一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法。

背景技术：

流感病毒(Influenza virus,IV)可以在禽类、哺乳动物和人类中引起流行性感冒。流感病毒属于正黏病毒科，病毒根据M和NP蛋白的不同分为甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型和丁(D)型流感病毒。甲型流感病毒根据血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为不同的亚型。目前已知的有18种不同HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)。

甲型流感病毒的研究具有非常重要的公共卫生意义。人的季节性流感主要由甲型H1N1、H3N2亚型流感病毒和乙型流感病毒引起，每年在全球会造成25～50万人的死亡。20世纪以来，甲型流感病毒引发了几次人类流感大流行。第一次也是最具灾难性的一次是发生于1918～1919年的西班牙流感，共导致全球约5000万人死亡。第二次和第三次流感大暴发分别为1957年的亚洲流感和1968年的香港流感。2009年，墨西哥流感迅速蔓延至全球200余个国家和地区，截至2012年造成了全球57.9万人的死亡。2013年以来，我国高致死率的H7N9流感病毒暴发也引发了全球的关注。甲型流感病毒也能够感染其他哺乳动物和禽类，因此根据宿主的不同又可将流感病毒分为猪流感病毒、禽流感病毒等。禽流感是严重威胁养禽业的烈性传染病。其中H5和H7亚型的禽流感病毒为高致病性禽流感病毒，表现为发病迅速、临床症状严重和死亡率高；H9N2亚型禽流感病毒主要为低致病性禽流感病毒，致病特点为致病力低、潜伏周期长，症状缓和、致死率低，但是其传染性强、传播范围广。猪流感病毒可以引起猪呼吸道疾病，同时也是一种免疫抑制性疾病，导致猪并发或者继发其他病毒性细菌性疾病。因此，流感病毒不仅影响了人类的生命健康，同时严重影响畜禽养殖业的持续稳定发展。流感病毒疫苗的研发和抗体检测是流感病毒预防和诊断的关键，具有非常重要意义。

流感病毒疫苗的研制和诊断方法的开发通常针对血凝素蛋白。流感病毒囊膜表面的血凝素蛋白(HA)与流感病毒的感染性、致病性、增殖能力等生物学特性息息相关。HA蛋白是流感病毒中最重要的抗原蛋白和免疫原性蛋白，能刺激机体产生相应的体液免疫和细胞免疫，从而使机体能抵抗相应的病毒。HA蛋白属于I型跨膜糖蛋白，大约由562～566个氨基酸组成。HA蛋白在天然状态下以同源三聚体形式存在，每一单体可以分为HA1和HA2，以二硫键相连。受到感染的宿主细胞首先产生全长、未裂解的、糖基化修饰的HA蛋白前体，然后被裂解为HA1和HA2。针对全长HA蛋白进行疫苗的研发十分普遍。因此表达和纯化具有高纯度、正确构象和功能活性的全长HA蛋白十分重要。

目前国内外主要HA蛋白的表达方式为原核表达或者真核表达，而纯化方式为镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化。原核表达的蛋白具有表达量大的优点，但是也具有很多缺点，比如：表达的蛋白不具有天然构象、内毒素难以完全去除等缺点。真核表达方法表达HA蛋白能够克服上述缺点，而其中昆虫细胞杆状病毒表达系统又具备表达量高、适合大规模生产的优点，因此备受青睐。镍柱亲和层析纯化方法中需要在HA蛋白中加入一段外源的6个组氨酸的肽段，可能会在HA蛋白亚单位疫苗的应用中带来意料之外的副作用，另外亲和柱的价格较为昂贵，因此亲和层析纯化方法的应用具有一定的局限性。而离子交换层析纯化方法是一种应用广泛并且适合大规模生产的一种纯化方法，但现存的问题是纯化的步骤较多、耗时较长、目的蛋白损失较多。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集；

S2、裂解细胞并收集裂解液；

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。

优选地，步骤S1包括如下具体步骤：通过Bac-to-Bac系统构建包含血凝素基因全长片段的重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后离心收集沉淀。

优选地，步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为：利用RT-PCR技术扩增流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段；将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中，并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞，使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组(rBacmid)；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒(rBV)种毒。

