用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型的新化合物的制作方法
本申请是申请日为2012年04月23日的题为“用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如强直性肌营养不良症1型(dm1)的新化合物”的中国专利申请号201280030219.5的分案申请。
本发明提供了用于治疗、延缓和/或预防人类遗传性疾病如dm1的新化合物。
背景技术：
强直性肌营养不良症1型(dm1)是一种具有复杂的、多系统病理的显性遗传性神经肌肉疾病(harperp.s.etal)。dm1的特征是表达含有长cug重复(repeats)的dmpk转录本，其隔离(sequester)或上调剪接因子和转录因子，从而干扰正常的细胞功能和活力。反义寡核苷酸(aon)介导的毒性dmpk转录本的抑制被认为是用于这种频繁的三核苷酸重复疾病的潜在治疗策略。cug重复序列存在于dmpk转录本的外显子15中。
(cug)n段(tract)自身形成明显的靶，其为突变体和正常尺寸转录本之间的唯一已知多态现象。在先前的研究中，我们已经确定2’-o-硫代磷酸甲酯-修饰的(cag)7寡核苷酸(ps58)(seqidno:1)能诱导dm1细胞和动物模型中突变体转录本的断裂(mulderss.a.etal)。为了使aon在dm1中临床有效，它们需要到达各种组织和其中的各细胞类型中，并且被成功地递送到这些细胞的核中。在本发明中，已经基于ps58设计了新化合物，其包含本文中所描述的甲基化胞嘧啶和/或脱碱基位点，所述化合物在靶向和/或递送至和/或由多种组织包括心脏、骨骼肌和平滑肌吸收方面具有提高的活性。
wo2009/099326和wo2007/808532描述了包含(cag)n重复单元(如ps58)的寡聚物。
技术实现要素：
在第一方面，提供了包含或者由lgaqsnf/(nag)m组成的化合物，其中包含于寡核苷酸部分(nag)m中的n是c(即，胞嘧啶)或5-甲基胞嘧啶。这种化合物可以称为缀合物(conjugate)。该化合物包含含有或由lgaqsnf(seqidno:2)组成的肽部分，该肽部分连接至或偶联至寡核苷酸部分或与寡核苷酸部分结合(缀合)，该寡核苷酸部分包含或由(nag)m组成，其中的n为c或5-甲基胞嘧啶。该化合物也可以称为缀合物。lgaqsnf/(nag)m中的斜线号(/)标示本发明的化合物的肽部分与寡核苷酸部分之间的键合、偶联或缀合。本发明的化合物的肽部分包含或由lgaqsnf组成。本发明的化合物的寡核苷酸部分包含或由(nag)m组成，其中n为c或5-甲基胞嘧啶。在一个实施方式中，该化合物包含或由lgaqsnf/(nag)m组成，其中包含于寡核苷酸部分(nag)m中的n是c或5-甲基胞嘧啶，以使包含于寡核苷酸部分(nag)m中的至少出现一次的a包含2,6-二氨基嘌呤核苷碱基(nucleobase)修饰。m优选地为整数，其是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个优选的实施方式中，m为7。因此，优选的(nag)m(其中n为c或5-甲基胞嘧啶)具有12至90个核苷酸的长度，更优选12至45个核苷酸，甚至更优选15至36个核苷酸，最优选21个核苷酸。所述寡核苷酸部分优选地包含与重复序列cug互补的至少15至45个连续的核苷酸，或与重复序列cug互补的至少18至42个连续的核苷酸，更优选与重复序列cug互补的21至36个核苷酸，甚至更优选与重复序列cug互补的18至24个核苷酸。
根据本发明的这一方面的化合物可以由lgaqsnf/(nag)m组成，这意味着除了lgaqsnf序列之外不存在其他氨基酸并且除了重复的nag基序之外不存在其他核苷酸。可替代地，该化合物可以包含lgaqsnf/(nag)m，这意味着除了lgaqsnf序列之外可以存在其他氨基酸、或其类似物或等价物，和/或在重复的nag基序的一侧或两侧可以存在其他核苷酸或其类似物或等价物。
在本发明的上下文中，氨基酸的“类似物”或“等价物”应被理解为一种氨基酸，相对于天然存在于肽中的氨基酸而言，其包含至少一个修饰。该修饰可以是骨架修饰和/或糖修饰和/或碱基修饰，进一步的解释和例示如下。
在本发明的上下文中，核苷酸的“类似物”或“等价物”应被理解为一种核苷酸，相对于天然存在于rna中的核苷酸(如a、c、g和u)而言，其包含至少一个修饰。该修饰可以是骨架修饰和/或糖修饰和/或碱基修饰，进一步的解释和例示如下。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的这一方面的寡核苷酸部分可以表示为l–(x)p–(nag)m–(y)q–l，其中n和m如上述限定。每次出现的l独立地为氢原子或如下进一步限定的连接至或与根据本发明的化合物的肽部分相关联的键合部分、偶联部分或缀合部分，其中至少一个出现的l为键合部分、偶联部分或缀合部分。在一个优选的实施方式中，一个出现的l为氢原子且另一个出现的l为键合部分、偶联部分或缀合部分。在另一个实施方式中，两个出现的l都是氢，并且该寡核苷酸通过内部核苷酸之一而键合至、偶合至或缀合至肽部分，例如通过核苷碱基或通过核苷间键。各个出现的x和y独立地为如下进一步限定的脱碱基位点或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且p和q各自独立地为整数，优选0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或大于10或上达至50。因此，p和q各自独立地为0至50的整数，优选0至10的整数，更优选0至6。因此，当p为0时，x不存在且当q为0时，y不存在。
本文中，(x)p–(nag)m–(y)q(其中n和m如上述所限定并且p和q为0)被认为是根据本发明的这一方面的化合物的寡核苷酸部分，其中其寡核苷酸部分由(nag)m组成。包含(nag)m的该寡核苷酸部分可以表示为(x)p–(nag)m–(y)q，其中n、m、x、y、p和q如上述所限定并且p和q中的至少一个不为0。
在一个优选的实施方式中，p不为0，并且由(x’)p’ag或(x’)p”g表示(x)p，其中每个出现的x’独立地为脱碱基位点(无碱基位点，abasicsite)或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且p’为p–2且p”为p–1。这样的化合物可以表示为：
l–(x’)p’ag–(nag)m–(y)q–l或
l–(x’)p”g–(nag)m–(y)q–l。
在同样优选的实施方式中，q不为0，并且由na(y’)q’或n(y’)q”表示(y)q，其中n如上述所限定并且每个出现的y’独立地为脱碱基位点或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且q’为q–2且q”为q–1。这样的化合物可以表示为：
l–(x)p–(nag)m–na(y’)q’–l或
l–(x)p–(nag)m–n(y’)q”–l。
在另一个优选的实施方式中，p和q均不是0，并且分别由(x’)p’ag或(x’)p”g和na(y’)q’或n(y’)q”表示(x)p和(y)q，其中n、x’、y’、p’、p”、q’和q”如上述所限定。这样的化合物可以表示为：
l–(x’)p’ag–(nag)m–na(y’)q’–l、
l–(x’)p”g–(nag)m–na(y’)q’–l、
l–(x’)p’ag–(nag)m–n(y’)q”–l、或
l–(x’)p”g–(nag)m–n(y’)q”–l。
应当理解的是p’、p”、q’和q”不能是负整数。因此，当由(x’)p’ag或(x’)p”g表示(x)p时，p分别至少为1或至少为2，并且当由na(y’)q’或n(y’)q”表示时(y)q，q分别至少为1或至少为2。
因此，根据本发明的这一方面的化合物的寡核苷酸部分可以包含或者由下列序列之一组成：(nag)m、ag(nag)m、g(nag)m、ag(nag)mna、g(nag)mna、(nag)mna、ag(nag)mn、g(nag)mn、或(nag)mn。在一个实施方式中，所述寡核苷酸部分的一个或多个自由(游离)末端，即其中l为氢的末端可以含有1至10个脱碱基位点，如以下进一步的限定。这些脱碱基位点可以是相同的或不同的类型，并且可以通过彼此之间的3’-5’、5’-3’、3’-3’或5’-5’键连接并与该寡核苷酸部分连接。虽然在技术上3’和5’原子在脱碱基位点中不存在(因为缺少核苷碱基并由此对环的原子编号)，为了清楚起见，这些编号是按照它们处于相应的核苷酸中来进行的。
在第二方面，本发明涉及包含或由寡核苷酸序列(nag)m组成的化合物，其中n为c或5-甲基胞嘧啶并且其中至少一个出现的n为5-甲基胞嘧啶和/或至少一个出现的a包含2,6-二氨基嘌呤核苷碱基修饰。在一个优选的实施方式中，所有出现的n都为5-甲基胞嘧啶。在另一个优选的实施方式中，所有出现的a都包含2,6-二氨基嘌呤核苷碱基。在另一个优选的实施方式中，所有出现的n都为5-甲基胞嘧啶并且所有出现的a都包含2,6-二氨基嘌呤核苷碱基。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的这一方面的化合物不包含次黄嘌呤碱基或者换句话说肌苷核苷酸。
m优选地为一个整数，其优选4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。换句话说，m优选4–15，更优选5–12，并且甚至更优选6–8。在一个特别优选的实施方式中，m为5、6、7。包含(nag)m的该寡核苷酸可以具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90个核苷酸的长度。换句话说，根据本发明的这一方面的寡核苷酸优选地具有12至90个核苷酸的长度，更优选15至49个核苷酸，甚至更优选21核苷酸。所述寡核苷酸优选地包含与重复序列cug互补的至少15至45个连续的核苷酸，或与重复序列cug互补的至少18至42个连续的核苷酸，更优选与重复序列cug互补的18至36个核苷酸，甚至更优选与重复序列cug互补的18至24个核苷酸。
根据本发明的这一方面的化合物可以被认为是寡核苷酸。这样的寡核苷酸可以由(nag)m组成，这意味着除了重复nag基序之外不存在其他核苷酸。或者，该寡核苷酸可以包含(nag)m，这意味着在重复nag基序的一侧或两侧存在其他核苷酸或它们的类似物或等价物。
在本发明的上下文中，核苷酸的“类似物”或“等价物”应当被理解为一种核苷酸，相对于天然存在于rna中的核苷酸(如a、c、g和u)而言，其包含至少一个修饰。此种修饰可以是骨架修饰和/或糖修饰和/或碱基修饰，这在下文中做了进一步的解释和例示。
可替代地，根据本发明的这一方面的寡核苷酸可以由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示，其中n和m如上述所限定。每个出现的x和y独立地为如下文进一步限定的脱碱基位点或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且p和q各自独立地为整数，优选0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或大于10或上达至50。因此，p和q各自独立地为0至50的整数，优选0至10的整数，更优选0至6。因此，当p为0时，x不存在并且当q为0时，y不存在。本领域技术人员能够理解，寡核苷酸总是以氢原子(h)为起始并以氢原子(h)终止，而与存在于该寡核苷酸中的核苷酸的量和性质无关。
此处，其中n和m如上述所限定并且p和q为0的h–(x)p–(nag)m–(y)q–h被视为根据本发明的这一方面的化合物，其由(nag)m组成。包含(nag)m的化合物可以表示为h–(x)p–(nag)m–(y)q–h，其中n、m、x、y、p和q如上述所限定并且p和q中的至少一个不为0。
在一个优选的实施方式中，p不为0，并且由(x’)p’ag或(x’)p”g表示(x)p，其中每个出现的x’独立地为脱碱基位或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且p’为p–2并且p”为p–1。这样的寡核苷酸可以表示为：
h–(x’)p’ag–(nag)m–(y)q–h或
h–(x’)p”g–(nag)m–(y)q–h。
在同样优选的实施方式中，q不为0，并且由na(y’)q’或n(y’)q”表示(y)q，其中n如上述所限定并且每个出现的y’独立地为脱碱基位点或核苷酸，如a、c、g、u或它们的类似物或等价物，并且q’为q–2并且q”为q–1。这样的寡核苷酸可以被表示为：
h–(x)p–(nag)m–na(y’)q’–h或
h–(x)p–(nag)m–n(y’)q”–h。
在另一个优选的实施方式中，p和q都不是0，并且分别由(x’)p’ag或(x’)p”g和na(y’)q’或n(y’)q”表示(x)p和(y)q，其中n、x’、y’、p’、p”、q’和q”如上述所限定。这样的寡核苷酸可以被表示为：
h–(x’)p’ag–(nag)m–na(y’)q’–h、
h–(x’)p”g–(nag)m–na(y’)q’–h、
h–(x’)p’ag–(nag)m–n(y’)q”–h或
h–(x’)p”g–(nag)m–n(y’)q”–h。
应当理解p’、p”、q’和q”不能是负整数。因此，当由(x’)p’ag或(x’)p”g表示(x)p时，p分别至少为1或至少为2，并且当由na(y’)q’或n(y’)q”表示(y)q时，q分别至少为1或至少为2。
因此，根据本发明的这一方面的寡核苷酸可以包含或由下列序列之一组成：(nag)m、ag(nag)m、g(nag)m、ag(nag)mna、g(nag)mna、(nag)mna、ag(nag)mn、g(nag)mn或(nag)mn。在一个实施方式中，寡核苷酸的一个或多个游离末端可以含有1至10脱碱基位点，如以下进一步限定。这些脱碱基位点可以是相同的或不同的类型，并且通过彼此之间的3’-5’、5’-3’、3’-3’或5’-5’键连接并与寡核苷酸连接。尽管技术上，在脱碱基位点中不存在3’和5’原子(因为不存在核苷碱基并且由此对环的原子编号)，为了清楚起见，这些编号是按照它们处于相应的核苷酸中来进行的。
无论何时(x)p和/或(y)q包含一个或多个脱碱基位点，该脱碱基位点可以存在于寡核苷酸的一个或两个末端上。因此，在根据本发明的这一方面的寡核苷酸的5’-末端和/或3’-末端，可以存在一个或多个脱碱基位点。但是，脱碱基位点也可以存在于寡核苷酸序列中，如下面进一步讨论。
由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示根据本发明的特别优选的寡核苷酸，其中m＝5、6、7且所有出现的n都为5-甲基胞嘧啶。由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示根据本发明的特别优选的寡核苷酸，其中m＝5、6、7，所有出现的n都为5-甲基胞嘧啶，p＝q＝0且x和y不存在。
由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示根据本发明的另一个特别优选的寡核苷酸，其中m＝5、6、7，所有出现的n都是5-甲基胞嘧啶，p＝0和q＝4并且出现的y都是脱碱基位点。
该第二方面的更优选的寡核苷酸已经描述于实验部分并且包含或由seqidno:16、17、19、20组成。
优选的寡核苷酸包含seqidno:16并且具有21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸的长度。
