一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法与流程

本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体涉及一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法。

背景技术：

鸡蛋作为人们膳食中获取蛋白质的主要食品，深受人们的青睐。鸡蛋蛋清主要由蛋白质和水组成，占整个蛋重的60％以上，其中富含多种生物活性蛋白，主要有占54％的卵白蛋白、占13％的卵转铁蛋白、占11％的卵类黏蛋白等，这些蛋白的生物活性功能已经得到人们越来越广泛的认可。

我国虽然是鸡蛋产量大国，连续数年鸡蛋总产量位居世界第一，然而，蛋品加工业发展缓慢，产品附加值较低。在蛋品生产过程中，由于饮食习惯和食品行业的特殊需求，以蛋黄为原料生产卵磷脂、胆碱等已实现工业化，蛋黄需求量较大，而蛋清在生产过程中却被大量丢弃，造成资源浪费和环境污染。同时，有医学研究者认为鸡蛋是不健康的食品，主要原因是鸡蛋中胆固醇和脂肪含量较高，尤其不适合老年人食用。

常用的蛋白质提取方法有水溶液提取法、有机溶剂提取法和酶法提取；但是，水溶液提取法提取率低，提取时间较长；有机溶剂提取法需要盐析及透析等步骤除杂，操作繁琐且存在有害物质残留；酶法提取具有时间短、反应条件温和、且不会产生有害物质等优点，但是该法成本较高，同时胰蛋白酶对蛋白质的结构破坏严重。因此，采用简单、快速的方法有效提取鸡蛋蛋清中的活性蛋白，对充分利用我国丰富的禽蛋资源，提高蛋产品附加值，推动鸡蛋清中的蛋白质在食品、医药及保健品当中的应用具有非常重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法，该方法可快速简单的对鸡蛋清中的蛋白质进行提取，且提取率高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，取新鲜鸡蛋清硬性发泡，然后干燥，再将干燥后的鸡蛋清碾磨，过筛，得鸡蛋清粉末，备用；

步骤2，向所述鸡蛋清粉末中加入提取剂，并同时置于超声波和微波的条件下进行蛋白质的提取，提取后离心，取上清液，即得蛋白质粗品。

优选地，步骤1中，所述干燥为冷冻干燥。

进一步优选地，所述冷冻干燥的温度为-60℃～60℃，所述冷冻干燥的时间为至少12小时。

优选地，步骤1中，所述过筛的筛孔为40目。

优选地，步骤2中，所述提取剂为去离子水。

优选地，步骤2中，所述鸡蛋清粉末与所述提取剂的比例为1g:(4-20)ml。

进一步优选地，所述鸡蛋清粉末与所述提取剂的比例为1g:(10.5-13.5)ml。

优选地，步骤2中，所述超声波的功率密度为440～920w/dm³。

进一步优选地，所述超声波的功率密度为650～750w/dm³。

优选地，步骤2中，所述微波的功率密度为600～1400w/dm³。

进一步优选地，所述微波的功率密度为900～1100w/dm³。

优选地，步骤2中，所述提取的时间为3min～15min。

进一步优选地，所述提取的时间为7.5min～10.5min。

本发明的有益效果为：

本发明采用超声波协同微波的方式对鸡蛋清中的蛋白质进行提取，提取剂采用去离子水而非有机溶剂，具有提取效率高、用时短、操作简单、安全、环保等优点。本发明提供的鸡蛋清中蛋白质的提取方法推动了鸡蛋加工产业的快速发展，提高了鸡蛋附加值，为鸡蛋的综合开发利用提供了参考依据。

附图说明

图1为微波功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响结果图；其中，横坐标为微波功率，单位为w；纵坐标为蛋白质提取率，单位为％；

图2为鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响结果图；其中，横坐标为鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例，单位为g:ml；纵坐标为蛋白质提取率，单位为％；

图3为超声功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响结果图；其中，横坐标为超声功率，单位为w；纵坐标为蛋白质提取率，单位为％；

图4为提取时间对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响结果图；其中，横坐标为提取时间，单位为min；纵坐标为蛋白质提取率，单位为％；

图5为微波功率和鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，a为微波功率，单位为w；b为鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例，单位为g:ml；y为蛋白质提取率，单位为％；

图6为微波功率和超声功率对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，a为微波功率，单位为w；c为超声功率，单位为w；y为蛋白质提取率，单位为％；

图7为微波功率和提取时间对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，a为微波功率，单位为w；d为提取时间，单位为min；y为蛋白质提取率，单位为％；

图8为超声功率和鸡蛋清粉末与去离子水的比例对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，b为鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例，单位为g:ml；c为超声功率，单位为w；y为蛋白质提取率，单位为％；

