人源胰蛋白酶的活力。结果表明，50mMCacl2条件下胰蛋白酶的活力较高(表2)。表2：Cacl2对野生型人源胰蛋白酶融合蛋白复性的影响Cacl2(mM)1020304050100胰蛋白酶活力2.38E‐32.89E‐33.37E‐33.57E‐34.6E‐33.32E‐3实施例5.野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的纯化用1M冰醋酸将含有野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的复性液的pH值调节到6，浓缩并过滤，经过预平衡的阳离子交换树脂柱(SP-fastflow，GEhealthcare)，用pH6，0.05MNacl到pH6，1MNacl进行梯度洗脱，并收集相应组分。经过SDS-PAGE鉴定各组分中野生型人源胰蛋白酶融合蛋白的含量和纯度(图4a,4b)。在纯度高，含野生型人源胰蛋白酶融合蛋白加入适量SENP2于常温下反应4个小时即可切除Sumo3标签蛋白，最后将反应液通过镍亲和树脂(Ni-fastflow，GEhealthcare)进行最后一步纯化，镍亲和树脂流穿部分即为纯化完成的有生物活性的野生型人源胰蛋白酶。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>上海交通大学医学院<120>一种胰蛋白酶制备方法<130>/<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>102<212>PRT<213>人工合成<400>1MetGlyHisHisHisHisHisHisGlySerLeuGlnGluGluLysPro151015LysGluGlyValLysThrGluAsnAspHisIleAsnLeuLysValAla202530GlyGlnAspGlySerValValGlnPheLysIleLysArgHisThrPro354045LeuSerLysLeuMetLysAlaTyrCysGluArgGlnGlyLeuSerMet505560ArgGlnIleArgPheArgPheAspGlyGlnProIleAsnGluThrAsp65707580ThrProAlaGlnLeuGluMetGluAspGluAspThrIleAspValPhe859095GlnGlnGlnThrGlyGly100<210>2<211>224<212>PRT<213>人工合成<400>2IleValGlyGlyTyrAsnCysGluGluAsnSerValProTyrGlnVal151015SerLeuAsnSerGlyTyrHisPheCysGlyGlySerLeuIleAsnGlu202530GlnTrpValValSerAlaGlyHisCysTyrLysSerArgIleGlnVal354045ArgLeuGlyGluHisAsnIleGluValLeuGluGlyAsnGluGlnPhe505560IleAsnAlaAlaLysIleIleArgHisProGlnTyrAspArgLysThr65707580LeuAsnAsnAspIleMetLeuIleLysLeuSerSerArgAlaValIle859095AsnAlaLeuValSerThrIleSerLeuProThrAlaProProAlaThr100105110GlyThrLysCysLeuIleSerGlyTrpGlyAsnThrAlaSerSerGly115120125AlaAspTyrProAspGluLeuGlnCysLeuAspAlaProValLeuSer130135140GlnAlaLysCysGluAlaSerTyrProGlyLysIleThrSerAsnMet145150155160PheCysValGlyPheLeuGluGlyGlyLysAspSerCysGlnGlyAsp165170175SerGlyGlyProValValCysAsnGlyGlnLeuGlnGlyValValSer180185190TrpGlyAspGlyCysAlaGlnLysAsnLysProGlyValTyrThrLys195200205ValTyrAsnTyrValLysTrpIleLysAsnThrIleAlaAlaAsnSer210215220当前第1页1 2 3