另一种优选的寡核苷酸包含seqidno:17(21个核苷酸和4脱碱基位点)并且21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸和4个脱碱基位点的长度
另一种优选的寡核苷酸包含seqidno:19或20并且具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸的长度。
包含脱碱基位点的寡核苷酸
在第三方面，本发明涉及的寡核苷酸在一个或两个末端上包含一个或多个脱碱基位点，如以下进一步的限定。优选地，在寡核苷酸的单一末端上存在2至20、更优选3至10、最优选4个脱碱基位点。一个或多个脱碱基位点可以存在于寡核苷酸的两个游离末端(5’和3’)或仅存在于一个末端上。根据本发明的这一方面的寡核苷酸优选地包含(nag)m，其中n和m如上述所限定，并且可进一步可选地包含本文中所讨论的任何的修饰，例如一个或多个碱基修饰、糖修饰和/或骨架修饰，例如5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、2’-o-甲基、硫代磷酸酯及它们的组合。
相对于不具有下文中说明的此类脱碱基位点的寡核苷酸而言，根据本发明的这一方面的在一个或两个末端包含一个或多个脱碱基位点的寡核苷酸具有改进的参数。
寡核苷酸部分或寡核苷酸
以接下来的章节中，进一步限定的根据本发明的寡核苷酸。除非另有明确说明，本申请适用于包含或由lgaqsnf/(nag)m组成的缀合物的寡核苷酸部分(即第一方面)、适用于包含或由(nag)m组成的寡核苷酸(即第二方面)和适用于包含或由在一个或两个末端包含一个或多个脱碱基位点的(nag)m组成的寡核苷酸(即第三方面)。因此，在整个说明书中，“根据本发明的寡核苷酸”可以替换为“包含或由lgaqsnf/(nag)m组成的缀合物的寡核苷酸部分”或“包含或由(nag)m组成的寡核苷酸”或“包含或由包含一个或多个脱碱基位点的(nag)m组成的寡核苷酸”。
根据本发明的寡核苷酸可以具有9至90或9至60或9至45或9至42或9至39或9至36个核苷酸或9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90个核苷酸。因此，很明显本发明还涵盖了任何特定的寡核苷酸，可以在无损害的条件下在给定的nag(其中n为c或5-甲基胞嘧啶)的任何位置通过起始和/或终止来设计该特定的寡核苷酸，一个或其他产生的序列可能是更有效的。
在一个实施方式中，包含或由lgaqsnf/(nag)m组成的根据本发明的寡核苷酸或缀合物可以进一步包含另外的寡核苷酸部分，该另外的寡核苷酸部分与存在于来自待治疗的个体的细胞中的序列互补。该另外的寡核苷酸部分可以例如为与位于存在于dm1/dmpk(seqidno:10)、sca8(seqidno:11)或jph3(seqidno:12)基因的转录本中的cug重复侧接的序列互补的序列。或者，该另外的寡核苷酸部分例如可以为与存在于dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中的重复序列cug不直接侧接的序列互补的序列。或者，该另外的寡核苷酸部分可以例如为与存在于dm1/dmpk、sca8或jph3基团的转录本中的重复序列cug不直接侧接的序列互补的序列，并且含有功能性基序。或者，该另外的寡核苷酸部分可以例如为与存在于dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中的重复序列cug不直接侧接的序列互补的序列，但是因为二级结构或三级结构而接近。优选地，其中n为c或5-甲基胞嘧啶的序列(nag)m为根据本发明的寡核苷酸的长度的至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％或更多。在这一点上，存在于根据本发明的寡核苷酸一个或两个末端的一个或多个脱碱基位点不是该序列的一部分。在更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸由(nag)m组成，其中n为c或5-甲基胞嘧啶。甚至更优选地，根据本发明的寡核苷酸由(nag)m组成，其中n为5-甲基胞嘧啶。甚至更优选地，根据本发明的寡核苷酸由(nag)7组成，其中n为5-甲基胞嘧啶。
根据本发明的寡核苷酸可以是单链的或双链的。双链的意味着该寡核苷酸为由两个互补链构成的异源二聚体，例如在sirna中。在优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸是单链的。但是，本领域技术人员能够理解单链寡核苷酸可以形成内部的双链结构是可能的。然而，在本发明上下文中仍然将这种寡核苷酸命名为单链寡核苷酸。与双链sirna寡核苷酸相比，单链寡核苷酸具有若干优势：(i)预期其合成比两个互补sirna链更加容易；(ii)具有更加广泛的化学修饰，从而能够优化使其在细胞中更有效地吸收、更好的(生理)稳定性和减少潜在的与种属有关的(generic)副作用；(iii)sirna具有更高的潜在的非特异性作用(包括脱靶基因)和夸大的药理学(例如，对通过治疗方案或剂量的有效性和选择性的控制可能性较低)；以及(iv)sirna较不太可能在细胞核中起作用并且不能针对内含子。
可以使用不同类型的核酸单体来生成根据本发明的寡核苷酸。相对于rna类寡核苷酸，根据本发明的寡核苷酸可以具有至少一个骨架修饰、和/或至少一个糖修饰和/或至少一个碱基修饰。
碱基修饰包括修饰形式(modifiedversion)的天然嘌呤碱基和嘧啶碱基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)，如次黄嘌呤、乳清酸(oroticacid)、agmatidine(一种修饰的胞苷)、赖西丁、2-硫代嘧啶(例如2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、2,6-二氨基嘌呤、g-钳(g-clamp)和它们的衍生物、5-取代的嘧啶(例如5-卤代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、超级t)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2,6-氨基腺嘌呤、超级g、超级a、和n4-乙基胞嘧啶、或它们的衍生物；和简并碱基(degeneratebases)或通用碱基，如2,6-二氟甲苯或缺碱基如脱碱基位点(例如1-脱氧核糖、1,2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-o-甲基核糖；或其中环内氧被氮置换的吡咯烷衍生物)。根据本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基修饰。可以在美国专利us6,683,173(epochbiosciences)(通过引用将其全部内容并入本文)中找到超级a、超级g和超级t的衍生物的实例。本发明也包括在上述寡核苷酸部分中引入多于一个的独特的碱基修饰。
根据本发明(即第一、第二、第三方面)的寡核苷酸优选地包含本文所确定的修饰的碱基和/或碱性位点，因这预期会提供具有改进的rna结合动力学和/或热力学性质的本发明的化合物或寡核苷酸、提供具有降低的或可接受水平的毒性和/或免疫原性的本发明的化合物或寡核苷酸、和/或增强本发明的寡核苷酸或化合物的药效学、药代动力学、活性、等位基因选择性、细胞摄取和/或潜在的胞内释放。
在一个更优选的实施方式中，一个或多个2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2,6-二氨基嘌呤碱基存在于所述根据本发明的寡核苷酸中。如上所指出的，未缀合至肽部分的根据本发明的寡核苷酸，即，由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示的寡核苷酸包含至少一个选自5-甲基胞嘧啶(5-甲基-c)和2,6-二氨基嘌呤的碱基修饰。在一个优选的实施方式中，未与肽部分缀合的根据本发明的这一方面的寡核苷酸不包含次黄嘌呤碱基修饰。
糖修饰包括修饰形式的核糖基部分(ribosylmoiety)，如2’-o-烷基或2’-o-(取代的)烷基(例如2’-o-甲基、2’-o-(2-氰乙基)、2’-o-(2-甲氧基)乙基(2’-moe)、2’-o-(2-硫甲基)乙基、2’-o-丁酰基、2’-o-炔丙基、2’-o-烯丙基、2’-o-(2-氨基)丙基、2’-o-(2-(二甲基氨基)丙基)、2’-o-(2-氨基)乙基和2’-o-(2-(二甲基氨基)乙基))；2’-脱氧(dna)、2’-o-烷氧羰基(例如2’-o-[2-(甲氧基羰基)乙基](moce)、2’-o-[2-(n-甲基氨基甲酰基)乙基](mce)和2’-o-[2-(n,n-二甲基氨基甲酰基)乙基](dcme))、2’-卤代(例如2’-f、fana(2’-f阿拉伯糖基核酸(2’-farabinosylnucleicacid)))；卡巴糖和氮杂糖修饰；和3’-o-烷基(例如3’-o-甲基、3’-o-丁酰基、3’-o-炔丙基以及它们的衍生物)。其他可能的修饰包括“桥接”或“双环”核酸(bna)，例如锁核酸(lna)、xylo-lna、α-l-lna、β-d-lna、cet(2’-o,4’-c约束的乙基(2’-o,4’-cconstrainedethyl))lna、cmoet(2’-o,4’-c约束的甲氧基乙基)lna、乙撑-桥接的核酸(ena)；解锁核酸(una)；环己烯基核酸(cena)、altriol核酸(ana)、己糖醇核酸(hna)、氟化的hna(f-hna)、吡喃糖基-rna(p-rna)、3’-脱氧吡喃糖基-dna(p-dna)；三环-dna(tcdna)；吗啉代(pmo)、阳离子吗啉代(pmoplus)、pmo-x；和它们的衍生物。根据本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个糖修饰。本发明还包含在所述的寡核苷酸中引入多于一个的独特的糖修饰。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸括至少一种选自2’-o-甲基、2’-o-(2-甲氧基)乙基、吗啉代、桥接核苷酸或bna的糖修饰，或者所述寡核苷酸包含桥接核苷酸和2’-脱氧修饰的核苷酸两者(bna/dna混合体(mixmer)或间隔体(gapmer))、或2’-o-(2-甲氧基)乙基核苷酸和dna核苷酸两者(2’-o-(2-甲氧基)乙基/dna混合体或间隔体)。更优选地，根据本发明的寡核苷酸是使用选自2’-o-甲基、2’-o-(2-甲氧基)乙基、吗啉代基、桥接的核酸(bna)、2’-o-(2-甲氧基)乙基/dna混合体、2’-o-(2-甲氧基)乙基/dna间隔体、bna/dna间隔体或bna/dna混合体的糖修饰对其全长进行修饰的。
在一个甚至更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含至少一个2’-o-甲基修饰。在一个更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸完全被2’-o-甲基修饰。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含1-10或更多的缺少核苷碱基的单体。这样的单体也可以被称为脱碱基位点或脱碱基单体。这种单体可能存在于或键接至或连接至或缀合至本发明的寡核苷酸的游离末端。
当由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示根据本发明的寡核苷酸时，脱碱基位点可以存在于该寡核苷酸的(x)p部分中和/或该核苷酸的(y)q部分中。当根据本发明的寡核苷酸存在于由lgaqsnf/(nag)m表示的化合物中时，脱碱基位点可以存在于寡核苷酸部分的自由(游离)末端处。这些脱碱基位点可以存在于寡核苷酸的末端区域，即在5’-末端和/或在3’-末端。另外，缀合物的寡核苷酸部分可以包含脱碱基位点。这些脱碱基位点可以连接至缀合物的所述寡核苷酸的游离末端上。由于与肽部分的缀合，只有一个末端可能游离。因此，当肽通过5’-末端缀合时，3’-末端是游离的，或者当肽通过3’-末端缀合时，5’-末端是游离的。另一方面，也可以通过存在于寡核苷酸部分内的核苷酸或其他部分而发生与肽部分的缀合，这使得5’-和3’-末端都游离，并由此可以连接一个或多个脱碱基位点。
除了存在于根据本发明的寡核苷酸的游离末端处的脱碱基位点之外，脱碱基位点也可以存在于寡核苷酸序列之中。在这一方面，脱碱基位点被视为碱基修饰。
在一个更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含1-10或更多个脱碱基位点或1-脱氧核糖、1,2-二脱氧核糖和/或1-脱氧-2-o-甲基核糖单体。这种(这些)单体可以存在于本发明的寡核苷酸的游离末端上。单体的数量可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多。相对于不包含这样的单体的对照寡核苷酸而言，在本发明的寡核苷酸中连接的许多这些脱碱基单体显示出增加的活性。这些单体可以被连接到3’或5’端核苷酸、或两者。所述脱碱基单体可以通过磷酸酯键、硫代磷酸酯键或二氨基磷酸酰胺酯(phosphodiamidate)键，以常规的5’→3’顺序或反向的(3’→5’)方式连接并且可以彼此连接或者连接到根据本发明的寡核苷酸的剩余部分。在一个优选的实施方式中，2-8个脱碱基位点或单体连接到本发明的寡核苷酸的3’或5’末端。在一个更优选的实施方式中，4个脱碱基位点或单体连接在根据本发明的(nag)m寡核苷酸的3’末端。甚至更优选地，4个脱碱基位点或单体连接在本发明的(nag)7寡核苷酸的3’末端。在一个最优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含4个存在于本发明所述的寡核苷酸的3’末端的1-脱氧核糖、1,2-二脱氧核糖、和/或1-脱氧-2-o-甲基核糖的单体，优选地其中本发明所述的寡核苷酸为(nag)7。
由本发明的寡核苷酸的熔融温度来至少部分地确定rna结合动力学和/或热力学性质(tm；以用于单链rna的寡核苷酸性质计算器(http://www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html)、使用碱基tm和根据本发明的寡核苷酸结合至其靶rna(使用rna结构形式4.5)的近邻模型来计算。
可以在动物模型中通过评估在所述动物的肌肉活组织检查中的cd4+和/或cd8+细胞的存在和/或炎性单核细胞渗透来评价免疫原性。也可以使用本领域技术人员已知的标准免疫测定法，在正在接受本发明的化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物或人类的血液中、通过检测识别本发明的所述化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分的抗体的存在来评估免疫原性和/或毒性。
通过检测细胞因子的存在和/或通过检测补体活化，可以在正在接受本发明的化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物或人类的血液中评估毒性。在这方面，细胞因子可以是il-6、tnf-α、ifn-α和/或ip-10。可以使用elisa，优选使用sandwichelisa来评估这些细胞因子的每一个的存在。可以使用来自r&dsystems的elisa试剂盒来评估人类il-6、tnf-α、il-10的存在，或者对于ifn-α使用来自verikine的elisa试剂盒，或对于猴il-6和tnf-α使用来自invitrogen的elisa试剂盒。可以通过elisa通过评估bb和c3a的存在来评估补体活化。为此目的的适合的elisa来自quidel(ca,sandiego)。
