栖冷克吕沃尔菌ZJB-17005及其应用的制作方法

本发明涉及一株产酰胺水解酶的菌株——栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005，及其在催化n-苯乙酰基氨基酸制备手性氨基酸与催化氨基酸衍生物的n-苯乙酰基取代物制备手性氨基酸衍生物中的应用。

(二)

背景技术：

l-草铵膦化学名称为：4-[羟基(甲基)膦酰基]-l-高丙氨酸，是l-谷氨酸的一种结构类似物，能抑制谷氨酰胺合成酶(gs)活性，使植物体内氨积累，高浓度氨气积累阻断植物光呼吸作用，叶绿体结构的破坏以及基质的囊泡化，同时氨基酸合成受阻，导致细胞膜受损和细胞死亡，从而杀灭杂草。其具有广谱性，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。

目前l-草铵膦合成方法有化学合成法和生物合成法。化学法主要通过以下4种方式构建l-草铵膦的手性中心：1)利用手性辅助试剂，手性诱导构建手性中心；2)以天然氨基酸为手性源，转化得到l-草铵膦；3)由手性催化剂催化的不对称合成反应；4)手性拆分外消旋体。但是化学法合成l-草铵膦工序多，收率较低，手性试剂成本高昂，且产生的三废量大，处理比较困难。生物法则具有严格的立体选择性，温和的反应条件、较高的收率和易于分离纯化等优势，因此，生物法生产l-草铵膦技术具有十分重要的产业化开发价值。

生物法生产l-草铵膦根据作用底物不同有蛋白酶水解双丙氨膦、通过磷酸二酯酶i、酰胺酶i和谷氨酰胺酶分步协同作用保持光学活性水解l-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺、α-胰凝乳蛋白酶的拆分双丙氨膦乙酯、脱乙酰基酶拆分n-乙酰-草铵膦、酰胺酶拆分2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、酯水解酶水解l-草铵膦-n-羧酸酐、腈水合酶水解草铵膦含腈底物、转氨酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸等。

目前合成l-草铵膦的化学方法主要有：1)手性辅助剂诱导法，以(s)-2-羟基-3-蒎酮为手性辅助剂制备，产率为51％，e.e.值为79％；以d-缬氨酸甲酯为手性辅助剂，需要-78℃低温反应，产率为51％，e.e.值为93.5％。2)天然氨基酸手性源法，以l谷氨酸为手性源，e.e.值为99.4％；l-蛋氨酸为手性源，总收率为42.3％，e.e.值为93.5％，需要用到剧毒碘甲烷。3)不对称合成法，不对称催化加氢——催化剂用量大且三甲基硅氰价格昂贵；不对称strecker反应——用到剧毒氰化物；不对称michael加成——催化剂用量大，且产品收率和e.e.值低。4)外消旋体拆分法，此方法最高收率86％，e.e.值最高99％，但拆分后d-草铵膦未转化，浪费原料。

用酰胺水解酶选择性催化拆分2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸制备l-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸，为实现工业化路线的l-草铵膦合成提供了依据。

手性氨基酸及其衍生物在医药开发中的作用越来越大，目前的医药开发对手性纯度的要求越来越高。手性氨基酸生产工艺有化学拆分和酶法拆分等工艺。其中酶法拆分因为其条件温和，特异性强，污染小，较化学拆分有明显优势。其中酰胺水解酶选择性催化拆分n-苯乙酰基氨基酸生产手性氨基酸具有广阔的应用前景。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够产生酰胺水解酶的菌株——栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005，及其在催化n-苯乙酰-dl-氨基酸衍生物(2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸)制备l-草铵膦的重要有效成分l-氨基酸衍生物(2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸)或催化n-苯乙酰-dl-氨基酸制备l-氨基酸中的应用，为化学-酶法生产l-草铵膦有效成分及l-氨基酸提供了新的酶源，促进了绿色化学催化的发展。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一株产酰胺水解酶菌株——栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno：m2017600，保藏日期2017年10月23日，地址：中国.武汉.武汉大学，430072。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有催化合成l-草铵膦的能力。