优选地，步骤S2具体包括如下步骤：用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀，200rpm搅拌30min，将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mMEDTA二钠，2％Triton X-100，5％甘油，pH 5.9。

优选地，步骤S3具体包括如下步骤：

S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后，将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来；

S32、裂解液上柱：将包含HA蛋白的裂解液以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，上样体积不超过10个柱体积；

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，之后将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱分离；

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过阳离子交换层析柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白；

所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，0.01％Triton X-100，5％甘油，pH 5.9；

所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03；

所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，10～100mM NaCl，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03。

优选地，步骤S33还包含用5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过分离后阳离子交换层析柱的步骤。

优选地，阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱的再生方法为：首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱，流速控制为5ml/min；所述再生缓冲液配方为：0.5M NaOH，1M NaCl。

优选地，所述纯化方法还包含S4浓缩步骤，将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。

优选地，所述阴离子交换层析柱为Macro-Prep Q，所述阳离子交换层析柱为Macro-Prep High S。

优选地，所述流感病毒包含但不限于甲型或乙型流感病毒。

优选地，所述甲型流感病毒包含但不限于H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9亚型流感病毒。

本发明流感病毒血凝素蛋白(下文中简写为HA蛋白)的纯化方法，收集表达HA蛋白的细胞，裂解细胞收集裂解液，裂解液经阴-阳离子交换层析柱纯化，杂蛋白结合在阴离子交换层析柱，目的蛋白HA蛋白结合在阳离子交换层析柱，通过缓冲液洗脱阳离子交换层析柱即可获得纯化的HA蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、经表面活性剂裂解的细胞裂解液在合适的pH条件下，让HA蛋白带正电荷，经过一步连续的阴-阳离子交换层析柱即可获得纯化的HA蛋白，简化了纯化步骤，提高了工作效率。

2、纯化出的HA蛋白具有高回收率和高纯度，浓缩后最终回收率可达85.6％，经SDS-PAGE检测终产品为单一条带的纯度大于95％，并且保留了HA蛋白的生物学活性。

3、本发明的纯化方法操作简便、生产快速、产品纯度高、蛋白构象正确，其具有工艺周期短、收率高、易于线性放大至生产规模的特点。

附图说明

图1是本发明HA蛋白纯化方法流程图。

图2是实施例1中层析纯化过程SDS-PAGE检测图。其中，1泳道为阴性对照；2泳道为包含HA蛋白的包含HA蛋白的裂解液；3泳道为裂解液上柱后的流出液；4泳道为平衡缓冲液A的流出液；5泳道为平衡缓冲液B的流出液；6泳道为洗脱HA蛋白的流出液；7泳道为经过浓缩和过滤的HA蛋白。

图3是实施例1中层析纯化过程Western-blot检测图。其中，1泳道为阴性对照；2泳道为包含HA蛋白的包含HA蛋白的裂解液；3泳道为裂解液上柱后的流出液；4泳道为平衡缓冲液A的流出液；5泳道为平衡缓冲液B的流出液；6泳道为洗脱HA蛋白的流出液；7泳道为经过浓缩和过滤的HA蛋白。

图4是实施例1中HA蛋白血凝试验图。其中，第1～11孔为梯度稀释的HA蛋白，第12孔为阴性对照。

图5是实施例1中HA蛋白的电镜观察图。

图6是实施例2中层析纯化过程SDS-PAGE检测图。其中，1泳道为阴性对照；2泳道为包含HA蛋白的裂解液；3泳道为裂解液上柱后的流出液；4泳道为前2.5柱体积平衡缓冲液A的流出液；5泳道为后2.5柱体积平衡缓冲液A的流出液；6泳道为洗脱HA蛋白的流出液；7泳道为经过浓缩和过滤的HA蛋白。

图7是实施例2中层析纯化过程Western-blot检测图。其中，1泳道为阴性对照；2泳道为包含HA蛋白的裂解液；3泳道为裂解液上柱后的流出液；4泳道为前2.5柱体积平衡缓冲液A的流出液；5泳道为后2.5柱体积平衡缓冲液A的流出液；6泳道为洗脱HA蛋白的流出液；7泳道为经过浓缩和过滤的HA蛋白。