与在治疗前的、或用不具有修饰碱基的本发明的化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物的相应的肌肉活组织检查中各细胞类型的量相比较，免疫原性增加优选地对应于这些细胞类型中的至少一种的检出增加。可替代地，可以使用标准免疫测定法，通过检测识别本发明的所述化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分的存在或增加的量来评估免疫原性增加。
与在治疗前的、或用不具有修饰碱基的本发明的相应化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物的相应的肌肉活组织检查中各细胞类型的量相比较，免疫原性降低优选地对应于这些细胞类型中的至少一种的检出减少。可替代地，可以使用标准免疫测定法，通过本发明的所述化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分和/或中和抗体的不存在或减少的量来评估免疫原性降低。
与在治疗前的、或接受不具有修饰碱基的本发明的化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物的状况相比较，毒性增加优选地对应于如上确定的细胞因子的检出增加和/或对应于补体活化的检出增加。
与在治疗前的、或接受不具有修饰碱基的本发明的相应化合物或寡核苷酸或所述化合物的寡核苷酸部分治疗的动物的状况相比较，毒性降低优选地对应于如上确定的细胞因子的检出减少和/或对应于补体活化的检出减少。
骨架修饰包括存在于rna中的修饰形式的磷酸二酯。在这一方面，术语“骨架”应当被解释为核苷间键(internucleosidelinkage)。这样的骨架修饰的例子是硫代磷酸酯(ps)、手性纯硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(ps2)、膦酰基乙酸酯(磷酰乙酸酯，phosphonoacetate，pace)、膦酰基乙酰胺(磷酰乙酰胺，phosphonoacetamide，paca)、硫代膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酰胺、硫代磷酸酯前体药物、h-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷硫代磷酸酯、硼烷磷酸甲酯、硼烷硫代磷酸甲酯、硼烷膦酸甲酯、硼烷硫代膦酸甲酯和它们的衍生物。其他可能的修饰包括亚磷酰胺(phosphoramidite)、氨基磷酸酯、n3’→p5’氨基磷酸酯、磷酰二胺、硫代磷酰二胺、氨基磺酸盐(sulfamate)、二亚甲基亚砜、磺酸酯、硫代乙酰氨基核酸(tana)和它们的衍生物。根据本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个骨架修饰。本发明还包括在本发明的所述寡核苷酸中引入多于一个的独特的骨架修饰。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯修饰。在一个更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是完全硫代磷酸酯修饰的。
根据本发明的寡核苷酸的其他化学修饰包括肽核酸(pna)、硼簇修饰的pna、吡咯烷类氧基-肽核酸(popna)、乙二醇类或丙三醇类核酸(葡萄糖核酸，gna)、苏糖类核酸(苏糖核酸，tna)、无环苏氨醇类核酸(无环苏氨醇核酸，atna)、吗啉代寡核苷酸(pmo，pmo-x)、阳离子吗啉代基的寡聚体(pmoplus)、具有整合的碱基和骨架的寡核苷酸(onibs)、吡咯烷酰胺寡核苷酸(poms)和它们的衍生物。在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸是以吗啉代核苷酸(pmo)或肽核苷酸(pna)在其整个长度上进行修饰的。
随着核酸模仿技术的出现，产生与核酸本身在类型方面但不必在量的方面具有相似的、优选相同的杂交特性的分子已经成为可能。这种功能等价物也当然地适合在本发明中使用。
本领域技术人员将了解，不是每个糖、碱基和/或骨架都可以以相同的方式修饰。可以将若干个独特的糖、碱基和/或骨架修饰结合到根据本发明的一个单一的寡核苷酸中。
本领域技术人员将也能够认识到寡核苷酸具有许多合成衍生物。因此，“寡核苷酸”包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰二胺和h-膦酸酯衍生物。其还包含天然产生的和合成的寡核苷酸衍生物两者。
优选地，根据本发明的所述寡核苷酸包括rna，因为rna/rna双链体非常稳定。优选的是rna寡核苷酸包含为所述rna提供另外性质的修饰，例如对内切酶、外切酶和rnaseh的耐性；另外的杂交强度、增加的稳定性(例如在体液中)、增加或降低的柔性、减少的毒性、增加的细胞内运输、组织特异性等。优选的修饰如上所确定的。
优选地，根据本发明的所述寡核苷酸包含或由通过硫代磷酸酯骨架连接的2’-o-甲基rna单体组成。由2’-o-甲基rna单体和硫代磷酸酯骨架组成的此种寡核苷酸也可以被称为“2’-o-甲基硫代磷酸酯rna”。另外，当只有部分的根据本发明的寡核苷酸由2’-o-甲基rna单体和硫代磷酸酯骨架组成时，该部分可以被称为“2’-o-甲基硫代磷酸酯rna”。根据本发明的寡核苷酸然后包含通过硫代磷酸酯骨架连接的2’-o-甲基rna单体或2’-o-甲基硫代磷酸酯rna。因此，一个实施方式提供了根据本发明的寡核苷酸，其包含进一步含有修饰的rna，优选2’-o-甲基修饰的核糖(rna)，更优选2’-o-甲基硫代磷酸酯rna。
当然，一种或多种等价物彼此之间的杂交物和/或一起与核酸的杂交物也是适合的。
对于在细胞中通过rnaseh活性(ec.3.1.26.4)诱导dna-rna杂交分子的降解，含有至少部分的天然产生的dna核苷酸的根据本发明的寡核苷酸是有用的。
天然产生的rna核糖核苷酸或包含根据本发明的寡核苷酸的rna样(rna-like)合成核糖核苷酸也包含于本文中以形成双键rna-rna杂交物，其通过rna干涉或沉默(rnai/sirna)路径而充当酶依赖性反义，涉及通过反义链配对的靶rna识别以及随后的通过rna-诱导的沉默复合物(risc)的靶rna降解。
可替代地或另外地，通过结合至rna转录本的靶序列和进入加工的路径中(如翻译或阻断剪接供体或剪接受体位点)，根据本发明的寡核苷酸可以干扰前体rna或信使rna的加工或表达(立体阻塞、rnase-h非依赖性加工)，特别是但不限于rna剪接和外显子跳跃。另外，通过空间位阻和/或干扰靶rna的真实空间折叠和/或使其自身与初始结合至靶rna的蛋白质进行结合和/或对靶rna具有其他作用，根据本发明的寡核苷酸可以抑制蛋白、核因子及其他因子的结合，从而促进靶rna(优选mrna)的去稳定化(destabilization)和/或降低病态转录本(diseasedtranscript)或毒性转录本的数量从而引起疾病(如以文中确定的dm1)中核糖核酸病灶的核积累的减少。
如本文所限定的，根据本发明的寡核苷酸可以包含在其5’或3’末端的至少一个处具有(耐rnaseh的)化学取代的核苷酸，以提供细胞内稳定性，并且在其序列的其余部分内包含少于9个、更优选少于6个连续的(rnaseh-敏感的)脱氧核糖核苷酸。该序列的其余部分优选地为该序列的中心。这样的寡核苷酸被称为间隔体。在wo2007/089611中已经大量描述了间隔体。设计间隔体以能够招募和/或活化rnaseh。希望不被理论所束缚，据信rnaseh通过结合至由脱氧核糖构成的间隔体的中央区域而被招募和/或活化。设计优选地基本不依赖于rnaseh的根据本发明的寡核苷酸，从而具有基本上不能够招募和/或活化rnaseh的中央区域。在一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸的序列的其余部分，更优选其中央部分包含少于9、8、7、6、5、4、3、2、1个脱氧核糖或不含脱氧核糖。因此，根据本发明的该寡核苷酸优选部分地、直至全部地如前文中所限定的被取代。部分地被取代优选地是指根据本发明的寡核苷酸包含其核苷酸的至少50％已经被取代，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％(即完全地)被取代。
如上所指出的，根据本发明的由h–(x)p–(nag)m–(y)q–h表示的寡核苷酸优选地不包含肌苷(次黄苷或次黄嘌呤核苷，inosine)作为核苷酸或者次黄嘌呤作为核苷碱基。
另一方面，当根据本发明的寡核苷酸是具有肽部分的缀合物的部分时，所述寡核苷酸部分优选地含有或包含肌苷和/或含有能够形成摇摆碱基对(wobblebasepair)的碱基的核苷碱基。更优选地所述寡核苷酸部分包含肌苷。在本发明中，包含具有至少一个黄嘌呤核苷的寡核苷酸部分的化合物是有吸引力的。在一个特别优选的实施方式中，在(nag)m中所有的或几乎所有出现的a都被肌苷(i)所替换。当出现的所有的a都被i替换时，根据本发明的寡核苷酸包含m个出现的i。“几乎所有出现的a都被i替换”应当被理解为m–1、m–2或m–3个出现的a被i所替换。这样的化合物可用于治疗至少两种疾病，由(cug)n扩张重复所引起的肌强直性营养不良1型，和例如由(cag)n扩张重复所致的亨廷顿氏病(亨廷顿氏舞蹈病，huntington’sdisease)。否则，专门靶向这些扩张重复将需要两种化合物，每种化合物包含一个独特的寡核苷酸部分。包含肌苷和/或具有能够形成摇摆碱基对的核苷碱基的寡核苷酸部分可以被限定为：其中至少一个核苷酸已经被肌苷和/或含有能够形成摇摆碱基对的核苷酸所取代的寡核苷酸。本领域技术人员了解如何测试核苷酸是否含有能够形成摇摆碱基对的碱基。由于例如肌苷能够与尿嘧啶、腺嘌呤、和/或胞嘧啶形成碱基对，这意味着能够与尿嘧啶、腺嘌呤和/或胞嘧啶形成碱基对的至少一个核苷酸已经被肌苷所取代。但是，为了维护特异性，含有肌苷的寡核苷酸优选地包含至少一个能够与尿嘧啶、腺嘌呤或胞嘧啶形成碱基对的核苷酸的取代。更优选地，能够与尿嘧啶或腺嘌呤或胞嘧啶形成碱基对的所有核苷酸被肌苷取代。与重复序列(cug)n互补的寡核苷酸部分将优选地包含或由(nig)n组成，其中n为c或5-甲基胞嘧啶。由于在如本文所限定的寡核苷酸组成部分中，至少一个核苷酸已被肌苷和/或含有能够形成摇摆碱基对的碱基的核苷碱基所取代，本发明还包含与重复序列如(cug)n互补的寡核苷酸部分可以包含或由(nig)n组成，其中n为c或5-甲基胞嘧啶。如果以其中n为c或5-甲基胞嘧啶的(nig)n举例，以n为3为例，本发明包括基于给定通式的、例如在指定的位置包含1或2或3个黄嘌呤核苷的(nig)3的任何可能的寡核苷酸部分：(nag)(nig)(nag)、(nig)(nag)(nag)、(nig)(nag)(nig)、(nig)(nig)(nag)、(nig)(nig)(nig)(其中n为c或5-甲基胞嘧啶)。应当理解的是本发明的化合物的寡核苷酸部分的(nag)m部分或者包含(nig)n或者由(nig)n组成。在这一方面，n是等于或小于m的整数。在一个优选的实施方式中，n等于m，因此在本发明的化合物中，寡核苷酸部分的(nag)m部分由(nig)m组成。在本实施方式中，至少一个腺嘌呤核苷碱基含有碱基修饰，特别是次黄嘌呤核苷碱基。优选地，本发明的化合物的寡核苷酸部分的(nag)m部分包含1、2、3、4、5、...、m个黄嘌呤核苷碱基。
因此，在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含：
(a)选自2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2,6-二氨基嘌呤的至少一个碱基修饰；和/或
(b)选自2’-o-甲基、2’-o-(2-甲氧基)乙基、吗啉代基、桥接的核苷酸或bna、或者包含桥接的核苷酸和2’-脱氧修饰的核苷酸两者的寡核苷酸(bna/dna混合体或间隔体)、或2’-o-(2-甲氧基)乙基核苷酸和dna核苷酸两者(2’-o-(2-甲氧基)乙基/dna混合体或间隔体)的至少一个糖修饰；和/或
(c)选自硫代磷酸酯和磷酰二胺(phosphordiamidate)的至少一种骨架修饰。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸是使用选自(a)碱基修饰之一；和/或(b)糖修饰之一；和/或(c)骨架修饰之一的一个或多个相同的修饰在整个长度上进行修饰的。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或化合物的寡核苷酸部分包含选自由2’-o-甲基硫代磷酸酯、吗啉代磷酰二胺(吗啉代磷酰二胺酯，morpholinophosphorodiamidate)、锁核酸和肽核酸组成的组中的至少一个的修饰。在一个更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或化合物的寡核苷酸部分包含一个或多个2’-o-甲基硫代磷酸酯单体。在一个更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或化合物的寡核苷酸部分由2’-o-甲基硫代磷酸酯单体组成。换句话说，优选的是根据本发明的化合物的寡核苷酸部分为2’-o-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸。在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸或化合物的寡核苷酸部分包含选自2,6-二氨基嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、8-氮杂-7-脱氮杂鸟嘌呤核苷和/或次黄嘌呤的至少一个碱基。
由lgaqsnf/(nag)m表示的缀合物的连接部分
为了制备根据本发明的第一方面的、可以由lgaqsnf/(nag)m表示的化合物，通过将化合物偶联至氨基酸或肽的已知方法将寡核苷酸部分偶联至根据本发明的这一方面的肽或肽模拟物部分。一种常见的方法是将部分(基团，moiety)连接到肽或肽模拟物的游离氨基或游离羟基或游离羧酸基团或游离硫醇基团上。常见的缀合方法包括硫醇/马来酰亚胺偶联、酰胺或酯或硫醚键的形成、或异构二硫键的形成。本领域技术人员很清楚可以用来实现所需的偶联的标准化学法。可以将寡核苷酸的部分直接偶联到肽部分或者可以通过间隔子(spacer)或接头(linker)偶联。这种间隔子或接头可以是二价的，或者是多价的，从而将一个肽或肽模拟物部分与一个寡核苷酸部连接。多价间隔子或接头可以用于将多于一个的肽或肽模拟物部与一个寡核苷酸部分连接。二价和多价的间隔子或接头对本领域技术人员是已知的。寡核苷酸部分不必共价连接到根据本发明的这一方面的肽或肽模拟物部分。其也可以通过静电相互作用缔合(associate)或缀合。这样的非共价键结合也是本发明的主题，并且应当被理解为包含在术语“连接”或“键合”中。在本发明的一个实施方式中，还涉及包含根据本发明的这一方面的肽或肽模拟物部分和连接部分的化合物，该连接部分用于将肽部分连接至寡核苷酸部分。该连接部分可以不是肽或者可以是肽。该连接部分例如可以是(聚)阳离子基团，其与生物活性的聚核苷酸或寡核苷酸络合。此种(聚)阳离子基团可以是直链形式或支链形式的精胺或聚乙烯亚胺、聚鸟氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸等。该连接部分也可以是中性的，例如包含或由聚乙二醇组成的连接部分。