第二方面，本发明提供一种所述的栖冷克吕沃尔菌zjb-17005在微生物催化筛分n-苯乙酰-dl-氨基酸衍生物(优选2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸)制备l-草铵膦的重要有效成分l-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸)中的应用，所述应用为：以栖冷克吕沃尔菌zjb-17005经发酵培养后的湿菌体为催化剂，以n-苯乙酰-dl-氨基酸衍生物(优选2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸)为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成ph值为8.5的反应体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到l-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸)。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为10-200g/l，优选50g/l，所述底物初始加入终浓度为10-500mm，优选100mm。所述反应体系还可以由栖冷克吕沃尔菌zjb-17005经发酵培养获得的发酵液和底物构成，ph8.5；其中发酵液中湿菌体在整个反应体系中的终浓度10-200g/l，优选50g/l，底物在反应体系中的终浓度10-500mm，优选100mm。

所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调ph至1.0-5.0(优选2.5)，以1-6.0bv/h(优选4bv/h)的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5m(优选1m)的氨水以0.5-3.0bv/h(优选2bv/h)进行洗脱，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸检测洗脱液，滤纸变紫表明洗脱液含有2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到l-氨基酸衍生物(优选2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸)。

第三方面，本发明还提供一种所述栖冷克吕沃尔菌zjb-17005在催化n-苯乙酰-dl-氨基酸制备l-氨基酸的应用，所述的应用以栖冷克吕沃尔菌zjb-17005经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以n-苯乙酰-dl-氨基酸为底物，以缓冲液(优选氨水)为反应介质构成ph8.5的转化体系，在25-55℃，100-200rpm(优选30-40℃、150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，反应液经分离纯化，得到l-氨基酸。所述转化体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为20-300g/l(优选20-60g/l)，所述底物初始加入终浓度为50-500mm(优选100mm)。所述n-苯乙酰-dl-氨基酸为下列之一：n-苯乙酰-dl-丙氨酸、n-苯乙酰-dl-丝氨酸、n-苯乙酰-dl-谷氨酸、n-苯乙酰-dl-酪氨酸、n-苯乙酰-dl-苏氨酸、n-苯乙酰-dl-缬氨酸、n-苯乙酰-dl-天冬氨酸、n-苯乙酰-dl-甲硫氨酸、n-苯乙酰-dl-亮氨酸、n-苯乙酰-dl-异亮氨酸、n-苯乙酰-dl-苯丙氨酸。所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用二氯甲烷萃取，将水层调ph至1.0-5.0(优选2.5)，以1-6.0bv/h(优选4bv/h)的速度上样进行离子交换层析，先用去离子水洗涤，再用0.2-4.5m(优选1m)的氨水以0.5-3.0bv/h(优选2bv/h)进行洗脱，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸检测洗脱液，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有l-氨基酸，收集含目标组分的洗脱液，减压蒸馏至膏状，用甲醇溶解重结晶，取晶体干燥，得到l-氨基酸。

所述n-苯乙酰-dl-氨基酸按如下方法制备：氨基酸和naoh加入蒸馏水中，4℃冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加苯乙酰氯，滴加完成后，继续4℃冰浴条件反应2h，再常温(25-30℃)搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加hcl调节ph至1.5-5.5(优选2-4)，析出固体，抽滤烘干，得到n-苯乙酰-dl-氨基酸；所述氨基酸与naoh摩尔比为1：1～7(优选1:1.5-2.5)；所述氨基酸与苯乙酰氯摩尔比为1：0.1～2(优选1:0.5-1.0)，所述蒸馏水体积用量以氨基酸质量计为3-10ml/g；所述氨基酸为下列之一：丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸。

