本发明涉及生产淀粉糖领域，具体涉及复合糖化酶制剂和淀粉糖化的方法。
背景技术：
淀粉糖是以谷物、薯类等富含的淀粉为原料，在酶的催化下，经过液化、糖化等一系列反应，生产的大宗产品。淀粉糖的功能作用很多，既可以作为食品添加剂，也可以作为重要的工业原料，还能经过再次深加工成功能性低聚糖、维生素、氨基酸等产品。
目前淀粉糖制糖工艺一般均采用双酶法，即包括酶液化与糖化工艺。其中糖化工艺是指在淀粉浆在液化成糊精后，加入葡萄糖淀粉酶(又称糖化酶)、普鲁兰酶等，掌握添加酶量和酶浓度，控制反应温度、时间，最终生产葡萄糖糖浆的过程。其中葡萄糖淀粉酶是一类外切酶，从淀粉分子的非还原性末端逐个切开α-1,4葡萄糖苷键，生成葡萄糖，葡萄糖淀粉酶作用于长链比短链活性大，随着水解的进行，糊精链会越来越小，从而导致水解速度变慢。另外，葡萄糖淀粉酶可以水解α-1,6键，但是水解速度非常缓慢。而玉米淀粉中支链淀粉含量高达70％以上，所含有的α-1,6糖苷键是导致玉米淀粉糖化后期速度变慢的主要原因。商业化的糖化酶是由黑曲霉发酵得来，但在发酵过程中黑曲霉也会表达少量的蛋白酶、淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶(也称转苷酶)等。α-葡萄糖苷酶对糖化酶的质量影响最大，它会催化葡萄糖基转移到另一个葡萄糖或麦芽糖等上，转苷位点多在6-oh上，生成异麦芽糖、潘糖等；也可以转移到另一个葡萄糖基的2-oh、3-oh上，生成曲二糖与黑曲霉糖，从而降低糖化产物葡萄糖浆的dx值(dx值是指葡萄糖占糖浆的质量百分比)。
而且传统的淀粉制糖工艺中，一般采用底物浓度为25％-35％的液化液进行糖化。这种典型的制糖工艺效益一般。主要体现在两个方面，一是葡萄糖得率不高，目前最高的dx值生产水平(在32％底物的情况下)仅在96.5％左右，有着很大的空间进一步提升；另一个是该工艺水耗、能耗大。实际上酶促反应只需要消耗很少量的水，由于浆料浓度稀，导致下游工艺糖液浓缩过程中不得不蒸发大量的水，耗费大量的能源，导致生产成本增高。在一些发酵行业中，补糖的糖液浓度通常需要在40％以上；在果糖生产中，配料起始浓度在35％左右，需要浓缩到42-45％左右进行异构化，如果可以将配料浓度提高到40-45％，就可以省去异构前的蒸发工序，从而减少固定投资，降低能耗，简化工序。而糖化过程中，随着底物浓度的提高，反应液的粘度增大，会导致糖化反应速率和葡萄糖得率下降；另外在高浓度底物条件下，产物纯度也会受到影响。
cn103981239b公开了在配料浓度为50％时仅通过改变糖化酶与普鲁兰酶的比例来提高最终产物的dx值的方法，但糖化效果一般，最高仅为93.65％。
因此，亟需一种可以有效地减少糖化过程中特别是高浓度底物的糖化过程中的逆反应、提高产物的dx的酶以及淀粉糖化的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的糖化产物纯度不高、工序繁琐等问题，提供了复合糖化酶制剂和淀粉糖化的方法。
本发明的发明人发现影响高浓度底物糖化的因素主要有以下两点：(1)转苷酶活力，糖化酶必须不含转苷酶活力，否则会加剧逆反应的发生，产生较多的异麦芽糖、潘糖等，影响最终糖浆的dx值；(2)糖化酶与普鲁兰酶的配比，普鲁兰酶的配比需要大幅度提高。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种复合糖化酶制剂，所述制剂含有第一糖化酶和普鲁兰酶，所述第一糖化酶为失活agdb基因后的黑曲霉分泌的糖化酶。
本发明第二方面提供了一种淀粉糖化的方法，所述方法包括：
(1)使用淀粉配置料液；
(2)在本发明第一方面所述的复合糖化酶制剂的存在下对料液进行糖化。
本发明所述复合糖化酶制剂在糖化过程中特别地在高浓度底物的糖化过程中，可以有效地减少逆反应，得到产物的dx较高，同时可以大幅缩短糖化周期，延长糖化窗口。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
术语解释