根据本发明的第一方面的化合物的肽或肽模拟物部分可以通过c-末端、通过n-末端或通过氨基酸的侧链而连接、偶联或缀合至寡核苷酸部分，并且可以通过寡核苷酸部分的特定的核苷酸的碱基、骨架或糖部分而连接至5’-末端核苷酸、3’-末端核苷酸或非末端核苷酸。
在本发明这方面中可以使用任何可能已知的将寡核苷酸部分偶联或连接至肽部分的方式来获得本发明此方面中的所述化合物。肽部分可以通过包括但不限于以下方式偶联或连接至寡核苷酸部分：包含硫醚、酰胺、胺、肟、二硫化物、四氢噻唑、脲、硫脲、酯、硫酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、腙、硫酸酯、氨基磺酸酯、磷酸酯、硫代磷酸酯或二羟乙肟基团的接头，或通过狄尔斯–阿尔德(diels-alder)环加成反应、施陶丁格(staudinger)连接反应、自然连接反应或惠斯更(huisgen)1,3-偶极环加成反应或其铜催化的变体形式获得的键。在一个优选的实施方式中，所述键包含硫醚基团。在一个实施方式中，本发明提供了一种包含含有lgaqsnf的肽部分和含有(nag)m的寡核苷酸部分的化合物，其中n为5-甲基胞嘧啶，其中所述化合物由通式a表示。
其中，
r1为
r2为乙酰基或h；
r3为取代的或未取代的(c1-c10)烷基、(c1-c10)环烷基、芳基或(c1-c10)芳烷基；
r4为(c1-c15)烷基、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇或衍生物；
x为s、c＝o或nh；
y为s或nh；
z为s或o；
r和s为0或1，条件是r+s＝0或1，
其中r1通过酰胺键或酯键在肽部分的氨基酸的n-末端、c-末端或侧链处与胺或醇连接；
其中r4连接至寡核苷酸部分的5’或3’端。
优选地，当r＝1时，x＝s或nh。
在一个优选的实施方式中，本发明的该方面提供了由式i-vii中任一个表示的化合物，
在根据式i的化合物中，x为肽部分的n-末端氨基；在根据式ii的化合物中，x为肽部分的c-末端羧基；在根据式iii-viii的任一化合物中，r1通过酰胺键连接到肽部分的n-末端。在化合物v、vi和vii中，“环己基”应被理解为“环己烷-1,4-二基”或“1,4-环己烷二基”。
式i中表示的缀合为本领域技术人员所熟知并且优选地如实施例中所说明的进行合成。同样地，缀合的其他方法为本领域所熟知或将为本领域所熟知。所述肽部分可以从氨基酸的n-末端、c-末端或侧链连接到寡核苷酸部分上；并且可以从5’-末端核苷酸连接。本领域技术人员了解所述肽部分也可以通过特定单体的碱基、骨架或糖部分而连接至3’-末端核苷酸或非末端单体上。除了通过其3’-末端将寡核苷酸连接到连接部之外，根据本发明的这一方面的同样优选的化合物与化合物i-viii相同。
在脱碱基位点或单体存在于或连接至本发明的化合物的寡核苷酸部分的末端的情形下，肽部分不连接至该相同的末端。因此，在肽部分偶联至寡核苷酸部分的5’末端的情况下，那么如果引入脱碱基位点或单体的话，则所述脱碱基位点或单体连接至该寡核苷酸部分的3’末端。
由lgaqsnf/(nag)m表示的缀合物的肽部分
正如上述已经指出的，根据本发明这一方面的化合物的肽部分包含lgaqsnf或由lgaqsnf组成。本发明这一方面的上下文中的肽部分包含至少7个氨基酸。根据本发明的这一方面的化合物可以包含多于一个的本文所确定的肽：据本发明的这一方面的化合物可以包含1、2、3、4、5、6、7、8个连接至寡核苷酸部分的肽部分，所有都是本文中所确定的。该肽可以完全由天然存在的l-氨基酸所构建，或者相对于l-氨基酸的可以含有一个或多个对骨架和/或(一个或多个)侧链的修饰。可以通过引入表现出与天然氨基酸具有相似性的氨基酸模拟物而导入这些修饰。包含一个或多个氨基酸模拟物的以上描述的肽的基团被称为肽模拟物。在本发明这一方面的上下文中，氨基酸的模拟物包括但不限于β2-和β3-氨基酸、β2,2-β2,3、和β3,3-二取代的氨基酸、α,α-二取代的氨基酸、氨基酸的斯塔提尼衍生物(statinederivatives)、d-氨基酸、α-羟基酸、α-氨基腈、n-烷基氨基酸等等。另外，在本发明这一方面的肽部分中的氨基酸可以被一个或多个糖类基团和/或衍生物糖基化，或者可被磷酸化。
此外，肽的c-末端可以为羧酸或羧酰胺、或者由引入上述的氨基酸模拟物之一而产生的其他。此外，上述描述的肽部分可以含有以下列基团替换的一个或多个自然肽键，所述基团包括但不限于：磺酰胺、逆酰胺(retroamide)、含氨基氧基的键、酯、烷基酮、α,α-二氟代酮、α-氟代酮、类肽键(n-烷基化甘氨酰基酰胺键)。此外，上述描述的肽部分可以在氨基酸侧链(参见相应天然氨基酸的侧链)中含有取代基，例如4-氟苯丙氨酸、4-羟基赖氨酸、3-氨基脯氨酸、2-硝基酪氨酸、n-烷基组氨酸或β-支链氨基酸或β-侧链碳原子处的手性与天然手性相反的β-支链氨基酸模拟物(例如，别苏氨酸、别异亮氨酸及衍生物)。在一个实施方式中，上述描述的肽可以含有氨基酸的接近结构类似物或氨基酸模拟物，例如鸟氨酸代替赖氨酸、高苯丙氨酸或苯甘氨酸代替苯丙氨酸、β-丙氨酸代替甘氨酸、焦谷氨酸代替谷氨酸、正亮氨酸代替亮氨酸或硫氧化形式的甲硫氨酸和/或半胱氨酸。本申请涵盖了上述肽部分的直链或环状形式，以及它们的逆序、构型翻转(inverso)和/或逆顺序构型翻转的类似物。对于本领域技术人员来说，许多更加接近的变形可能是已知的，但是本文没有提及的这些变形的事实并不限制本发明的范围。在一个实施方式中，根据本发明的这一方面的肽部分或肽模拟物部分为至多30个氨基酸的长度，或至少25氨基酸或20氨基酸或19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸长度。优选的肽部分包含或由lgaqsnf与在n-末端和/或c-末端的至少0、1、2、3或更多个氨基酸组成：例如xxxlgaqsnfxxx，其中x可以是任何氨基酸。
应用
本发明的化合物或寡核苷酸对于治疗、延缓和/或预防和/或治疗和/或治愈和/或改善人类遗传性疾病，如分别由dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中的重复扩张所引起的强直性肌营养不良1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型特别有用。优选地，这些基因来自人类来源。分别由seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12表示人类dmpk、sca8、jph3基因的优选的基因组dna序列。分别由seqidno:13、seqidno:4、seqidno:15表示人类dmpk、sca8、jph3基因相应优选的编码cdna序列。
在一个优选的实施方式中，在本发明的上下文中，当本文所设计的化合物或寡核苷酸能够减少或降低患者的细胞中、患者的组织中和/或患者中的dm1/dmpk、sca8或jph3基因的病变的等位基因的转录本中的cug重复数量时，这种化合物或寡核苷酸能够延缓和/或治疗和/或治愈和/或预防和/或改善人类遗传性疾病，如由dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中cug重复扩张所致的强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型。
尽管在大多数患者中，所述患者的基因组中的转录基因序列中存在“纯”cug重复。但是，本发明也包括，在一些患者中，当例如所述重复中穿插了至少1、2或3个不适合于所述重复的核苷碱基的核苷酸时(braidac.,etal,)所述重复不符合“纯”或符合为“变体”。
根据本发明的寡核苷酸可以不是与靶cug重复100％反向互补。一般地，本发明的寡核苷酸可以与cug重复至少是90％、95％、97％、99％或100％反向互补。
在dm1的情况下，cug重复存在于dmpk转录本的外显子15中。本文中，可以将cug重复限定为：受试者(包括人类受试者)的基因组中的dmpk基因的转录的基因序列中至少30、35、38、39、40、45、50、55、60、70、100、200、500个重复单元cug或更多个包含三核苷酸重复单元cug的连续重复。
在脊髓小脑性共济失调8型的情况下，所述重复扩张位于sca8基因的3’utr中。该sca8基因座被双向转录并且产生具有亦或(cug)n亦或(cag)n扩张的rna。(cag)n扩张转录本产生接近纯的聚谷氨酰胺(polyq)蛋白。在本文中可以将cug或cag重复限定为：受试者(包括人类受试者)的基因组中的sca8基因的转录的基因序列中，至少65、70、75、80、100、200、500个所述重复单元cug或更多个分别地包含cug三核苷酸重复单元、包含cag三核苷酸重复单元的重复单元cag的连续重复。
亨廷顿氏病样2型是由jph3基因的转录本中的(cug)n扩张而引起的。取决于jph3转录本的可变剪接，cug重复可以存在于内含子、3’utr或编码聚亮氨酸或聚丙氨酸段的编码区域中。在本文中cug重复可以被限定为在受试者(包括人类受试者)的基因组中的jph3基因的转录的基因序列中，至少35、40、41、45、50、50、55、60或更多个包含三核苷酸重复单元cug的重复单元cug的连续重复。
在整个本发明中，术语cug重复可以用(cug)n来替代，其中n为10、20、30或不大于30的整数(当该重复存在于健康个体的dmpk转录本的外显子15中时)；20、30、40、50、60、65或不大于65的整数(当该重复存在于健康个体的sca8基因中时)或10、20、30、35或不大于35的整数(当该重复存在于健康个体的jph3基因中时)。在dm1、脊髓小脑性共济失调8型或亨廷顿氏病患者的情况下，n可以具有上如上所指出的其他值。
优选地，这意味着在所述患者的细胞中、所述患者的组织中和/或所述患者体内，本发明的化合物或寡核苷酸减少了含有延伸的或不稳定数量的cug重复的与疾病相关的或导致疾病的或突变型的转录本的检出量。可替代地或结合前面的句子，所述化合物可以减少所述突变型转录本的翻译。与治疗前cug重复的数量或所述突变型转录本的量相比，cug重复的数量或所述突变型转录本的量的减少或降低可以是至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。可以通过northern印迹法或q-rt-pcr来评估该减少，优选地按实验部分中的来进行。可以首先在如实验中使用的包含500cug重复的细胞系统中测试本发明的化合物或寡核苷酸。
可替代地或与先前的优选实施方式相结合，在本发明的上下文中，当如本文中所设计的本发明的化合物或寡核苷酸在个体中能够缓解一种或多种症状和/或特征和/或改善与强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型相关联的参数时，该化合物或寡核苷酸能够延缓和/或治愈和/或治疗和/或预防和/或改善人类遗传性疾病，如由dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中cug重复扩张引起的强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型。如果在使用一定剂量的如本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸治疗至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间后，所述参数得到了改善或所述症状或特征得到了减少，那么本文所限定的化合物或寡核苷酸能够改善一个参数或减少症状或特征。
在这个背景下的改善可以是指所述参数已经向着健康人具有的所述参数的值和/或向着相对于同一个体在开始治疗时的所述参数的值的所述参数的值显著地变化。
在这个背景下的减少或缓解可以是指所述症状或特征已经向着健康人所特有的不具有所述症状或特征的方向和/或向着相对于同一个体在开始治疗时的状态的所述症状或特征的方向显著地变化。
在这个背景下，强直性肌营养不良症1型的优选症状为肌强直、肌肉紧张(肌力，musclestrength)或绊倒和跌倒。可以由医生使用已知的或描述的方法来评估这些症状中的每一个。
可以使用如本领域技术人员已知的emg(肌电图)来评估肌强直：emg为握力、肌强直、和/或肌强直性营养不良中的疲劳的定量测试(tonesc.etal,)。如果通过emg评估的肌强直具有检出的向健康人的emg图样方向的降低，优选地在使用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物治疗至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间后，申请人优选地得出所述肌强直已经得到了减轻或缓解的结论。
强直性肌营养不良症1型的其他优选症状为肌肉紧张(肌力)(hébertetal,)或绊倒和跌倒的减少(wiles,etal,)。同样，如果肌肉紧张(肌力)具有向健康人的肌肉紧张(肌力)方向的检出改善或绊倒和跌倒向着健康人的绊倒和跌倒方向的检出减少，优选地在使用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长的治疗后，申请人优选地得出所述肌肉紧张(肌力)得到了改善或所述绊倒和跌倒得到了减少或缓解的结论。
在这个背景下，脊髓小脑性共济失调8型的优选的症状包括共济失调、本体感受性和机能协调缺乏，包括步态机能障碍和全身缺乏运动控制(包括上部运动神经元功能异常、吞咽困难、末梢感觉失调)。可以由医生使用已知和描述的方法来评估这些症状的每一个：可以由医生使用已知和描述的方法来评估共济失调：如静态姿势描记或动态姿势描记。静态姿势描记实质上测量平衡和摇晃的各个方面。但极少记载了使用该技术用于诊断与sca8相关联的症状的存在，申请人设想在其他接近的相关指征如sca6中用于诊断相同症状的技术可以用于诊断sca8(nakamuraetal,，januarioetal,)。例如，icars(国际合作共济失调评估评分，internationalcooperativeataxiaratingscore)可以用于诊断sca8(在nakamuraetal,或trouillasp.etal,中评估)。作为另一个例子，oasi(总体稳定指数，overallstabilityindex)可以用于诊断sca8(在januarioetal,中评估)。
对于更加精细的运动功能技能，可以考虑常见的手功能测试如jebson定时的测试、普渡钉板(perduepegboard)测试或9孔插棒(peghole)测试，尽管再次，其对该指征是不特异的或无效的。如上所述评估的，如果存在脊髓小脑性共济失调8型的这些症状的至少一个向着健康人的所述症状的值的方向可检出的减少或如上述描述的评估的icars和/或oasi向着健康人的所述icars或oasi值的方向的可检出的变化，则优选地在使用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸的至少至少一周、一个月、六个月、一年或更长的治疗后，申请人优选地得出使用本发明的化合物使得所述症状或所述icars或oasi已经得到减少或缓解或改变的结论。