图9为提取时间和鸡蛋清粉末与去离子水的比例对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，b为鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例，单位为g:ml；d为提取时间，单位为min；y为蛋白质提取率，单位为％；

图10为超声功率和提取时间对蛋白质提取率影响的响应曲面图；其中，c为超声功率，单位为w；d为提取时间，单位为min，y为蛋白质提取率，单位为％。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

1、材料与仪器

1.1材料

鸡蛋购自陕西省咸阳市购物超市；水为去离子水；牛血清白蛋白标准品(bsa)，来自中国药品生物制品检定所；考马斯亮蓝g-250，生产厂家为德国达姆施塔特市默克公司。

1.2仪器

xo-sm200微波超声波组合反应系统，生产厂家为南京先欧仪器制造有限公司；蛋清分离器(s-star)，生产厂家为顺财不锈钢厨具厂；精密电子天平，型号为hr120；真空干燥箱(dzf-6053)，生产厂家为上海一恒科学仪器有限公司。

2、实验方法

2.1原料预处理

将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里，采用蛋清分离器分离出蛋清，硬性发泡30min，然后均匀涂层于载体表面冷冻干燥，再将干燥后的鸡蛋清碾磨，过筛，得鸡蛋清粉末，备用。

其中，载体为能够承载鸡蛋清的物质，包括玻璃器皿或陶瓷器皿，如载玻片、表面皿、坩埚等。

2.1.1将鸡蛋清粉末在-60℃温度条件下预冷2小时，再在40℃条件下真空干燥10小时，然后将干燥后的鸡蛋清碾磨，过40目筛，得鸡蛋清粉末，备用；

2.1.2将鸡蛋清粉末在-45℃温度条件下预冷2小时，再在30℃条件下真空干燥12小时，然后将干燥后的鸡蛋清碾磨，过40目筛，得鸡蛋清粉末，备用；

2.1.3将鸡蛋清粉末在-20℃温度条件下预冷3小时，再在40℃条件下真空干燥12小时，然后将干燥后的鸡蛋清碾磨，过40目筛，得鸡蛋清粉末，备用；

2.1.4将鸡蛋清粉末在-15℃温度条件下预冷3小时，再在50℃条件下真空干燥12小时，然后将干燥后的鸡蛋清碾磨，过40目筛，得鸡蛋清粉末，备用；

2.1.5将鸡蛋清粉末在0℃温度条件下预冷5小时，再在60℃条件下真空干燥8小时，然后将干燥后的鸡蛋清碾磨，过40目筛，得鸡蛋清粉末，备用。

2.2蛋白质的提取：

取2.1.1～2.1.5中任一项的鸡蛋清粉末4.000g，置于xo-200微波超声波组合反应系统的500ml的专用玻璃反应瓶中，加入提取剂去离子水，然后密封，连接回流装置，设定超声波功率、微波功率和提取时间，进行蛋白质的提取。提取结束后，离心处理，取上清液，并采用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的含量，蛋白质提取率按照下式计算

蛋白质提取率/％＝(蛋白质质量/g/鸡蛋清粉末质量/g)×100％。

实施例1微波功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响

试验方法：按照2.2中鸡蛋清中蛋白质的提取方法对鸡蛋清中的蛋白质进行提取；其中，鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:12ml；超声功率为350w，微波功率分别设置为300w、400w、500w、600w、700w，提取时间为9min，在此条件下，考察微波功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响。

试验结果：试验结果如图1所示，蛋白质提取率随微波功率的增大而增大，当功率增大到500w时，蛋白质提取率达到最大值；之后，随微波功率的增大开始下降，实验结果表明微波功率选择500w时，蛋白质的提取率最高。

实施例2鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响

试验方法：按照2.2中鸡蛋清中蛋白质的提取方法对鸡蛋清中的蛋白质进行提取；其中，微波功率为500w，超声功率为350w，提取时间为9min，鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例分别设置为1g:4ml、1g:8ml、1g:12ml、1g:16ml、1g:20ml，在此条件下，考察鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响。

试验结果：试验结果如图2所示，试验结果表明当鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:12ml时，蛋白质提取率达到最大值。

实施例3超声功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响

试验方法：按照2.2中鸡蛋清中蛋白质的提取方法对鸡蛋清中的蛋白质进行提取；其中，微波功率为500w，鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:12ml，提取时间为9min，超声功率分别设置为220w、280w、340w、400w、460w，考察超声功率对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响。

试验结果：试验结果如图3所示，实验结果表明当超声功率为340w时，蛋白质提取率达到最大值。

实施例4提取时间对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响

试验方法：按照2.2中鸡蛋清中蛋白质的提取方法对鸡蛋清中的蛋白质进行提取；其中，微波功率为500w，超声功率为350w，鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:12ml，分别考察提取时间为3min、6min、9min、12min、15min时，考察提取时间对鸡蛋清中蛋白质提取率的影响。