术语“糖化酶”：又称葡萄糖淀粉酶[glucoamylase，(ec.3.2.1.3.)]，能将淀粉从非还原性未端水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖；同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-d-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还用于生产各种规格的葡萄糖，凡是对淀粉、糊精进行酶水解的工序上都可适用。
术语“α-葡萄糖苷酶”：α-glucosidase，简称agd酶，ec3.2.1.20，又名α-d-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成α-1,6糖苷键，从而形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称imos，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)。术语“糖化”是指将短链糊精分解为葡萄糖的过程。
术语“dx值”是指葡萄糖占糖浆的质量百分比。
术语“de值”是指还原糖占糖浆的质量百分比。
术语“基于淀粉干基的重量(或ds)”是指以淀粉干基的重量为基准进行计算。
术语“约”指引用值的±10％。
术语“酶活比例”是指酶活力(单位u/g或u/ml)之间的比例，其中糖化酶与普鲁兰酶的酶活力测定按照国标gb1886.174-2016。
本发明第一方面提供了一种复合糖化酶制剂，所述制剂含有第一糖化酶和普鲁兰酶，所述第一糖化酶为失活agdb基因后的黑曲霉分泌的糖化酶。
在此，所述agdb基因为一种表达α-葡萄糖苷酶的基因。
根据本发明，所述第一糖化酶为失活agdb基因后的黑曲霉分泌的糖化酶。在此，agdb基因可以为本领域公知的一种转苷酶基因，例如可以为基因序列为seqidno:1所述的基因。
seqidno:1所示的核苷酸序列为：atgttggggtctttgcttttactcttaccccttgtgggcgctgctgtcattggacccagg60
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aggtggagaaatgtaccttgctggggaagtcagcacggacgttcaagggctttgcactcg2880
atgcgccggtgaactttaagctgaagtag
根据本发明，失活agdb基因的方法可以为本领域已知的任何方法，例如可以为cn104962594a所述的方法。
在本发明所述的复合糖化酶制剂中，所述第一糖化酶与普鲁兰酶的酶活比例为(7.5-80)：1，例如可以为约7.5:1、约8:1、约9:1、约10:1、约15:1、约20：1、约25：1、约30：1、约35：1、约40：1、约45：1、约50：1、约55：1、约60：1、约65:1、约70：1或约80：1，以及上述比例范围中任意两个所组成范围中的任意一值，优选地所述第一糖化酶与普鲁兰酶的酶活比例为(10-60)：1，进一步优选为(20-60)：1，更优选为40：1。
在本发明所述的复合糖化酶制剂的一种优选的实施方式中，所述制剂由所述第一糖化酶与普鲁兰酶按照上述比例复合而成。
本发明第二方面提供了一种淀粉糖化的方法，所述方法包括：
(1)配置料液；
(2)在本发明第一方面所述的复合糖化酶制剂的存在下对料液进行糖化。
在此，所述淀粉选自但不限于玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉中的至少一种。
在本发明所述淀粉糖化的方法中，步骤(1)中，由淀粉配置料液的方法可以根据现有技术来选择。在此，所述料液主要含有糊精，还含有少量的蛋白质、脂质体等。优选地，所述料液通过质量浓度为28％-65％的淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。更优选地，所述料液通过质量浓度为38-55％的淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。进一步优选地，所述料液通过质量浓度为45％的淀粉溶液经α-淀粉酶液化得到。