本发明所述栖冷克吕沃尔菌zjb-17005发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：

(1)斜面培养：将栖冷克吕沃尔菌zjb-17005接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：乳糖1-12g/l，蛋白胨1-10g/l，na2hpo40.5-5.3g/l，k2hpo40.5-6.0g/l，na2edta0.01-0.3g/l，mnso40.0001-0.001g/l，mgso40.001-0.002g/l，znso40.001-0.01g/l，feso40.001-0.03g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.5-7.5；优选斜面培养基终浓度组成为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：乳糖1-12g/l，蛋白胨1-10g/l，na2hpo40.5-5.3g/l，k2hpo40.5-6.0g/l，na2edta0.01-0.3g/l，mnso40.0001-0.001g/l，mgso40.001-0.002g/l，znso40.001-0.01g/l，feso40.001-0.03g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.5-7.5；优选种子培养基终浓度组成为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％(优选1％)的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖1-12g/l，蛋白胨1-10g/l，na2hpo40.5-5.3g/l，k2hpo40.5-6.0g/l，na2edta0.01-0.3g/l，mnso40.0001-0.001g/l，mgso40.001-0.002g/l，znso40.001-0.01g/l，feso40.001-0.03g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.5-7.5；优选发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8。

本发明所述ph值为8.5的缓冲液构成为：柠檬酸缓冲液(100mm,ph4.0-6.0)，磷酸缓冲液(100mm,ph6.0–8.0)，tris-hcl(100mm,ph7.0–9.0)，硼酸缓冲液(100mm,ph9.0–10.5)，氨水缓冲液(以氨水调节底物溶液ph为7.0–10.0)，罗二氏缓冲液(100mm,ph10.5–12.0)；优选缓冲液组成为：以氨水调节底物溶液ph为8.5。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株能够产生酰胺水解酶的菌株--栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005，本发明还提供了利用栖冷克吕沃尔菌zjb-17005经发酵培养获得湿菌体做为生物催化剂催化2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸制备l-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的方法，对2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]丁酸转化率达到49.5％，产物l-草铵膦达到e.e.％＝99.9％，本发明还提供了利用栖冷克吕沃尔菌zjb-17005经发酵培养获得湿菌体做为生物催化剂催化n-苯乙酰-dl-氨基酸制备l-氨基酸的方法，其转化率能达到49％，产物手性氨基酸可达到e.e.％＝99-99.9％，拆分制备过程绿色高效，菌株易于培养收集应用，催化反应条件温和，具有重要的应用前景。

(四)附图说明：

图1为高通量筛选方法下opa/nac-草铵膦的浓度标准曲线。

图2为柱前衍生化反相高效液相色谱下2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸和2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-d-丁酸的液相结果图谱。

图3为筛选所得菌株栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005的电镜观察结果。

(五)具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明所述超纯水为up水，是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。本发明所述氨水是含氨25％～28％的水溶液。本发明所述常温为25-30℃。本发明实施例所述冰浴均为4℃。本发明2％茚三酮溶液配制方法为：将2g茚三酮与0.08g氯化亚锡溶于100ml超纯水中，然后搅拌过滤，取滤液避光保存。

实施例1：栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005的筛选

1、初筛

本发明从全国各地取土样，共取土样80份。筛选的具体方法：称取1g土样置于10ml0.85％的生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天。取1ml富集液加入50ml新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化。

选用溴百里香酚蓝滤纸作为指示滤纸检测能够降解底物的菌落。其原理为：含目的酶的菌落利用降解底物后，会产生酸性副产物(苯乙酸、乙酸、甲酸、苯甲酸)，从而使指示滤纸局部的ph值发生改变。指示剂溴百里香酚蓝变色范围为5.8-7.6(黄-蓝)，因此能利用含氯有机物的菌落周围呈现黄色，而不能利用的则菌落周围平板颜色仍为青绿色。

将富集液用无菌0.85％生理盐水逐级稀释10个梯度，选取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10五个梯度的稀释液各取0.1ml均匀涂布在平板筛选培养基上，30℃恒温培养48h。将浸湿含有10％的溴百里酚蓝的无菌滤纸(指示滤纸)平铺于平板上，挑取指示滤纸上显示为黄色的对应的菌落接种到含有生长培养基的96孔板中，放入30℃、180rpm摇床恒温培养，期间检测od600的吸光值，绘制生长曲线，当菌株生长到对数期时候，转接300μl新鲜发酵培养基，接种96孔板后剩下的菌液密封保藏于4℃冰箱，作为菌种备用。转接后的含发酵培养基96孔板至于30℃、180rpm摇床恒温培养48h，使其充分生长与产酶，获得菌悬液。