图8是实施例2中HA蛋白血凝试验图。其中，第1～11孔为梯度稀释的HA蛋白，第12孔为阴性对照。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1

一种H7N9亚型流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集。

本实施例中使用的重组杆状病毒为能够表达H7N9亚型流感病毒全长HA蛋白的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)，按照常规方法由本实验室构建并保存。

本实施例中重组杆状病毒的具体构建方法为：利用RT-PCR技术扩增H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段。将血凝素基因全长片段插入载体pFastBac1中，构建pFastBac1-HA重组表达载体，并用热激法转化包含杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态，在DH10Bac中pFastBac1-HA中含有HA片段的一段序列会通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组(rBacmid)；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒(rBV)种毒。。

将Sf9细胞在Sf900II培养基(购自Thermo Fisher公司)中悬浮培养至细胞浓度为2×10⁶cells/ml时，将重组杆状病毒以感染复数(MOI)为0.5～1接种Sf9细胞。感染的Sf9细胞28℃培养箱中培养60～65h后，3000g离心，收集细胞沉淀。

S2、裂解细胞并收集裂解液。

用裂解缓冲液以8ml/g悬浮细胞沉淀，裂解液中包含2％TritonX-100非离子表面活性剂，可以裂解细胞膜，悬浮液可通过磁力搅拌或者震荡的方式加速细胞膜的裂解，如200rpm搅拌30min，之后将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，2％TritonX-100，5％甘油，pH 5.9。

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。所有的层析都在常温下进行。

S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱(简写为Q柱：Macro-Prep Q(Bio-rad)，Vt＝5ml)和阳离子交换层析柱(简写为S柱：Macro-Prep High S(Bio-rad)，Vt＝5ml)进行再生后，将Q柱和S柱按顺序连接起来。Q柱和S柱的再生方法为：首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱，流速控制为5ml/min；所述再生缓冲液配方为：0.5M NaOH，1M NaCl。

S32、裂解液上柱：将裂解液以1～2ml/min流速过连接的Q柱和S柱，上样体积不超过10个柱体积。

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的Q柱和S柱，之后将Q柱和S柱分离；将5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过S柱。

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过S柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白。

所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，0.01％Triton X-100，5％甘油，pH 5.9；所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03；所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，100mM NaCl，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03。

S4、浓缩。

将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。PBS缓冲液的配方为：8g NaCl，3.58g Na₂HPO₄，0.2g KCl，0.27g KH₂PO₄，定容至1L，调节pH至7.4

层析纯化过程可以通过SDS-PAGE、Western-blot实验检测纯化效果。SDS-PAGE实验具体实验方法如下：向样品中加入上样缓冲液，煮沸10min，10％的SDS-PAGE电泳检测。用同样的方法处理不表达HA蛋白的细胞裂解液，作为阴性对照。SDS-PAGE电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液对蛋白进行染色，用考马斯亮蓝染色脱色液脱去凝胶上的杂色，结果如图2所示。

通过Western-blot实验检测HA蛋白的情况，具体实验方法如下：向样品中加入上样缓冲液，煮沸10min，10％的SDS-PAGE电泳检测。用同样的方法处理不表达HA蛋白的细胞裂解液，作为阴性对照。SDS-PAGE电泳结束后，用半干法将蛋白转移至PVDF膜上。转膜完成后，取出PVDF膜，用1×TBST洗涤液洗膜1次；3％BSA封闭液，4℃封闭膜过夜；1×TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入抗H7N9亚型流感病毒的小鼠血清(1：3,000)，室温孵育1h；1×TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠二抗(1：5,000)，室温孵育1h；1×TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；ECL solution显色液显色，拍照，结果如图3所示。

由图2和图3可知，在结合和平衡步骤中HA蛋白不会被洗脱下来，因此推断HA蛋白可以结合在层析柱上，而洗脱步骤则可以将HA蛋白洗脱下来，且只有一个主条带，大约为70kDa，通过个条带灰度扫描HA蛋白纯度可达95％。将层析纯化过程各个步骤收集的流出液进行Western-blot检测，结果与考马斯亮蓝染色结果相一致，说明纯化的单一主条带为目的H7N9流感病毒HA蛋白。