在这个背景下，亨廷顿氏病样2型的优选的症状包括舞蹈病和/或张力障碍舞蹈病和/或张力障碍。可以由医生使用已知的或描述的方法来评估这些症状的每一个。它们可以通过遗传测试(walker,etal)和通过使用量表如统一亨廷顿氏病评定量表运动障碍(unifiedhuntington’sdiseaseratingscalemovementdisordersvol.ii,no.2,1996,pp.136-142,和mahantetal,)的临床评估来诊断。如上所述评估的，如果亨廷顿氏病样2型的这些症状的至少一个具有向着健康人的所述症状的值的方向可检出的减少，优选地在使用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长的治疗后，则申请人优选地得出使用本发明的化合物或寡核苷酸使得所述症状得到了减少或缓解的结论。
强直性肌营养不良症1型的参数可以为特定转录本(例如clc-1、serca、ir、tnnt、tau)的剪接模式。强直性肌营养不良症的特征在于各种各样的转录本的早期的(萌芽期的，embryonic)剪接模式(aberrantalternativesplicingandextracellularmatrixgeneexpressioninmousemodelsofmyotonicdystrophy；hongquingd.etal)。可以使用pcr或通过使用基因组筛选来可视化这些基因的剪接模式。在用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸治疗至少一个月、六个或更长后，当发现至少一个如上确定的基因的早期的剪接模式向着相应基因的野生型剪接模式变化，那么可以说本发明的化合物或寡核苷酸能够改善个体中与强直性肌营养不良症1型相联系或相关联的参数。
强直性肌营养不良症1型的另一个参数可以是胰岛素抗性(通过血糖和hba1c水平来测量)，其正常范围分别为3.6至5.8mmol/l和3至8mmol/l。这些数值向着正常范围减少或在正常范围内减少指示着积极的益处。当用一定剂量的本文所确定的本发明的化合物或寡核苷酸的治疗至少一个月、六个月或更长后，发现这些数值的至少一个向着野生型数值变化时，那么可以说本发明的化合物或寡核苷酸能够改善个体中与强直性肌营养不良症1型相联系或相关联的参数。
强直性肌营养不良症1型的另一个参数是rna-mbnl(盲肌蛋白)灶(小点)或细胞核中核内包涵物的数目，可以使用荧光原位杂交(fish)来可视化它们。dm1患者在其细胞核中具有5至20个rna-mbnl灶(tanejakletal,)。可以将核内包涵物或灶定义为存在于dm1患者的细胞的细胞核中的聚集体或异常结构，并且其在健康人的细胞的细胞核中并不存在。当发现细胞核中的灶或核内包涵物的数量发生了变化(由fish分析)并且优选地与在开始治疗时的核内灶或核内包涵物的数量相比减少了，那么可以说本发明的化合物或寡核苷酸能够改善个体中与强直性肌营养不良症相关联或相关的参数。与在开始治疗时的灶或核内包涵物的数目相比，所述灶或核内包涵物的数目可以减少至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。优选地，盲肌蛋白mbnl从这些聚集或核内包涵物上脱离(可以使用免疫荧光显微术分析的)并且更优选地在细胞中可以自由利用。与在开始治疗时的rna-mbnl的数目相比，rna-mbnl的数目可以减少至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。可以使用免疫荧光显微术来检测细胞中可以自由获得的mbnl：可以看到更加弥漫染色的mbnl，并且更少直至不再存在与核(cug)n共同定位的聚集或核内包涵物。
脊髓小脑性共济失调8型的参数包括聚谷氨酰胺蛋白数量的减少或降低(优选地通过蛋白质印迹(westernblotting)来评估)和/或核内聚谷氨酰胺包涵物的减少或降低(优选地通过免疫荧光显微术来评估)。除了形成聚谷氨酰胺蛋白包涵物的(cag)n转录本之外，(cag)n转录本还形成使用fish可以被可视化的核内包涵物或灶。优选在神经元中评估聚谷氨酰胺蛋白和核内包涵物的存在。核内包涵物或灶可以被定义为在脊髓小脑性共济失调8型患者的细胞的细胞核中存在聚集体或异常结构，并且其在健康人的细胞的细胞核中不存在。当与开始治疗时的核内灶或核内包涵物的数量相比时，发现细胞核中灶或核内包涵物的数量发生了变化(由fish分析)并且优选地减少了，那么可以说本发明的化合物或寡核苷酸能够改善个体中与脊髓小脑性共济失调8型相关联或相关的参数。与开始治疗时的灶或核内包涵物的数目相比，灶或核内包涵物的数目的减少可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。与在开始治疗时检测的所述蛋白质的量相比，聚谷氨酰胺蛋白数量的量的减少可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。另一个参数可以是(cug)n转录本的减少或所述突变型转录本的量的减少。这与在开始治疗时检测的所述转录本的量相比，可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。
亨廷顿氏病样2型的参数包括致病性聚亮氨酸或聚丙氨酸段的减少或降低(蛋白质印迹和免疫荧光显微术)。与在开始治疗时评估的所述段的量相比，该聚亮氨酸或聚丙氨酸段的数量的量的减少可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。另一个参数可以为(cug)n转录本的减少或所述突变型转录本的量的减少。与在开始治疗时检测的所述转录本的量相比，其可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。亨廷顿氏病样2型的另一个参数包括用于强直性肌营养不良症的细胞核中的rna-mbnl(盲肌蛋白)灶的数目。
根据本发明的化合物或寡核苷酸适合于在受强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8和/或亨廷顿氏病样2型的影响或具有患有它们的风险的个体的体内直接给予至细胞、组织和/或器官，并且可以直接地体内、离体或体外给予。个体或受试者或患者优选地为哺乳动物，更优选人类。在这一点上的组织或器官可以为血液。
在一个优选的实施方式中，使用从0.01nm至1μm范围内的化合物或寡核苷酸的浓度。更优选地，所使用的浓度为0.05至400nm、或0.1至400nm、或0.02至400nm、或0.05至400nm，甚至更优选1至200nm。优选的浓度为0.01nm至1μm。更优选地，所使用的浓度为0.3至400nm，甚至更优选1至200nm。
根据本发明的化合物或寡核苷酸的剂量范围优选地是基于临床试验(体内应用)中升剂量研究来设计的，这存在严格的程序要求。本文所限定的化合物或寡核苷酸可以在0.01至500mg/kg、或0.01至250mg/kg或0.01至200mg/kg或0.05至100mg/kg或0.1至50mg/kg或0.1至20mg/kg的剂量下使用，优选0.5至10mg/kg。
以上给出的化合物或寡核苷酸的浓度或剂量的范围是对于体外应用或离体应用的优选浓度或剂量。本领域技术人员能够理解，取决于所使用的化合物或寡核苷酸的同一性、待治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所使用的培养基以及转染和孵育条件，所使用的化合物或寡核苷酸的浓度或剂量可以进一步变化或需要任意进一步优化。
更优选地，在本发明中使用的用于预防、治疗或延缓强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型的化合物或寡核苷酸是合成产生的并且以药用组合物的配方形式直接给予至细胞、组织、器官和/或患者或个体或受试者。给予本发明的化合物或寡核苷酸可以是局域(local)、局部(topical)、全身性(systemic)和/或胃肠道外(parenteral)给予。将所述药物组合物递送至受试者优选通过一种或多种胃肠道外注射(例如静脉和/或皮下和/或肌内和/或鞘内和/或鼻内和/或心室内和/或腹膜内)、眼部给予、泌尿生殖道给予、肠内给予、玻璃体内给予、脑内给予、鞘内给予、硬膜外给予和/或口腔给予进行，优选在人体的一个或多个位点进行注射。鞘内给予或心室内给予(在脑脊髓液中)优选地是通过将扩散泵导入受试者的体内实现的。若干种扩散泵为本领域技术人员的熟知。
用于靶向本文所限定的化合物或寡核苷酸的药物组合物可以包含各种赋形剂如稀释剂、填充剂、防腐剂、增溶剂等，这例如可以在remingtonetal.中找到。本发明中所描述的化合物可以具有至少一个可离子化的基团。可离子化的基团可以是碱或酸，并且可以是带电的或中性的。可离子化的基团可以作为具有携带相反电荷的适合的平衡离子的离子对存在。阳离子平衡离子的实例是钠、钾、铯、tris(三羟甲基氨基甲烷)、锂、钙、镁、三烷基铵、三乙基铵和四烷基铵。阴离子平衡离子的实例是氯化物、溴化物、碘化物、乳酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐和柠檬酸盐。已经描述了平衡离子的实例(例如kumaretal.,其整体通过引用并入本文)。可以以其盐形式制备本发明的化合物或寡核苷酸。优选地，以其钠盐的形式制备。本发明的化合物或寡核苷酸可以可选地被进一步配制为组合物，该组合物可以是含有药用稀释剂和载体的药用溶液或组合物，并且可以向该组合物中加入药用添加剂以将该配方调至所需的ph和/或渗透压，例如无菌水或磷酸盐缓冲液中并且用酸或碱调节至所述的ph且用有机盐或无机盐调节至所需的渗透压的溶液或稀释液。例如可以使用hcl将溶液调节至所需的ph，而可以使用nacl将溶液调节至所述的渗透压。
药物组合物可以包含增强所述化合物或寡核苷酸的稳定性、溶解性、吸收性、生物利用度、活性、药代动力学、药效学和细胞摄取的赋形剂，特别是能够形成络合物、纳米粒子、微颗粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊洛沙姆(poloxamers)或普朗尼克(pluronics)、聚合物囊泡、胶体、微泡、囊泡、胶束、脂质复合物和/或脂质体的赋形剂。纳米粒子的实例包括聚合物纳米粒子、黄金纳米粒子、磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、脂质纳米粒子、糖颗粒、蛋白质纳米粒子和肽纳米粒子。
在一个实施方式中，本发明的化合物或寡核苷酸可以与另一种已知的用于治疗、延缓和/或预防和/或治疗和/或治愈和/或改善人类遗传性疾病(如分别由dm1/dmpk、sca8或jph3基因的转录本中的重复扩张所引起的强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型)的化合物一起使用。这样的其他化合物可以是类固醇。这种组合使用可以是顺序使用：以不同的组合物给予各个组分。或者，各个化合物可以在单一组合物中一起使用。
在本发明的方法中，我们可以使用赋形剂，该赋形剂可进一步辅助增强所述化合物或寡核苷酸的稳定性、溶解性、吸收性、生物利用度、活性、药物动力学、药效学和向细胞及细胞内的递送的赋形剂，特别是能够形成络合物、囊泡、纳米粒子、微粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊洛沙姆或普朗尼克、聚合物囊泡、胶体、微泡、囊泡、胶束、脂质复合物和/或脂质体的赋形剂，该赋形剂将化合物、物质和/或寡核苷酸络合或捕获于囊泡或脂质体中而递送通过细胞膜。纳米粒子的例子包括黄金纳米粒子、磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、脂质纳米粒子、糖颗粒、蛋白质纳米粒子和肽纳米粒子。另一组递送系统是聚合物纳米粒子。许多这些物质在本领域中众所周知。
适合的物质包含聚合物(例如聚乙烯亚胺(pei)、exgen500、聚丙烯亚胺(ppi)、聚(2-羟基亚丙基亚胺(php))、右旋糖酐衍生物(例如聚阳离子如二乙基氨基乙基氨基乙基(deae)-右旋糖酐，其是众所周知的dna转染试剂，可以与氰基丙烯酸丁酯(pbca)和氰基丙烯酸己酯(phca)组合以配制阳离子纳米粒子，该阳离子纳米粒子能够将所述化合物递送通过细胞膜而进入细胞中)、氰基丙烯酸丁酯(pbca)、氰基丙烯酸己酯(phca)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、多胺(例如精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、壳聚糖、聚(酰氨基胺)(pamam)、聚(酯胺)、聚乙烯醚、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、环糊精、透明质酸、多聚乙酰神经氨酸和它们的衍生物)、树枝状聚合物(例如聚(酰氨基胺)、脂类{例如1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、二油酰基二甲基氯化铵(dodac)、磷脂酰胆碱衍生物[例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dspc)]、溶血-磷脂酰胆碱衍生物[例如1-硬脂酰基-2-溶血-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(s-lysopc)]、鞘磷脂、2-{3-[双-(3-氨基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-n-二-十四烷基(ditetracedyl)氨基甲酰基甲基乙酰胺(rpr209120)、磷酸甘油衍生物[例如1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油钠盐(dppg-na)、磷脂酸衍生物[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸钠盐(dspa)、磷脂酰乙醇胺衍生物[例如二油酰基-l-r-磷脂酰乙醇胺(dope)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)、2-二植烷酰(phytanoyl)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dphype)]、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基铵(dotap)、1,3-二-油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基(spermyl))-丙酰胺(dosper)、(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(dmrie)、(n1-胆甾醇基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(cdan)、二甲基二-十八烷基溴化铵(ddab)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(popc)、(b-l-精氨酰基-2,3-l-二氨基丙酸-n-棕榈基-n-油酰基-酰胺三盐酸盐(atufect01)、n,n-二甲基-3-氨基丙烷衍生物[例如1,2-二硬脂酰基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(dsdma)、1,2-二油酰氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(dodma)、1,2-二亚油基氧基-n,n-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)、磷脂酰丝氨酸衍生物[1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-l-丝氨酸钠盐(dops)]、胆甾醇}、合成两亲物(saint-18)、脂质体、蛋白质(例如白蛋白、明胶、端胶原)、肽(例如pepfects、nickfects、聚精氨酸、聚赖氨酸、cady、mpg)、它们的组合和/或能够自我组装成颗粒(该颗粒能够将所述化合物递送至细胞)的病毒壳体蛋白。脂质体代表脂质体转染剂的实例。其由两个脂质成分组成，阳离子脂质n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)(cp.dotap，其是甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)。该中性成分介导细胞内释放。