在本发明所述淀粉糖化的方法中，步骤(2)中，优选地，所述复合糖化酶制剂的用量为20-80u/gds，优选为30-60u/gds，更优选地50u/gds。
在本发明所述淀粉糖化的方法中，优选地，所述糖化在ph为3-5的条件下进行，优选地在ph为4-5的条件下进行。
在本发明所述淀粉糖化的方法中，优选地，所述糖化的条件包括：温度为40-70℃，优选为约50-60℃，糖化时间为24-96h，优选为24-48h，更优选为约36-48h。
本发明所述的复合糖化酶制剂的逆反应低于常规糖化酶，所得产物的dx明显高于常规糖化酶，并且随着反应时间的延长，所得产物的dx几乎没有明显下降趋势；并且与常规糖化酶相比，本发明所述的复合糖化酶制剂可以大幅缩短糖化周期，例如缩短8-10h，此外，延长糖化时间对本发明所述复合糖化酶制剂的糖化效果几乎没有影响，大幅增加了糖化操作的弹性，扩大了糖化的窗口期(30-48h)。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下为各实施例、对比例中涉及的分析和测试方法：
(1)高效液相色谱分析方法：
仪器：岛津lc-20a，色谱柱：aminexhpx-87h柱子，流动相为5mmol/l硫酸，流速为0.6ml/min，检测器为rid-20a。
(2)糖化终点样品的od检测方法为：
取0.25ml糖化终点样品，加入4.75ml无水乙醇充分混匀30s后，移至分光光度计中检测420nm的吸光度。
以下为各实施例、对比例中涉及的原料：
百斯杰糖化酶highdexultra3.0，购自南京百斯杰生物工程有限公司。常规糖化酶(由黑曲霉发酵，经转苷酶工艺纯化所得)与普鲁兰酶复配而成，常规糖化酶与普鲁兰酶酶活比例约为80：1；
诺维信糖化酶dextrozyme1.5plus，购自诺维信(中国)投资有限公司，其中常规糖化酶与普鲁兰酶酶活比例约为80：1；
第一糖化酶按照cn104962594a实施例6所述的方法得到的。
普鲁兰酶购自南京百斯杰生物工程有限公司
常规淀粉酶a、b中的葡萄糖淀粉酶购自南京百斯杰生物工程有限公司。
复合糖化酶制剂a，其中只有第一糖化酶，不含普鲁兰酶，记为第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为1：0；
复合糖化酶制剂b，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为100：1；
复合糖化酶制剂c，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为80：1；
复合糖化酶制剂d，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为60：1；
复合糖化酶制剂e，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为40：1；
复合糖化酶制剂f，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为20：1；
复合糖化酶制剂g，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为10：1；
复合糖化酶制剂h，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为8.5：1；
复合糖化酶制剂i，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为7.5：1；
复合糖化酶制剂j，其中第一糖化酶与普鲁兰酶酶活比例为5：1；
常规组合酶a：葡萄糖淀粉酶与普鲁兰酶酶活比例为10:1，
常规组合酶b：葡萄糖淀粉酶与普鲁兰酶酶活比例为7.5:1。
实施例1
实施例1用于说明不同复合糖化酶制剂对α-葡萄糖苷酶的活性
配置32％的新鲜葡萄糖料液，使用1mol/lhcl调节ph至4.3。称取50g上述料液于200ml三角瓶中，加入50u/gds(以糖化酶酶活计)糖化酶(分别使用百斯杰糖化酶highdexultra3.0、复合糖化酶制剂a、b、c、d、e、f、g)，混匀后放置摇床中反应，在60℃下反应48h。对反应结束后的样品进行高效液相色谱分析，结果如表1所示。
