1.基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,生物信息学分析:搜索PlasmoDB数据库,筛选仅在恶性疟原虫红细胞内期环状体期高表达(前20%)且该种疟原虫特有基因,利用OrthoMCL database验证其在真核生物不同种属间的分布情况,同时,筛选仅在恶性疟原虫红内期滋养体或裂殖体阶段高表达(前20%)且其特有基因各一个,做为平行对照;
步骤二,LAMP引物设计:利用LAMP在线设计软件PrimerExplorerV4对步骤一所筛选到的特有基因进行LAMP引物设计,参数设置为默认值,选择分数排名前二至前五的LAMP引物,然后进行LAMP引物合成;
步骤三,模版DNA制备:使用血液基因组DNA提取试剂盒分别提取含有恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫的全血基因组DNA;使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取感染弓形虫的小鼠腹水DNA;上述试剂盒所提取的基因组DNA即为LAMP使用的模板DNA;
步骤四,引物配制:
LAMP引物存储液配制:将步骤二得到的置于1.5ml离心管的LAMP引物干粉在12000r/min下离心1min,以使粘在管盖和管壁的粉末全部集中在管底。
配制母液:根据引物干粉摩尔数溶解干粉于1.5ml离心管,配制内引物(FIP/BIP)母液的浓度为200pmol/μl,外引物(F3/B3)母液的浓度为100pmol/μl,将配制好的内引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液室温放置5min,振荡混合均匀后放入离心机,在12000r/min下离心1min;
LAMP引物工作液PM制备:取200pmol/μl的FIP母液和BIP母液各4μl、100pmol/μl的F3母液和B3母液各1μl,最后加入10μl超纯水制备成20μl工作液备用;
步骤五,LAMP法的建立和敏感性、特异性评价:
A.LAMP反应体系包括12.5μl 2×RM反应液,1μl步骤四得到的LAMP引物工作液PM,1μl和相对应基因的DNA模板,1μl Bst DNA Polymerase,加超纯水至25μl,混合均匀后加入12.5μl密封液再次离心,最后将1μl显色液滴在PCR管盖中间,轻轻盖紧管盖,恒温金属浴内反应,终止反应后颠倒PCR管数次或1000~16000r/min离心30sec~3min,使显色液与反应混合液充分混匀,短暂离心后观察反应液颜色变化,若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增),若呈现棕红色则为阴性(无核酸扩增);
B.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA用超纯水进行倍比稀释,然后按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测,评价所检测基因的敏感性;
C.将步骤三得到的含有恶性疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有间日疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有约氏疟原虫基因组DNA的全血DNA、含有弓形虫基因组DNA的腹水DNA;按照步骤五中A所述的LAMP染色法检测,以18S rRNA设计的LAMP引物作为阳性对照引物,进行特异性评价,同时设立空白对照和阴性对照。
2.根据权利要求1所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤一中恶性疟原虫特有基因为PF3D7_1253300,PF3D7_0202200,PF3D7_0702300,PF3D7_1001900,PF3D7_1002000,PF3D7_1148900,PF3D7_1240100,PF3D7_1301700与PF3D7_1334700。
3.根据权利要求2所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤一中恶性疟原虫红内期滋养体阶段高表达(前20%)特有基因为PF3D7_0220300。
4.根据权利要求3所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤一中恶性疟原虫红内期裂殖体阶段高表达(前20%)特有基因为PF3D7_1401600。
5.根据权利要求4所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤三中血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的提取方法为疟原虫滤纸血斑DNA提取,所述疟原虫滤纸血斑DNA方法为:用打孔器取少许滤纸,所述滤纸含血样,置于1.5ml离心管,先加入1.0ml无菌水浸泡2h,然后在16000r/min下离心5min,弃上层清液;再加160μl 5%chelex-100混悬液,56~65℃加热1~2h后在95~98℃变性5~10min,振荡30s~3min,然后取在12000~16000r/min下离心3~5min,吸取上清150±10μl,在-20℃下保存。
6.根据权利要求5所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述打孔器取3mm*3mm滤纸,所述滤纸含10±0.5μl血样。
7.根据权利要求6所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤三中含有恶性疟原虫的全血的原虫密度为50000个/μl。
8.根据权利要求7所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤五中恒温金属浴内的温度为60~65℃。
9.根据权利要求8所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤五中恒温金属浴内的反应时间为30~90min。
10.根据权利要求9所述的基于恶性疟原虫环状体独有基因的环介导等温扩增法,其特征在于:所述步骤五中恶性疟原虫DNA用超纯水按照10-1、10-2、10-3、10-4和10-5倍比稀释。