除了这些纳米颗粒材料之外，阳离子肽精蛋白(鱼精蛋白，protamine)提供了将所述化合物或寡核苷酸配制为胶体的替代途径。这种胶体纳米颗粒系统能够形成所谓的蛋白微粒(proticles)，其可以通过简单的自组装过程来制备以包装和介导本文所限定的化合物的细胞内释放。本领域技术人员可以选择和适用任何上述的或其他市售的或非市售的可替代的赋形剂和递送系统以包装和递送用于在本发明中使用的化合物或寡核苷酸，从而在人类中递送所述化合物或寡核苷酸用于治疗、预防和/或延缓强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型。
此外，可以特别地设计能够共价地或非共价地连接至化合物或寡核苷酸的另一种配体以促进其进入细胞、胞浆和/或其细胞核中的摄取。此类配体可以包含(i)识别促进细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(-样)结构)和/或(ii)能够促进向细胞内摄取和/或所述化合物或寡核苷酸由囊泡(例如，核内体或溶酶体)的细胞内释放的化合物。这种靶向配体也可以包含促进所述化合物或寡核苷酸通过血脑屏障摄取进入脑的分子。在本发明的范围内，已经可以将本发明的化合物的肽部分视为配体。
因此，在一个优选的实施方式中，本文所限定的化合物或寡核苷酸是药物中的一部分或被认为是药物并且与至少一种赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或将所述化合物或寡核苷酸递送至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置一起提供。因此，本发明还包含药用组合物，该组合物包含所述化合物或寡核苷酸且进一步包含至少一种赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或将所述化合物递送到细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。
然而，由于在本发明的缀合物中存在包含lgaqsnf的肽部分，优选地不需要使用此类赋形剂和/或用于递送的靶向配体和/或将所述化合物递送至细胞和/或增强其细胞内递送的递送装置。
本发明还涉及一种用于在个体中缓解一种或多种症状和/或特征和/或用于改善强直性肌营养不良症1型、脊髓小脑性共济失调8型和/或亨廷顿氏病样2型的参数的方法，该方法包含向所述个体给予本文所限定的化合物或寡核苷酸或药物组合物。
在本文及其权利要求中，动词“包含(tocomprise)”及其动词变化是在其非限制性的意义上使用的，是指跟随该词语的项目被包括在内，但是不排除未具体提及的组合和/或项目。在本发明的上下文中，含有优选地是指包含。
另外，动词“由…组成(toconsist)”可以由“基本上由…组成(toconsistessentiallyof)”来替换，是指本文中限定的化合物或组合物除了具体确定的组分外还可以包含另外的组分，所述另外的组分不会改变本发明的独特特征。
当与数值联合使用(约10)时，词语“约(about)”或“大约(approximately)”优选地是指所述值可以为给定值10或多或少1％的值。
此外，以不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”提及要素(element)不排除存在多于一个要素的可能性，除非在上下文中明显要求存在一个且只有一个该要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常是指“至少一个”。
通过下列实施例进一步描述本发明，但是这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1.试剂和条件：a.马来酰亚胺丙酸、hctu、dipea；b.tfa/h2o/tis95/2.5/2.5，室温，4h；c.硫醇修饰剂c6s-s亚磷酰胺，ett；d.pads，3-皮考啉；e.浓氢氧化铵(nh4oh)，0.1mdtt，55℃，16h；f.磷酸钠缓冲液50mm，1mmedta，室温16h。肽(seqidno:2)通过其n末端(氨基酸l)连接至寡核苷酸。为此，在本图中，该肽被描绘为从c到n末端的fnsqagl。所得的lgaqsnf-ps58是根据本发明的第一方面的缀合物。此处，“ps58”标示出所述缀合物(seqidno:1)的寡核苷酸部分，其为(nag)7，其中n为c，并且其为2’-o-甲基硫代磷酸酯rna。也可以由lgaqsnf/(cag)7表示该缀合物。在整个附图和图例(figurelegend)中，“lgaqsnf-ps58”用来指示根据图1的方法制备的缀合物，并且“ps58”用来指示由(nag)7组成的寡核苷酸，其中n为c，并且其用2’-o-甲基硫代磷酸酯在其整个长度上修饰，其可选地被缀合至肽或肽模拟物部分。
图2.在dm500细胞中lgaqsnf/(cag)7介导的沉默扩张的hdmpk转录本。northern印迹分析表明肽缀合形式的ps58(lgaqsnf-ps58或lgaqsnf/(cag)7)仍然是功能的(具有pei的泳道，实验次数(n)＝3，p<0.01)并且能够进入细胞核引起扩张的hdmpk转录本的沉默，无需(没有，w/o)使用转染试剂(n＝3,p<0.001)。将gapdh用作加载对照。
图3.注射方式：肌内注射lgaqsnf/ps58(cag)7。在八只dm500小鼠的左侧gps复合体中注射lgaqsnf-ps58(lgaqsnf/(cag)7)。在这些小鼠的四只中的右侧gps复合体注射ps58((cag)7)并且四只注射lgaqsnf-23(“23”表示不相关的对照aon(seqidno:3))。在最后的注射后的第一天(对于lgaqsnf-ps58，n＝4并且对于ps58和lgaqsnf-23，n＝2)或第三天(对于lgaqsnf-ps58，n＝4并且对于ps58和lgaqsnf-23，n＝2)处死小鼠并分离肌肉。
图4a至图4c.在肌肉注射后，lgaqsnf/(cag)7在dm500小鼠体内显示出概念验证。在dm500小鼠中，与(图4a)ps58((cag)7；seqidno:1))或(图4b)lgaqsnf-23(“23”表示不相关的对照aon(seqidno:3))治疗相比，在gps复合体中注射了lgaqsnf-ps58(lgaqsnf/(cag)7)之后定量rt-pcr分析rna含量证实了：在lgaqsnf-ps58治疗后，在腓肠肌、跖肌和比目鱼肌中hdmpk(cug)500mrna的沉默。(图4c)与两个对照相比，当lgaqsnf-ps58治疗时发现在所有组织中都有显著地降低。(图4a至图4c)数据按每个组织进行分组，不考虑分离的天数，双尾配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5.修饰的aon靶向(cug)n重复的沉默能力。与模拟治疗(假饲治疗)的细胞(n＝81)相比，在转染后，定量rt-pcr分析表明ps387，(nag)7(其中n＝5-甲基胞嘧啶(seqidno:16)(n＝3,p<0.05))、和ps613(nag)7xxxx(其中n＝c且x＝1,2-二脱氧核糖脱碱基位点(seqidno:17)(n＝3,p<0.01))显著地减少了体外dm500细胞模型中突变型(cug)n转录本。ps58((cag)7)(seqidno:1)被列为阳性对照(n＝26,p<0.001)。gapdh和β-肌动蛋白用作上样对照。
图6.lgaqsnf/(nag)7的合成：一种缀合物，其中肽(seqidno:2)通过双官能交联剂连接至完全2’-o-甲基硫代磷酸酯修饰的rna寡核苷酸(nag)7，其中n＝c(seqidno:1)(11)或5-甲基胞嘧啶(seqidno:16)(12)。试剂和条件：a.tfa/h2o/tis95/2.5/2.5，室温，4h；b.mmt-氨基修饰剂c6亚磷酰胺，乙基硫醇四唑；c.pads，3-皮考啉；d.浓氢氧化铵，55℃，16h.；e.acoh:h2o(80:20v:v)；f.dmso-磷酸缓冲液，室温，16h.；g.磷酸钠缓冲液(50mm)，1mmedta，室温，16h。
图7.体外aon的活性的比较分析，该aon被设计用于体外靶向分化型dm500细胞中的hdmpk(cug)500转录本中的扩张的(cug)n重复，将(nag)7包含于ps58(seqidno:1)中(其中n＝c)或包含于ps387(seqidno:16)中(其中n＝5-甲基胞嘧啶)，并且将(nzg)5包含于ps147(seqidno:18)中(其中n＝c且z＝a)、或包含于ps389(seqidno:19)中(其中n＝5-甲基胞嘧啶且z＝a)、或包含于ps388(seqidno:20)中(其中n＝c且z＝2,6-二氨基嘌呤)，都是在200nm的固定的转染浓度下进行。使用在外显子15中的引物通过定量rt-pcr定量它们的活性(即hdmpk转录本的沉默)。将aon治疗后的hdmpk转录本水平与模拟样品中的相对相应水平进行比较。除了模拟(n＝81)、ps58(n＝26)之外，对于所有的aon，n＝3。“n”表示进行实验的次数。以类似的长度对aon进行统计分析。5-甲基胞嘧啶的存在对(cag)5和(cag)7aon两者的活性都有显著的积极影响。2,6-二氨基嘌呤的存在使得较短的(cag)5aon具有与较长的(cag)7aon具有类似的活性。当p<0.05时，组之间的差异被认为是显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8a至图8b.分析用lgaqsnf/(cag)7(由ps58表示(cag)7；seqidno:1)、以每天100mg/kg的剂量连续四天进行皮下治疗的dm500小鼠，时间是在最后一次注射的一天后。包括一个对照组，其中的小鼠用lgaqsnf/对照aon(该对照aon是由seqidno:21表示的扰适的(scrambled)ps58序列)治疗。用外显子15中(cug)n重复的5’引物通过q-rt-pcr分析定量hdmpk(cug)500rna的水平。与用lgaqsnf/对照aon治疗的小鼠相比，用根据图1的方法制备的lgaqsnf-ps58(lgaqsnf/(cag)7治疗，在腓肠肌(图8a)和心脏(图8b)中都使得扩张的hdmpk水平降低。当p<0.05时，组之间的差异被认为是显著的。*p<0.05。
图9a至图9c.分析用根据图1的方法制备的lgaqsnf/(cag)7(由ps58表示(cag)7；seqidno:1)、以每天250mg/kg的剂量连续五天皮下治疗的hsalr小鼠，时间是在最后一次注射的4周后。(图9a)由检查员对小鼠的同一性进行每周emg(肌电图)盲测。与盐水-注射的小鼠相比，在治疗的小鼠的腓肠肌中观察到肌强直的显著减少。(图9b)northern印迹分析显示：与盐水-注射的小鼠相比，在治疗的小鼠的腓肠肌中降低水平的毒性(cug)250mrna。(图9c)rt-pcr分析表明：与盐水-注射的小鼠相比，治疗的小鼠腓肠肌中的氯离子通道(clcn1)、serca(serca1)和肌联蛋白(ttn)转录本的早期剪接模式减少(即向更成熟的剪接模式转移)。
图10a至图10b.在4周期间内，分析通过11次注射250mg/kg的根据图1的方法制备的lgaqsnf/(cag)7(由ps58表示(cag)7；seqidno:1)皮下治疗的hsalr小鼠，时间是最后一次注射的4天后。northern印迹分析表明：与盐水-注射的小鼠相比，长期治疗使得毒性(cug)250水平在腓肠肌(图10a，左图)和胫骨前肌(图10a，右图)两者中都显著的降低。rt-pcr分析表明：与对照相比，治疗小鼠的腓肠肌(图10b，左图)和胫骨前肌(图10b，右图)两者中的氯离子通道(clcn1)、serca(肌内质网ca2+-atp酶)(serca1)和肌联蛋白(ttn)转录本的早期剪接模式减少(即向更加成熟的剪接模式转移)。当p<0.05时，认为组之间的差异是显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
实施例1:合成pp08-ps58缀合物
按照改编自eden.j.etal的下列工序合成了lgaqsnf-ps58(lgaqsnf/(cag)7，其中(cag)7由seqidno:1表示)。在图1中描绘了lgaqsnf-ps58缀合物的制备。
通过标准fmoc固相合成来合成肽1(seqidno:2)。在线偶联马来酰亚胺丙酸，然后用tfa:h2o:tis95:2.5:2.5脱保护并与树脂断裂，随后用反相hplc进行纯化，以38％的产率得到肽2。
在固相载体(support)上通过硫代磷酸酯键将硫醇修饰剂c6s-s亚磷酰胺偶联至寡核苷酸3上。用40％氨水和0.1mdtt处理粗树脂，引起固相载体的伴生断裂、核苷碱基的脱保护和二硫键的还原。在反相hplc纯化后，以52％的产率分离出含硫醇的寡核苷酸4。紧接地在缀合之前，用磷酸盐缓冲液50mm、在ph＝7下将化合物4施加至pd-10柱上。在室温下通过硫醇-马来酰亚胺偶联16小时，将洗脱出的含有游离硫醇寡核苷酸4的级分(fraction)直接缀合至肽2(5当量)。通过反相hplc纯化粗品，以40％的产率分离出lgaqsnf-ps58。
实验部分
化学品
对于肽合成，fmoc氨基酸购自orpegen，2-(6-氯-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基亚胺鎓六氟磷酸盐(hctu)购自pti，rink酰胺mbha树脂购自novabiochem并且3-马来酰亚胺基丙酸购自bachem。对于寡核苷酸合成，2’-o-merna亚磷酰胺获自thermofisher并且硫醇-修饰剂c6s-s亚磷酰胺获自chemgenes。自ge-healthcare定制引物载体(customprimersupport)和pd-10柱。1,4-二硫苏糖醇(dtt)和苯基乙酰基二硫化物(pads)分别购自sigma-aldrich和americaninternationalchemical。
肽的合成
在tribute肽合成仪(proteintechnologiesinc.)上通过标准fmoc化学法进行肽1的合成。rink酰胺mbha树脂(0.625mmol/g,160mg,100μmol)被用于该合成。使用20％哌啶的n-甲基吡咯烷酮(nmp)溶液来完成fmoc脱保护，并且每个偶联向所述树脂中加入5当量fmoc氨基酸、5当量hctu和10当量n,n-二异丙基乙胺(dipea)，并且偶联进行1小时。在完成肽序列1之后，在与上述相同的条件下在线偶联3-马来酰亚胺基丙酸(5当量)。使用三氟乙酸(tfa):h2o:三异丙基硅烷(tis)95:2.5:2.5在室温下进行4小时完成从树脂上的脱保护和断裂。将该混合物在冷的二乙醚中沉淀并离心。在semiprepgilsonhplc系统上通过反相(rp)hplc纯化该沉淀物：alltimac185μm150mmx22mm；缓冲液a：95％h2o，5％acn，0.1％tfa；缓冲液b：20％h2o，80％acn，0.1％tfa。汇集含有纯马来酰亚胺、含有肽的级分并冷冻干燥得到肽2(33.6mg,38％)。