试验结果：试验结果如图4所示，试验结果表明，随着提取时间的延长，蛋白质提取率逐渐增大，当提取时间为9min，提取率达到最大值，且9min以后即9min～15min提取率无明显提升。

实施例5响应曲面优化试验：

按照2.2中鸡蛋清中蛋白质的提取方法对鸡蛋清中的蛋白质进行提取；其中，各提取参数采用响应曲面法(box－behnken，bbd)设计，对共计27个试验点进行试验，并计算鸡蛋清中的蛋白质提取率。试验设计影响因素和蛋白质的提取率如表1所示，其中a表示微波功率、b表示鸡蛋清粉末与去离子水的比例、c表示超声功率、d表示提取时间。

表1响应曲面法试验设计和实验结果

回归模型方程的建立及显著性检验：

利用design-expert7.0.0统计软件对表2的试验数据进行回归拟合，得到多元二次回归方程模型：

y1＝-360.411+0.297×a+11.718×b+1.231×c+12.264×d+7.000e-004×ab+4.095e-004×ac-8.333e-006×ad+5.433e-006×bc–0.128×bd–7.433e-003×cd-4.485e-004×a²–0.526×b²–2.053e-003×c²-0.452×d²，r²＝0.9067。

对模型进行显著性检验：p值小于0.05，对应因素对响应值的影响显著；失拟项f值<p表明失拟项相对于绝对误差不显著；相关系数r²值一般要求90％以上，表明回归方程是高度显著。二次回归模型的方差分析结果如表2所示。

表2二次回归模型的方差分析结果

由表2可以看出，模型的p值为0.0004，小于0.05，表明试验所选用的二次多项模型方程具有显著性；失拟项f值为0.61，p＝0.7564，表明失拟项相对于绝对误差不显著；回归方程是高度显著的，相关系数r²值为0.9067。因此，该模型对试验的拟合程度良好，能较好的反映各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型分析和预测不同提取条件下蛋白的提取率变化。模型的一次项对蛋白的提取率影响均不显著(p＞0.05)；微波功率和超声功率交互项显著(p＜0.05)，其他交互相均不显著(p＞0.05)；二次项均显著(p＜0.05)，表明各因素对蛋白质提取率的影响都不是简单的线性关系。

响应曲面分析与优化：

根据上述回归方程模型可以绘制响应曲面图，考察拟合响应曲面的形状，分析微波功率、鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例、超声功率和提取时间各因素对蛋白质提取率的影响。响应曲面图直观地反映了各因素及交互作用对各响应值的影响。

图5为微波功率和鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例对蛋白质提取率影响的响应曲面图，由图可以看出，随着微波功率和鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例的逐渐增大，曲面呈上升趋势，当微波功率为500w，鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:12ml时，提取率开始趋于下降。从图中可以确定出最佳范围：微波功率450w～550w，鸡蛋清粉末与提取剂去离子水的比例为1g:(10.5-13.5)ml。

图6、图7、图8、图9、图10依次分别为微波功率和超声功率、微波功率和提取时间、超声功率和鸡蛋清粉末与去离子水的比例、提取时间和鸡蛋清粉末与去离子水的比例、超声功率和提取时间对蛋白质提取率影响的响应曲面图。由图6至图10可以看出，随着相应两个因素的增大，蛋白质提取率均呈现先增大后减小的趋势，响应曲面开口向下，在所选范围内存在极值，即响应曲面最高点，同时也是等高线最小椭圆的中心点。从图中可以确定出最佳水平范围：微波功率为450w～550w，鸡蛋清粉末与去离子水的比例为1g:(10.5-13.5)ml，超声波功率为325w～375w，提取时间为7.5min～10.5min。

通过软件分析，本发明采用超声波协同微波的方式对鸡蛋清中的蛋白质进行提取的最佳条件为：微波功率499.66w，鸡蛋清粉末与所述提取剂的比例为1g:12.20ml，超声功率为349.50w，提取时间为8.96min。

考虑到实际操作情况，将提取方法参数修正为微波功率为500w，鸡蛋清粉末与所述提取剂的比例为1g:12.20ml，超声功率为350w，提取时间为9.0min。三次平行试验得到提取率为56.21％±0.92％。

本发明采用超声波协同微波的方式对鸡蛋清中的蛋白质进行提取，提取剂采用去离子水而非有机溶剂，并采用响应曲面优化法对鸡蛋清中蛋白质的提取方法中的条件进行了优化。本发明提供的鸡蛋清中蛋白质的提取方法具有提取效率高、用时短、操作简单、安全、环保等优点。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。