2、opa/nac高通量筛选

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，加入1ml步骤1制备的菌悬液，用氨水调节溶液ph值至8.5，构成10ml反应体系，使底物终浓度为50mm，于30℃、180rpm摇床恒温反应24h。所得转化液分别用超纯水对应稀释10倍，4℃冰浴，用opa/nac高通量筛选方法进行检测，筛选出相对荧光值较高的菌株。

opa/nac高通量筛选方法：用排枪吸取稀释后的冰浴反应液40μl至96孔荧光检测板，加入冰浴后的a液，酶标仪中振荡30s，再加入100μl超纯水，再次振荡30s，在λex＝340nm；λem＝455nm，测定荧光强度值，所得荧光强度值与标准曲线对比即可得到样品中所含2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的浓度，继而可以计算出2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的产量，得到酰胺水解酶生物催化拆分2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸制备l-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的转化率。

所述a液：n-乙酰-l-半胱氨酸(0.448g)与邻苯二甲醛(0.185g)溶于10ml无水乙醇，冰浴条件下加入硼酸缓冲液(140mm，ph9.5)定容至50ml，冰浴条件下保存，可保存3天。所a液中n-乙酰-l-半胱氨酸终浓度0.313mol/l，邻苯二甲醛终浓度0.138mol/l。

所述标准曲线制作方法：用超纯水配制5g/l的2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-丁酸标准溶液，稀释成3个浓度梯度：0.01～0.1g/l(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/l)、0.1～1.0g/l(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/l)、1.0～5.0g/l(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/l)，用排枪分别吸取不同浓度梯度的标准溶液40μl至96孔微孔荧光检测板，分别加入40μl配制好的冰浴保存的a液，在酶标仪中振荡30s，再分别加入100μl超纯水，再振荡30s，在，在λex＝340nm；λem＝455nm，测定荧光强度值，以所得荧光强度值为纵坐标，对应标品浓度为横坐标，制作标准曲线。共制得3个浓度范围的标准曲线，可知在样品浓度为0.01～0.1g/l时候线性良好(如图1)，r²＝0.9978，表明此法有很高的准确性和适用性。

3、高效液相色谱复筛

将步骤2筛选出的菌株接种到斜面培养基，30℃培养48h后，于4℃冰箱保存。

将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h。将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h。在12000g下离心5min，收集湿菌体。取湿菌体，加入底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸和氨水，用氨水调节溶液ph8.5，构成10ml反应体系，湿菌体终浓度50g/l，底物终浓度50mm，置于30℃水浴摇床转化24h。取1ml转化液，离心分离后取上清液进行hplc分析。最终得到一株催化活力较高的野生菌株，并将此菌株记为zjb-17005。

高效液相色谱(hplc)复筛方法为：将上述转化液离心取上清，用超纯水稀释10倍后，取200μl至干净1.5mlep管，加入衍生化试剂200μl，在30℃反应5min后，加入600μl超纯水混匀后，用针筒滤膜(0.22μm)过滤后，放入hplc进行检测，得到转化液中2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-丁酸的浓度。

所述衍生化试剂：0.1g邻苯二甲醛、0.12gn-苯乙酰-l-半胱氨酸，用10ml无水乙醇溶解后，用硼酸缓冲液(100mm，ph9.8)的定容至50ml。

所述hplc条件：美国戴安u3000高效液相色谱仪并配备荧光检测器；戴安c18硅羟基填料柱(250mm×4.6mm)；流动相为含10％纯甲醇的乙酸铵(50mm，ph4.7)溶液，柱温控制在35℃，荧光激发波长λex＝350nm、发射波长λem＝450nm，进样量为10μl。在此条件下，2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸和2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-d-丁酸的出峰时间为7.800min、9.290min(如图2)。