浓缩后的HA蛋白可以通过血凝试验检测其生物学活性，方法如下：V型96孔微量血凝板的1-12孔均加入50μL 0.75％的生理盐水，在第1孔加入等体积纯化的HA蛋白，混匀后吸取50μl加入第2孔，依次这样倍比稀释至第11孔，最后的50μl弃去，第12孔作为阴性对照。然后在每孔加入0.75％鸡红细胞悬液，室温下静置30min后观察，结果如图4所示，HA蛋白可以凝集红细胞，2μg HA蛋白血凝效价≥2¹¹。纯化后的HA蛋白具备生物学活性，这就暗示着其具备天然构象。

浓缩后的HA蛋白可以用磷钨酸负染法对纯化的HA蛋白进行透射电镜观察，检测HA蛋白的多聚体的形成，结果如图5所示。由于溶液置换为不含表面活性剂的PBS缓冲液，全长HA蛋白具有跨膜区可以在脂质双分层存在的情况下形成头部朝向外侧，尾部朝向内侧的花结状多聚体。纯化浓缩后的HA蛋白在电镜下成花结状多聚体结构，直径约30nm。

综上所述，本发明成功建立了一种基于离子交换层析纯化方法的快速纯化H7N9流感病毒HA蛋白的方法，其将在抗体检测、流感病毒基因工程疫苗的研制及流感病毒抗原检测制品的研制中体现重要的开发利用价值，其高效性和可线性放大的特点为该方法的产业化应用提供良好的前景。

实施例2

一种H1N1亚型流感病毒血凝素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集。

本实施例中使用的重组杆状病毒为能够表达H1N1亚型流感病毒全长HA蛋白的AcNPV，按照常规方法由本实验室构建并保存。其他内容同实施例1。

S2、裂解细胞并收集裂解液。

与实施例1相同，在此不再赘述。

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。

S31、层析柱的再生和组装方法，与实施例1相同。

S32、裂解液上柱：与实施例1相同。

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的Q柱和S柱，之后将Q柱和S柱分离。

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过S柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白；所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，10mM NaCl，0.05％Triton X-100，5％甘油，pH 7.03。

S4、浓缩。

与实施例1相同。

浓缩后的HA蛋白可以通过SDS-PAGE、Western-blot实验和血凝试验检测其纯度和生物学活性。

将层析纯化过程各个步骤收集的流出液进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色检测，结果如图6所示。由图6可知，在结合和平衡步骤中HA蛋白不会被洗脱下来，因此推断HA蛋白可以结合在层析柱上，而洗脱步骤则可以将HA蛋白洗脱下来，且只有一个主条带，通过个条带灰度扫描HA蛋白纯度可达95％。将层析纯化过程各个步骤收集的流出液进行Western-blot检测，Western-blot检测中用到的一抗为抗H1N1亚型流感病毒的小鼠血清，其他方法同实施例1。结果如图7所示。结果与考马斯亮蓝染色结果相一致，说明纯化的单一主条带为目的H1亚型HA蛋白。

HA蛋白血凝试验结果如图8所示，H1亚型HA蛋白可以凝集红细胞，2μgH1亚型HA蛋白血凝效价≥2¹¹，说明其具有生物活性，具备天然构象。

本实施例成功纯化了H1N1亚型流感病毒全长HA蛋白即H1亚型HA蛋白，纯化的蛋白具有高纯度并具有生物学活性，可以凝集红细胞。因此，本发明纯化方法，可以用于多个亚型的流感病毒HA蛋白的纯化。

综上所述，本发明建立基于连续阴-阳离子交换层析的流感病毒HA蛋白的方法，HA蛋白回收率较高，浓缩后最终回收率可达85.6％，纯度大于95％，并且保留了HA蛋白的生物学活性。

本发明纯化的重组HA蛋白可来源于重组杆状病毒感染的昆虫细胞，但不限于此种细胞，也不限于此种表达系统。其他可以被杆状病毒感染的昆虫细胞，如Galleria mallanoma、Bombix mori等细胞，其他重组蛋白表达系统，如酵母细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统表达的重组HA蛋白也适用于本发明的纯化方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。