表1
表1及以下表中的dp1表示单糖，dp2表示二糖，dp3表示三糖，dp4表示四糖及以上。表1及以下表中液相分析组成为根据高效液相色谱分析所得面积换算的各组分占总反应产物(干重)的重量百分比。在此，dp1含量即为dx值。
由表1可知，本发明所述的复合糖化酶制剂c-g的糖苷化逆反应低于常规糖化酶(这可以通过dp2的含量看出，dp2的含量越高，逆反应的程度越大)，而且复合糖化酶制剂e的逆反应最低，在此基础上再提高普鲁兰酶的比例，逆反应降低不明显。
实施例2
由含量为45％的淀粉溶液制备新鲜糊精(de12)料液，使用1mol/lhcl调节ph至4.3。称取50g上述料液于200ml三角瓶中，加入50u/gds(以糖化酶酶活计)糖化酶(分别使用百斯杰糖化酶highdexultra3.0、复合糖化酶制剂a、b、c、d、e、f、g、h、i、j)，混匀后放置摇床中反应，在60℃下反应48h。对糖化结束后的样品进行高效液相色谱分析，同时检测糖化终点样品的od，结果如表2所示。
表2
由表2可知，与复合糖化酶制剂a、b、j相比，经本发明所述复合糖化酶制剂e-i催化所得产物dx明显较高，达96.84％以上，甚至达97.21％以上。
实施例3
参照实施例2中所述糖化方法，不同的是，使用的糖化酶分别为复合糖化酶制剂c、d、e、f、g、i、常规组合酶a、常规组合酶b，百斯杰糖化酶highdexultra3.0，诺维信糖化酶dextrozyme1.5plus，并在在反应24h、30h、40h、48h、72h、96h分别取样检测od值以及利用高效液相色谱分析。结果如表3所示。
表3
由表3可知，与百斯杰糖化酶highdexultra3.0、诺维信糖化酶dextrozyme1.5plus、常规组合酶a、常规组合酶b相比，本发明所述的复合糖化酶制剂c、d、e、f、g、i所得产物的dx明显较高；并且反应30h时，dx值达到最高，再继续延长反应时间，dx值并没有明显下降，说明转苷反应非常有限。由此可见本发明所述复合糖化酶制剂c、d、e、f、g、i可以大幅缩短糖化周期，缩短至少8-10小时，并且延长糖化时间对糖化效果几乎没有影响，大幅增加了糖化操作的弹性，扩大了糖化的窗口期，将糖化窗口期延长至30-72小时。
实施例4
按照实施例2所述的方法进行糖化，不同的是，新鲜糊精料液(de12)由质量浓度为28％、38％、55％、65％的淀粉溶液液化所得，使用的糖化酶分别为复合糖化酶制剂c、g、百斯杰糖化酶highdexultra3.0、诺维信糖化酶dextrozyme1.5plus，糖化结束后检测od值以及利用高效液相色谱分析，结果如表4所示。
表4
由表4可知，与百斯杰糖化酶highdexultra3.0、诺维信糖化酶dextrozyme1.5plus在不同的底物浓度中相比，本发明所述的复合糖化酶制剂c、g所得产物的dx明显较高，逆反应也较少，说明复合糖化酶制剂c、g适合用于高浓底物糖化。
对比例1
配置50质量％的淀粉溶液，将其液化得到料液，使用1mol/lhcl调节ph至4.3。称取50g上述料液于200ml三角瓶中，按cn103981239b中实施例1所述条件进行糖化，加34u/gds(以糖化酶酶活计)的酶(分别为复合糖化酶制剂i、常规组合酶b，其中常规组合酶b按照cn103981239b中所述“在加入4aspu/g普鲁兰酶的前提下，加入30u/g葡萄糖淀粉酶”)。混匀后放置摇床中反应，在60℃下反应48h。对糖化结束后的样品进行高效液相色谱分析，结果如表5所示。
表5
如表5可知，本发明所述复合糖化酶制剂i所得产物的dx明显优于常规组合酶b，说明本发明所述复合糖化酶制剂i在高浓度底物糖化过程中具有明显优势。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>中粮集团有限公司
吉林中粮生化有限公司
南京百斯杰生物工程有限公司
<120>复合糖化酶制剂和淀粉糖化的方法
<130>快i55910cof
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