富集培养基组成：2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸1g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠1g/l，k2hpo4·3h2o0.8g/l，kh2po43.3g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，溶剂为去离子水，ph为7。

平板筛选培养基组成：2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸1g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠1g/l，k2hpo4·3h2o0.8g/l，kh2po43.3g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph为7。

生长培养基组成：氯化钠10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，溶剂为去离子水。斜面培养基、种子培养基、发酵培养基组成同实施例3。

实施例2：栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005鉴定

1、形态学鉴定：

本发明实施例1筛选得到的菌株zjb-17005在固体培养基上，37℃培养24小时后形成圆形或近圆形，质地软，表面较光滑，扁平，边缘整齐，有光泽的乳白色菌落，直径2-4mm。革兰氏染色观察：粉红色短杆状，无芽孢。固体培养基组成：氯化钠10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水。

2、生理生化鉴定：

利用biolog(genⅲ)自动微生物鉴定系统对菌株zjb-17005进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株zjb-17005接种于bug平板培养基(biologuniversalgrowthagar)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(if-a)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％t/if-a。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在biologgenⅲ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μl。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于biolog读数仪上读取结果。

菌株zjb-17005经biolog读数仪分析代谢指纹，菌株zjb-17005可较强利用65种碳源，对其他2种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株zjb-17005对23种化学物质敏感。biolog系统给出48h鉴定结果如表1和表2所示。

表1菌株对biologgenⅲ板上71种碳源的利用能力

表2菌株对biologgenⅲ板上23种化学物质的化学敏感性

3、分子生物学鉴定：

以菌株zjb-17005的总dna为模板，利用引物p1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和p2:5'-aaggaggtgatccagccgca-3'扩增菌株的16srdna基因，将基因产物同t载体连接后，委托上海生工对该菌16srdna扩增及测序，得到该菌株的16srdna序列(seqidno.1)后，在ncbi网站上用blast检索genbank中相关菌株的16srdna基因序列，并进行同源性比对。本发明菌株zjb-17005与kluyveracryocrescens菌株kctc2190同源性最高(homology，99％，basedon16sribosomalrnagene)，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16srdna同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，本实验鉴定菌株zjb-17005为栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)，拟命名为栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)zjb-17005，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno：m2017600，保藏日期2017年10月23日，地址：中国·武汉·武汉大学，430072。

任何对核苷酸序列表中seqidno.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入所得的核苷酸序列，只要与该序列具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

实施例3：湿菌体的制备

(1)斜面培养：

将栖冷克吕沃尔菌zjb-17005接种至斜面培养基，在30℃培养48h，获得斜面菌体；

所述斜面培养基终浓度为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，琼脂为20g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8。

(2)种子培养：

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；

所述种子培养基终浓度组成为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8。

(3)发酵培养：

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心10min，收集湿菌体；

所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/l，蛋白胨6g/l，na2hpo43.2g/l，k2hpo41.5g/l，na2edta0.06g/l，mnso40.002g/l，mgso40.001g/l，znso40.002g/l，feso40.01g/l，溶剂为去离子水，ph值为6.8。

实施例4、以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

(1)将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.3g，并用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，使底物终浓度为50mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测。结果表明，zjb-17005可使底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸转化得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸，转化率为49.9％，产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的光学纯度为99.9％。

(2)将酶催化反应得到的含产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的转化液进行分离，提取出产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸。

1)萃取：

将得到的转化液加入分液漏斗，同时加入等体积的二氯甲烷，摇晃后静置3h，从分液漏斗下端放出有机层，从上端倒出水相层。得到水相层为含有产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的水溶液。

2)用阴离子交换树脂进行产物分离

①树脂预处理

离子交换树脂201×7用50℃温水浸泡，使树脂充分膨胀并除去细小颗粒(倾斜或者浮选法)；用1.0m的naoh水溶液浸泡3h，用去离子水洗至中性，再用1.0m的hcl水溶液浸泡3h后用去离子水洗至中性，然后用1.0m的naoh水溶液浸泡3h，转化为oh^-形式，最后用去离子水洗至中性备用。