寡核苷酸的合成
使用由供应商推荐的程序，将2’-o-me硫代磷酸酯寡核苷酸3装载在
合成肽-寡核苷酸缀合物lgaqsnf-ps58
用磷酸缓冲液50mm、1mmedtaph＝7将化合物4(7mmol)施加到预平衡的pd-10柱上。将洗脱出的含有硫醇寡核苷酸的级分直接偶联至至马来酰亚胺肽(5当量，31mg)上，并且反应在室温下持续16小时。在semiprepgilsonhplc系统上通过反相hplc纯化粗品：alltimac185μm150mmx22mm；缓冲液a：95％h2o，5％acn，0.1mteaa；缓冲液b：20％h2o，80％acn，0.1mteaa。汇集含有纯缀合物的级分，加入nacl，并且将溶剂蒸发至干。通过在pd-10上用水平衡洗脱完成脱盐。脱盐后，冷冻干燥汇集的级分得到lgaqsnf-ps58(25.1mg，2.8μmol，40％产率)。
实施例2
材料与方法
动物.半合子的dm500小鼠-源自dm300-328系(seznech.etal)-表达转基因人类dm1基因座，由于两代间三联体重复的不稳定性，其携带有已经扩张至约500个ctg三联体的重复片段。为了分离永生dm500成肌细胞，将dm500小鼠与h-2kb-tsa58转基因小鼠杂交(jatp.s.etal)。所有的动物实验都获得了内梅亨大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommitteesoftheradbouduniversitynijmegen)的批准。
细胞培养.永生化的dm500成肌细胞源自dm300-328小鼠(seznech.etal)并且如前所述进行培养并且分化为肌管(mulderss.a.etal)。
寡核苷酸.aonps58((cag)7；seqidno:1)如前所述(mulderss.a.etal)。将缀合物lgaqsnf偶联至所述aonps58的5’末端或对照aon23(5'-ggccaaaccucggcuuaccu-3'：seqidno:3)(杜兴(duchenne)型肌营养不良(dmd)aon)上。由prosensatherapeuticsb.v.(leiden,荷兰)提供这些aon。由eurogentec(荷兰)合成ps387((nag)7其中n＝5-甲基胞嘧啶；seqidno:16)和ps613((nag)7xxxx，其中n＝c且x为连接至寡核苷酸的3’末端的1,2-二脱氧核糖脱碱基位点)(seqidno:17))。
转染.在转染试剂的存在下测试所有的aon并且还在没有转染试剂的存在下测试lgaqsnf-ps58。根据制造商的说明用聚乙烯亚胺(pei)(exgen500，fermentas，glenburnie，md)转染aon。典型地，在肌生成的第五天，以200nm的最终寡苷酸酸浓度，将5μlpei溶液每μgaon加入到至肌管的分化培养基中。四小时后，添加新鲜培养基至2ml的最大体积。24小时后，更换培养基。转染后48小时分离rna。除了不使用转染试剂之外，按照上述的程序测试lgaqsnf-ps58。
rna分离.根据制造商的说明使用aurum总rnamini试剂盒(bio-rad,hercules,ca)从培养的细胞中分离rna。使用trizol试剂(invitrogen)从肌肉组织中分离出rna。简言之，使用电动匀浆器(ultraturraxt-8,ikalabortechnik)在trizol(100mg组织/mltrizol)中匀浆组织样品。加入氯仿(merck)(每mltrizol用0.2ml)，混合，在室温下温育3分钟并且在13,000rpm下离心15分钟。收集上层水相并且每1mltrizol加入0.5ml异丙醇(merck)，然后在室温下温育10分钟，并离心(13,000rpm，10min)。用75％(v/v)乙醇(merck)洗涤rna沉淀物，在空气中干燥并且溶解于milliq中。
northern印迹.按照描述进行northern印迹(mulderss.a.etal)。使用32p-标记的hdmpk(2.6kb)和大鼠gapdh(1.1kb)随机引物探针。由磷酸成像仪分析(gs-505或分子成像仪fx，bio-rad)量化信号并且用quantityone(bio-rad)或imagej软件分析。将gapdh水平用于归一化；将对照样品的rna水平设定为100。
体内治疗和肌肉分离.使用异氟烷麻醉七月龄的dm500小鼠。在第一天和第二天，用4nmol的lgaqsnf-ps58、lgaqsnf-23或ps58(seqidno:1)的盐水溶液(0.9％nacl)在gps肌肉的相同中央位置处对gps(腓肠肌-跖肌-比目鱼肌)复合体进行注射。在所有情况下，注射体积为40μl。在最终注射后的第一天或第三天处死小鼠，并分离出各自的肌肉，在液氮中速冻并且在-80℃下保存。
定量rt-pcr分析.使用superscript第一链合成系统(invitrogen)在20μl的总体积中用随机六聚体对约1μgrna进行cdna合成。随后在1×faststartuniversalsybrgreenmaster(roche)的存在下在根据标准程序的定量pcr分析中使用3μl的1/500cdna稀释制剂。基于ncbi数据库序列信息设计定量pcr引物。通过dna测序确认产物的同一性。将β-肌动蛋白和gapdh的信号用于归一化。在corbettlifesciencerotor-gene6000上使用下面的两步pcr程序进行扩增：在95℃下变性15min并且进行15s95℃与50s60℃的40个循环。在延伸步骤(60℃)结束时测量sybrgreen荧光。扩增后，通过64℃至94℃的熔融将扩增的dna离解。在此步骤中测量sybrgreen荧光确认单个扩增子的扩增。使用连续稀释的cdna标准物来测量每个引物组的效率。使用rotor-gene6000系列软件(corbettresearch)测量临界循环阈值(ct)，使用根据δδct法的公式将目的基因(goi)的表达相对于β-肌动蛋白和gapdh进行归一化并表示为与相应对照的比。使用了下列引物：
hdmpk外显子15(5’)-f；5’-agaactgtcttcgactccggg-3’(seqidno:4)；
hdmpk外显子15(5’)-r；5’-tcggagcggttgtgaactg-3’(seqidno:5)；
β-肌动蛋白-f；5’-gctctggctcctagcaccat-3’(seqidno:6)；
β-肌动蛋白-r；5’-gccaccgatccacacagagt-3’(seqidno:7)；
gapdh-f；5’-gtcggtgtgaacggatttg-3’(seqidno:8)；
gapdh-r；5’-gaacatgtagaccatgtagttg-3’(seqidno:9)；
结果
在体外dm1模型中由lgaqsnf-ps58沉默hdmpk(cug)500rna.在转染试剂(pei)的存在下用lgaqsnf-ps58处理dm500细胞后，northern印迹显示出约90％hdmpk转录本的沉默，确认了肽缀合的ps58的功能性。发现当不存在转染试剂的情形下将lgaqsnf-ps58加入到dm500细胞中时，突变型hdmpkmrna减少了相同的水平，表明lgaqsnf负责细胞和核摄取ps58(图2)。
肌内注射lgaqsnf-ps58在体内引起扩张的hdmpk转录本的沉默.将lgaqsnf-ps58肌内注射(i.m.)到dm500小鼠的gps复合体中，以在体内揭示肽缀合形式的ps58的功能性。包括未缀合的ps58和偶联至dmd对照aon23(seqidno:3)(lgaqsnf-23)的lgaqsnf作为对照。以每日一次i.m.注射治疗小鼠两天，并且在最后一次注射后的第一天和第三天分离组织(图3)。定量rt-pcr分析表明在组织分离日之间无统计学显著差异，所以将两个分离日的数据进行组合。q-rt-pcr分析显示出与未缀合的ps58相比，在lgaqsnf-ps58治疗后腓肠肌(55％)和跖肌(60％)中hdmpkmrna水平的显著降低，并且发现在比目鱼肌中28％的降低(图4a)。与lgaqsnf-23相比，在lgaqsnf-ps58治疗后，在gps复合体的所有个体组织中都发现了约50％沉默的hdmpk(cug)500水平(图4b)。由于对照之间hdmpk转录水平没有显著差异，因此lgaqsnf-ps58治疗后的突变型dmpkmrna水平与ps58和lgaqsnf-23有关(图4c)。在所有测试的gps复合体的个体组织中，lgaqsnf-ps58负责在对照治疗后没有看到的hdmpk(cug)500的沉默水平。
具有连接到脱碱基位点的寡核苷酸部分(cag)7的化合物与不具有所述脱碱基位点的对应化合物相比，引起了体外扩张的hdmpk(cug)500转录本的沉默效率显著增加。
用200nmps387、ps613和ps58转染dm500细胞。定量rt-pcr分析显示与对照处理的细胞(模拟物)相比，两种修饰的aon(ps387和ps613)都引起突变型(cug)500hdmpk转录本的显著沉默。包括ps58作为阳性对照(图5)。
实施例3
通过双官能交联剂的肽-2’-o-me硫代磷酸酯rna寡核苷酸缀合物lgaqsnf-(nga)7的合成，其中n＝c或5-甲基胞嘧啶。
按照在图6.中描绘的缀合方法制备2’-o-me硫代磷酸酯(ps)rna寡核苷酸缀合物lgaqsnf-(nag)7，其中n＝c(seqidno:1)或5-甲基胞嘧啶(m5c)(seqidno:16)。该缀合方法依赖于将5’氨基修饰的寡核苷酸(6，7)偶联至异源双功能交联剂8，偶联提供马来酰亚胺-修饰的寡核苷酸(9，10)，其可以被偶联至硫醇官能化的肽。
按照标准的fmoc肽合成步骤将该肽装载在固相载体上。为了提供用于使该肽能够偶联至寡核苷酸的具有硫醇官能性的肽，将半胱氨酸残基加入到该肽的n末端。随后的酸性断裂和脱保护得到肽5，在引入最后的一个氨基酸后，通过乙酰化的加帽反应可以将其n-末端制备为游离胺基团(5a)或为乙酰胺基团(5b)。
将单甲氧基三苯甲基(mmt)-保护的c6-氨基修饰剂亚磷酰胺(linktechnologies)在线偶联至经装载的(nag)72’-o-mepsrna寡核苷酸序列(n＝c或5-甲基胞嘧啶)的5’上。由两步碱性处理[二乙胺(dea)及随后的氨]从固相载体上断裂并且伴发核苷碱基的脱保护，随后酸处理以去除mmt保护，得到氨基-修饰的寡核苷酸6和7。
使6和7与β-马来酰亚胺基丙酸琥珀酰亚胺酯(bmps，8)(一种带有琥珀酰亚胺和马来酰亚胺官能团的异型双功能交联剂)反应，分别得到马来酰亚胺-装载的寡核苷酸9和10。通过硫醇-标记的肽5与马来酰亚胺-来源的寡核苷酸9和10的硫醇-马来酰亚胺偶联完成肽-寡核苷酸的缀合。
肽的合成
如在实施例1中所描述的，采用rink酰胺mbha树脂(0.625mmol/g，160mg，100μmol，novabiochem)通过标准fmoc化学将肽序列clgaqsnf装载在tribute肽合成仪(proteintechnologies)上。在完成肽合成后，进行最后的加帽步骤(乙酸酐(ac2o)，吡啶)(5b)或省略(5a)。在室温下使用tfa:h2o:tis95:2.5:2.5(v:v:v)持续4小时以实现脱保护和从树脂上的断裂。过滤混合物，在冷的二乙醚中沉淀，离心并弃去上清液。粗沉淀的肽或rp-hplc纯化的肽两者都用于缀合。
寡核苷酸的合成
如在实施例1中所描述的，将2’-o-me硫代磷酸酯rna寡核苷酸(nag)7(其中n＝c(seqidno:1)或5-甲基胞嘧啶(seqidno:16))装载在
肽的寡核苷酸缀合
将肽clgaqsnf(5a或5b，10当量)加入到5’-马来酰亚胺修饰的寡核苷酸(9或10，1μmol)的3.5ml磷酸盐缓冲液中，并且将该反应混合物在室温下振荡16h。离心后，在prominencehplc(shimadzu)[alltimac18柱(5μm,10x250mm)；缓冲液a：95％h2o，5％acn，0.1m四乙基乙酸铵(teaa)；缓冲液b：20％h2o，80％acn，0.1mteaa]上通过反相hplc纯化上清液。汇集含有纯缀合物的级分，加入nacl并且蒸去溶剂。在sephadexg25柱上用水平衡来完成脱盐。脱盐后，将汇集的级分冷冻干燥得到最终的缀合物。lcms(esi，负离子模式)分析显示正确的质量：10a(n＝c，r＝h，图6)计算值：8595.3；测量值8595.4，10b(n＝5-甲基胞嘧啶，r＝ac)计算值：8735.6；测量值：8735.4。
实施例4
引言
选定的aon化学的特定特征可以至少部分地增强亲和力和稳定性、增强活性、提高安全性、和/或通过缩短长度或改进合成和/或纯化程序而降低商品成本。本实施例描述了设计用于体外靶向分化型dm500细胞中hdmpk(cug)500转录本中的扩张的(cug)n重复的aon的活性比较分析，并且包括具有5-甲基胞嘧啶(ps387(seqidno:16和ps389(seqidno:19))或2,6-二氨基嘌呤(ps388；seqidno:20)的aon与相应的不具有这些碱基修饰的aon(ps147(seqidno:18)和ps58(seqidno:1))的对比。
材料与方法
细胞培养.永生化的dm500成肌细胞来自dm300-328小鼠(seznech.etal.)并且如前所述进行培养和分化为肌管(mulderss.a.etal.)。简而言之，dm500成肌细胞在33℃下在明胶-涂覆的平皿上在高血清dmem中增长。在37℃下通过将dm500成肌细胞放置在matrigel上在低血清dmem中使其生长至汇合来诱导至肌管的分化。
寡核苷酸.aonps58(cag)7)如前所述(mulderss.a.etal.)。使用的aon被完全2’-o-甲基硫代磷酸酯修饰：ps147(nzg)5(其中n＝c且z＝a)(seqidno:18)、ps389(nzg)5(seqidno:19)和ps387(nzg)7(其中n＝5-甲基胞嘧啶且z＝a)(seqidno:16)、和ps388(nzg)5(其中n＝c且z＝2,6-二氨基嘌呤)(seqidno:20)。
转染.用与pei复合的aon(2μl每μgaon，在0.15mnacl中)转染细胞。在肌细胞生成的第五天以200nm的最终寡核苷酸浓度将aon-pei复合物加入到至肌管的分化培养基中。四小时后，补充新鲜培养基至2ml的最大体积。在24小时后更换培养基。转染48小时后分离rna。
rna分离.根据制造商的说明使用aurumtotalrnamini试剂盒(bio-rad，hercules，ca)从培养的细胞中分离rna。
定量rt-pcr分析.使用superscript第一链合成系统(invitrogen)在20μl的总体积中以随机六聚体将约1μgrna用于cdna合成。随后将3μl的1/500cdna稀释制剂用于在1×faststartuniversalsybrgreenmaster(roche)的存在下根据标准程序的定量pcr分析。基于ncbi数据库序列信息设计定量pcr引物。通过dna测序确认产物的同一性。如在实施例2中所描述的，将β-肌动蛋白和gapdh的信号用于归一化。
结果
定量rt-pcr分析显示当与模拟治疗的细胞相比时，在aon治疗后，所有测试的aon都诱导了hdmpk转录本的显著沉默(图7)。5-甲基胞嘧啶的存在对(cag)5(ps147)和(cag)7(ps58)aon两者的活性都有显著积极的影响。2,6-二氨基嘌呤的存在使得较短的(cag)5aon(ps147)能够具有与较长的(cag)7aon(ps58)相似的活性。
实施例5
引言
