一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法与流程

文档序号:12399245阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集;

S2、裂解细胞并收集裂解液;

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。

2.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤S1包括如下具体步骤:通过Bac-to-Bac系统构建包含血凝素基因全长片段的重组杆状病毒;将重组杆状病毒感染昆虫细胞,培养后离心收集沉淀。

3.根据权利要求2所述的纯化方法,其特征在于,步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为:利用RT-PCR技术扩增流感病毒血凝素蛋白全长基因序列,获得血凝素基因全长片段;将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中,并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞,使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒基因组rBacmid;将rBacmid转染昆虫细胞,培养后离心收集上清即为重组杆状病毒种毒。

4.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤S2具体包括如下步骤:用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀,200rpm搅拌30min,将悬浮液以10000g离心25min,离心后收集上清,即为包含HA蛋白的裂解液;所述裂解缓冲液配方为:20mM磷酸三钠,1.0mM EDTA二钠,2%Triton X-100,5%甘油,pH 5.9。

5.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,步骤S3具体包括如下步骤:

S31、层析柱的再生和组装:分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后,将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来;

S32、裂解液上柱:将裂解液以1~2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱,上样体积不超过10个柱体积;

S33、柱平衡:将5倍柱体积平衡缓冲液A以1~2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱,之后将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱分离;

S34、洗脱HA蛋白:将2倍柱体积洗脱缓冲液以1~2ml/min流速过阳离子交换层析柱,收集流出液即为纯化的HA蛋白。

6.根据权利要求5所述的纯化方法,其特征在于,步骤S33还包含用5倍柱体积平衡缓冲液B以1~2ml/min流速过分离后阳离子交换层析柱的步骤。

7.根据权利要求5或6所述的纯化方法,其特征在于,所述平衡缓冲液A的配方为:20mM磷酸三钠,1.0mM EDTA二钠,0.01%Triton X-100,5%甘油,pH 5.9;所述平衡缓冲液B的配方为:20mM磷酸三钠,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH 7.03;所述洗脱缓冲液的配方为:20mM磷酸三钠,10~100mM NaCl,0.05%Triton X-100,5%甘油,pH 7.03。

8.根据权利要求5所述的纯化方法,其特征在于,阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱的再生方法为:首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱,流速控制为5ml/min;其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱,流速控制为5ml/min;最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱,流速控制为5ml/min;所述再生缓冲液配方为:0.5M NaOH,1M NaCl。

9.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述纯化方法还包含S4浓缩步骤,将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释,稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜,浓缩10~100倍,重复一次,浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。

10.根据权利要求1所述的纯化方法,其特征在于,所述流感病毒为甲型或乙型流感病毒。

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