②装柱

采用湿法装柱(内径1.5cm，高40cm)，先在离子交换柱内先加入13cm高度的去离子水，再取30ml湿树脂201×7装入玻璃杯，加入50ml去离子水，慢慢搅拌，悬浮状的树脂倒入离子交换柱中，让其自然沉降，使其在柱子内分泌均匀，不应有明显的分界线及气泡产生等。

③上样，洗脱

将步骤(2)所得的水溶液调至ph2.5，以上柱流速4.0bv/h进行上样，每隔一段时间取出流出液进行液相检测，当吸附达到最高值时，先用去离子水洗涤，再用1.0m的氨水进行洗脱，洗脱速度为2.0bv/h，用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫色表明洗脱液含有目标物质2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸，收集含目标组分的洗脱液，每隔一段时间检测其中所含有的2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸的含量。洗脱完毕后用去离子水洗涤离子交换柱，并将树脂转化成oh^-用于下一次分离。

④纯化

洗脱液减压蒸馏得到黄色粘稠物质，加入甲醇溶解，冰浴下搅拌重结晶得到白色固体，过滤即得产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸。

以步骤(1)反应条件制备的转化液1l经上述方法分离纯化后，得到2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸固体4.9g，产物得率98.9％，光学纯度为99.9％。

实施例5：以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l反应液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸9.5g，产物得率95.9％，光学纯度为99.9％。

实施例6：以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为200mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸19.2g，产物得率96.9％，光学纯度为99.9％。

实施例7：以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体2g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为200mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例1中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸19.1g，产物得率96.4％，光学纯度为99.9％。

实施例8：以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为50mm，置于40℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例1中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸4.89g，产物得率98.7％，光学纯度为99.9％。

实施例9：以2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸为底物的生物转化反应

将底物2-n-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-dl-丁酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体2g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为200mm，置于50℃水浴摇床，150rpm转化24h.取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法分离纯化后，得到产物2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-l-丁酸19.5g，产物得率97.9％，光学纯度为99.9％。

实施例10：以n-苯乙酰-dl-丙氨酸为底物的生物转化反应

6.0g丙氨酸和4.6gnaoh加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.0g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加hcl调节ph至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-丙氨酸13g。

将底物n-苯乙酰-dl-丙氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-丙氨酸4.38g，产物得率98.4％，光学纯度为99.9％。

实施例11：以n-苯乙酰-dl-苏氨酸为底物的生物转化反应

6.0g苏氨酸和4.6gnaoh加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.0g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h至溶液呈无色透明，加hcl调节ph至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-苏氨酸10.35g。

将底物n-苯乙酰-dl-苏氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体3g，用氨水调ph8.5，构成100ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-苏氨酸5.87g，产物得率98.6％，光学纯度为99.9％。

实施例12：以n-苯乙酰-dl-酪氨酸为底物的生物转化反应

3.619gdl-酪氨酸和1.8gnaoh加入25ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加2.875g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈乳白色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-酪氨酸5.5g。

将底物n-苯乙酰-dl-酪氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.3g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.9％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-酪氨酸8.82g，产物得率97.4％，光学纯度为99.9％。

实施例13：以n-苯乙酰-dl-苯丙氨酸为底物的生物转化反应

3.3gdl-苯丙氨酸和1.8gnaoh加入25ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌，溶液透亮，滴加2.875g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈乳白色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至4.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-苯丙氨酸5.2g。

将底物n-苯乙酰-dl-苯丙氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.4g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.6％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-苯丙氨酸7.86g，产物得率95.2％，光学纯度为99.9％。

实施例14：以n-苯乙酰-dl-亮氨酸为底物的生物转化反应

3.92g亮氨酸和3.2gnaoh加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加6.2g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-亮氨酸7.43g。

将底物n-苯乙酰-dl-亮氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.6g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.4％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-亮氨酸6.02g，产物得率92.3％，光学纯度为99.9％。

实施例15：以n-苯乙酰-dl-异亮氨酸为底物的生物转化反应

7.84g异亮氨酸和6.4gnaoh加入60ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌，溶液透亮，滴加5.78g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至2.0左右，溶液变为无色透明，析出少量白色固体,抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-异亮氨酸7.28g。