强直性肌营养不良1型(dm1)是一种复杂的多系统性疾病。为了使aon在dm1中临床有效，它们需要到达其中的各种组织和细胞类型中。为了提高的活性、靶向和/或传递至和/或由多种组织(包括心脏、骨骼肌和平滑肌)吸收，基于肽lgaqsnf与ps58的缀合设计了新的化合物。本实施例证明在全身治疗dm500小鼠后其沉默毒性dmpk转录本的体内功效。
材料与方法
动物.半合子dm500小鼠-源自dm300-328系(seznech.etal.)-表达转基因人类dm1基因座，由于两代间三联体重复的不稳定性，其带有已经扩张至约500个ctg三联体的重复片段。所有的动物实验都获得了内梅亨大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommitteesoftheradbouduniversitynijmegen)的批准。
寡核苷酸.如在实施例1中所描述的，将肽lgaqsnf偶联至aonps58(cag)7(seqidno:1)的5’末端或偶联至对照aon(乱序的ps58，5’-cagaggaccaccagaccaagg-‘3；seqidno:21)。
体内治疗.在dm500小鼠的颈部区域皮下注射100mg/kglgaqsnf-ps58或lgaqsnf-对照aon。连续注射四天，并且在最后一次注射的一天后分离组织。
rna分离.使用trizol试剂(invitrogen)从组织中分离rna。简单地说，使用电源匀浆器(ultraturraxt-8，ikalabortechnik)在trizol(100mg织织/mltrizol)中匀浆组织样品。加入氯仿(merck)(0.2ml每mltrizol)，混合，并在室温下温育3分钟，并且在13,000rpm下离心15分钟。收集上层水相，并且每1mltrizol加入0.5ml异丙醇(merck)，然后在室温下温育10min并离心(13,000rpm，10min)。用75％(v/v)乙醇(merck)洗涤rna沉淀，在空气中干燥并将其溶解于milliq中。
定量rt-pcr分析.使用superscript第一链合成系统(invitrogen)在20μl的总体积中以随机六聚体将约1μgrna用于cdna合成。随后将3μl的1/500cdna稀释制剂用于在1×faststartuniversalsybrgreenmaster(roche)的存在下根据标准程序的定量pcr分析。基于ncbi数据库序列信息设计定量pcr引物。通过dna测序来确认产物的同一性。如在实施例2中所描述的，将β-肌动蛋白和gapdh的信号用于归一化。
结果
定量rt-pcr分析显示当与用lgaqsnf-对照aon治疗的小鼠相比时，用lgaqsnf-ps58的全身性治疗使得dm500小鼠中的扩张的hdmpk(cug)500转录本显著地减少。在腓肠肌和心肌中，都发现整体上约40％的hdmpk水平的降低(图8a至图8b)，表明肽lgaqsnf促进ps58在受dm1影响的两个靶器官中的递送和/或活性。
实施例6
引言
强直性肌营养不良1型(dm1)是一种复杂的多系统性疾病。为了使aon在dm1中临床有效，它们需要到达其中的各种组织和细胞类型中。为了提高的活性、靶向和/或传递至和/或由多个组织(包括心脏、骨骼肌和平滑肌)吸收，基于肽lgaqsnf与ps58的缀合设计了新的化合物。本实施例论证了其在hsalr小鼠的体内功效。表达人类骨骼肌动蛋白转基因中毒性(cug)250重复的这些小鼠不仅显示出类似于dm1患者的分子缺陷，还表现出肌强直表型。
材料与方法
动物.纯合的hsalr小鼠(系hsalr20b)表达在转基因的人类骨骼α-肌动蛋白基因的3’utr内的250个ctg重复(mankodia.etal.)。hsalr小鼠表现出类似于dm1的核糖核酸包涵物、肌强直、肌病特征和肌肉组织变化。所有的动物实验都获得了内梅亨大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommitteesoftheradbouduniversitynijmegen)的批准。
寡核苷酸.如在实施例1中所描述的，将肽lgaqsnf偶联至aonps58(cag)7(seqidno:1)的5’末端。
体内治疗.以250mg/kg的剂量，在hsalr小鼠的颈部区域皮下注射lgaqsnf-ps58连续五天，并且与只接受盐水注射的对照小鼠进行比较。每周进行一次emg测量，在第一次注射的四周后分离组织。
emg.在全身麻醉下进行emg。对于每次肌肉检查进行最低5-10针插入。以4-点标准对肌强直性放电进行分级：0，无肌强直；1，少于50％的针插入点偶尔肌强直性放电；2，多于50％的针插入点的肌强直性放电；3，几乎每一个插入点都肌强直性放电。
rna分离.使用trizol试剂(invitrogen)从组织中分离rna。简言之，使用电源匀浆器(ultraturraxt-8,ikalabortechnik)在trizol(100mg组织/mltrizol)中匀浆组织样品。加入氯仿(merck)(0.2ml每mltrizol)，混合，在室温下温育3分钟并且在13,000rpm下离心15分钟。收集上层水相并且每1mltrizol加入0.5ml异丙醇(merck)，然后在室温下温育10min并离心(13,000rpm，10min)。用75％(v/v)乙醇(merck)洗涤rna沉淀，在空气中干燥并且将其溶解于milliq中。
northern印迹.在每泳道加载有1μgrna的1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶中电脉rna。将rna转移至hybond-xl尼龙膜(amershampharmaciabiotech,littlechalfont，uk)上并且与32p-末端标记的(cag)9或小鼠骨骼肌动蛋白-特异性(msa)寡核苷酸杂交。将印迹暴露至x-射线胶片(kodak，x-omatar)。通过磷酸成像仪分析(gs-505或molecularimagerfx，bio-rad)量化信号，并且使用quantityone(bio-rad)或imagej软件分析。将msa水平用于归一化。
半定量rt-pcr分析.使用superscript第一链合成系统(invitrogen)在20μl的总体积中以随机六聚体将约1μgrna用于cdna合成。然后将1μl的cdna制剂用于根据标准程序的半定量pcr分析。在rt-对照实验中，省略逆转录酶。通过dna测序来确认产物同一性。通过溴化乙锭染色在1.5-2.5％的琼脂糖凝胶上分析pcr产物。使用labworks4.0软件(uvpbioimagingsystems，cambridge，unitedkingdom)对信号进行量化。对于选择性剪接的分析，将早期的(e):成熟的(a)剪接比定义为各样品中的早期型信号除以成熟型信号。剪接比校正说明lgaqsnf-ps58治疗对选择性剪接(即serca1、ttn和clcn1)的影响。使用了下列引物：
serca1-f；5’-gctcatggtcctcaagatctcac-3’(seqidno:22)
serca1-r；5’-gggtcagtgcctcagctttg-3’(seqidno:23)
ttn-f；5’-gtgtgagtcgctccagaaacg-3’(seqidno:24)
ttn-r；5’-ccaccacaggaccatgttatttc-3’(seqidno:25)
clcn1-f；5’-ggaatacctcacactcaaggcc-3’(seqidno:26)
clcn1-r；5’-cacggaacacaaaggcactgaatgt-3’(seqidno:27)
结果
在第一次注射的四周后，在腓肠肌中的emg测量显示当与盐水治疗的小鼠相比时，在lgaqsnf-ps58治疗的小鼠中肌强直有显著但温和(mild)的降低(图9a)。肌强直的这种减少的同时，毒性(cug)250转录水平约50％的降低(图9b)，并且在腓肠肌中clcn1、serca1和ttn转录本的剪接模式由早期样(e)向正常成熟(a)模式转移(图9c)。这些结果表明在分子和表型水平上肽lgaqsnf确实促进了ps58体内地在肌肉中的递送和/或活性。
实施例7
引言
本实施例再次证明lgaqsnf-ps58在hsalr小鼠中的体内功效。此处，在延长的一段时间内治疗小鼠。监测毒性(cug)250转录本的沉默和下游基因的剪接模式转移并与盐水治疗的小鼠中的结果比较。
材料与方法
动物.纯合的hsalr小鼠(系hsalr20b)表达转基因人类骨骼α-肌动蛋白基因的3‘utr内的250个ctg重复(mankodia.etal.)。hsalr小鼠表现出出类似于dm1的核糖核酸包涵物、肌强直、肌病特征和组织学肌肉变化。所有的动物实验都获得了内梅亨大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommitteesoftheradbouduniversitynijmegen)的批准。
寡核苷酸.如实施例1中所描述的，将肽lgaqsnf偶联至aonps58(cag)7(seqidno:1)的5’末端。
体内治疗.在四周内在颈部区域接受了十一次皮下注射250mg/kglgaqsnf-ps58的hsalr小鼠与仅注射盐水的小鼠进行比较。在第一次注射的三十二天后，处死所有小鼠并分离组织。
rna分离.使用trizol试剂(invitrogen)从组织分离rna。简言之，使用电源匀浆器(ultraturraxt-8，ikalabortechnik)在trizol(100mg组织/mltrizol)中匀浆组织样品。加入氯仿(merck)(0.2ml每mltrizol)，混合，在室温下温育3分钟并且在13,000rpm下离心15分钟。收集上层水相并且每1mltrizol加入0.5ml异丙醇(merck)，然后在室温下温育10min并离心(13,000rpm，10min)。用75％(v/v)乙醇(merck)洗涤rna沉淀，在空气中干燥并且将其溶解于milliq中。
northern印迹.在每泳道加载有1μgrna的1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶中电泳rna。将rna转移至hybond-xl尼龙膜(amershampharmaciabiotech,littlechalfont，uk)并且与32p-末端标记的(cag)9或小鼠骨骼肌动蛋白-特异性(msa)寡核苷酸杂交。将印迹暴露至x-射线胶片(kodak，x-omatar)。通过磷酸成像仪分析(gs-505或分子成像仪fx,bio-rad)量化信号并用quantityone(bio-rad)或imagej软件分析。将msa水平用于归一化。
半定量rt-pcr分析.使用superscript第一链合成系统(invitrogen)在20μl的总体积中以随机六聚体将约1μgrna用于cdna合成。随后将1μl的cdna制剂用于根据标准程序的于半定量pcr分析。在rt-对照实验中，省略了逆转录酶。通过dna测序确认产物的同一性。以溴化乙锭染色在1.5-2.5％琼脂糖凝胶上分析pcr产物。使用labworks4.0软件(uvpbioimagingsystems，cambridge，unitedkingdom)量化信号。对于选择性剪接的分析，将早期的(e):成熟的(a)剪接比定义为各样品中的早期型信号除以成分型信号。剪接比校正说明lgaqsnf-ps58治疗对选择性剪接(即serca1、ttn和clcn1)的影响。使用了下列引物：
serca1-f；5’-gctcatggtcctcaagatctcac-3’(seqidno:22)
serca1-r；5’-gggtcagtgcctcagctttg-3’(seqidno:23)
ttn-f；5’-gtgtgagtcgctccagaaacg-3’(seqidno:24)
ttn-r；5’-ccaccacaggaccatgttatttc-3’(seqidno:25)
clcn1-f；5’-ggaatacctcacactcaaggcc-3’(seqidno:26)
clcn1-r；5’-cacggaacacaaaggcactgaatgt-3’(seqidno:27)
结果
第一次注射后的三十二天，处死hsalr小鼠并分离组织。northern印迹显示当与盐水治疗的小鼠中的结果相比时，在lgaqsnf-ps58治疗的小鼠中的腓肠肌(图10a，左图)和胫骨前肌(图10a，右图)中毒性(cug)250水平显著地降低。在这两种肌肉组中，发现平均约50％的(cug)250降低。在这种降低的同时，在腓肠肌(图10b，左图)和胫骨前肌(图10b，右图)中clcn1、serca1和ttn转录本都从早期样(e)向正常成熟(a)剪接模式转移。这些结果再次表明肽lgaqsnf促进了ps58在肌肉体内中的传递和/或活性。
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<223>n为2,6-二氨基嘌呤
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n为2,6-二氨基嘌呤
<400>20
cngcngcngcngcng15
<210>21
<211>21
<212>rna
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<400>21
cagaggaccaccagaccaagg21
<210>22
<211>23
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>22
gctcatggtcctcaagatctcac23
<210>23
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<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>23
gggtcagtgcctcagctttg20
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<220>
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<400>24
gtgtgagtcgctccagaaacg21
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<212>dna
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<220>
<223>引物
<400>25
ccaccacaggaccatgttatttc23
<210>26
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<212>dna
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<220>
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<400>26
ggaatacctcacactcaaggcc22
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<211>25
<212>dna
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<220>
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<400>27
cacggaacacaaaggcactgaatgt25
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