将底物n-苯乙酰-dl-异亮氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g，用氨水调节ph8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.5％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-异亮氨酸6.14g，产物得率93.7％，光学纯度为99.9％。

实施例16：以n-苯乙酰-dl-丝氨酸为底物的生物转化反应

6.0g丝氨酸和4.6gnaoh加入20ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液无色透明，滴加5.2g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈淡黄色，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，溶液呈无色透明，加hcl调节ph至2.0左右，析出白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-丝氨酸11g。

将底物n-苯乙酰-dl-丝氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.5g用氨水调节溶液ph为8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.2％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-丝氨酸4.96g，产物得率94.4％，光学纯度为99.9％。

实施例17：以n-苯乙酰-dl-甲硫氨酸为底物的生物转化反应

8.94g甲硫氨酸和7.2gnaoh加入120ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加10.3g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈透明，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至2.0左右，析出大量白色固体，减压抽滤烘干得到n-苯乙酰-dl-甲硫氨酸14.8g。

将底物n-苯乙酰-dl-甲硫氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.45g，用氨水调节溶液ph为8.5构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.2％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-甲硫氨酸7.02g，产物得率94.2％，光学纯度为99.9％。

实施例18：以n-苯乙酰-dl-缬氨酸为底物的生物转化反应

9.36g缬氨酸和7.2gnaoh加入60ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加14.24g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈微黄色，略有浑浊，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，溶液变无色透明，加hcl调节ph至2.0左右，析出大量白色固体，抽滤烘干得到白色固体即为n-苯乙酰-dl-缬氨酸17.3g。

将底物n-苯乙酰-dl-缬氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.2g，用氨水调节溶液ph为8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.6％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-缬氨酸5.62g，产物得率96％，光学纯度为99.9％。

实施例19：以n-苯乙酰-dl-谷氨酸为底物的生物转化反应

5g谷氨酸和4.6gnaoh加入30ml蒸馏水中，冰浴条件下充分搅拌至溶液透亮，滴加5.735g苯乙酰氯，滴加完成后，溶液呈透明，继续冰浴条件反应2h，再常温搅拌反应5h后，加hcl调节ph至2.0左右，溶液变浑浊，4℃冰箱冷藏过夜后析出大量白色固体，减压抽滤烘干得到n-苯乙酰-dl-谷氨酸8.1g。

将底物n-苯乙酰-dl-谷氨酸溶于氨水，再加入实施例3方法制备的湿菌体0.4g，用氨水调节溶液ph为8.5，构成10ml反应体系，其中底物加入终浓度为100mm，置于30℃水浴摇床，150rpm转化24h。取1ml转化液至ep管中，离心分离后取上清液按实施例1中所述方法进行hplc分析检测得转化率49.0％。同样反应条件下制备1l转化液，按实施例4中方法(用浸染0.2％的茚三酮溶液的滤纸进行检测，滤纸变紫黑色表明洗脱液含有目标物质)分离纯化后，得到产物l-谷氨酸6.94g，产物得率94.4％，光学纯度为99.9％。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>栖冷克吕沃尔菌zjb-17005及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1406

<212>dna

<213>栖冷克吕沃尔菌(kluyveracryocrescens)

<400>1

gcgcctcccgaggttagctacctacttcttttgcacccactcccatggtgtgacgggcgg60

tgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcattctgatctacgattactagcgatt120

ccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgacatactttatgaggtc180

cgcttgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatatgccattgtagcacgtgtgtagccct240

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gtctcctttgagttcccggccgaaccgctggcaacaaaggataagggttgcgctcgttgc360

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tcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgacttaacgcgttagctc600

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cccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttc1140

cagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggatcgtcgcctaggtgagccattacc1200

ccacctactagctaatcccatctgggcacatccgatggtgtgaggcccgaaggtccccca1260

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cgggcagtttcccagacattactcacccgtccgccactcgtcacccaagagcaagctctc1380

tggctaccgtcgactgcaggtagctc1406