一种活性增强子筛选载体及其构建方法与流程

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种活性增强子筛选载体及其构建方法。
背景技术：
：真核生物的基因表达调控是个复杂的过程，其中受到多种转录调控元件的控制。其中增强子作为一种重要的顺式调控元件与启动子在空间形成环状并相互作用控制着靶基因的转录。生物体的基因组有大量的基因，这些基因在不同的时间空间上相互协作共同执行着调控生物体复杂的功能，那么基因组的基因在执行功能的时候增强子是如何变化的，所以全基因组的增强子鉴定就变得非常重要。目前，全基因组增强子的鉴定主要是依据增强子区域的表观遗传学特征，比如甲基化修饰，乙酰化修饰等；依赖此类特征的主要技术是以chip-seq为主。从chip-seq组蛋白标志鉴定的增强子来说，比如它需要有特异性很高的抗体以及生息分析的局限性导致了假阳性的存在。基于此，如果开发一种活性增强子筛选载体，只要将待筛选文库直接插入到载体的特定位置就可以直接进行活性增强子的筛选了，这种方法大大简便了全基因组水平活性增强子的筛选，对研究增强子的作用机制具有重要意义。技术实现要素：本发明目的是针对上述问题，提供一种活性增强子筛选载体及其构建方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种活性增强子筛选载体的构建方法，其中，基于逆转录病毒载体进行构建，从荧光素酶报告载体中获得微型启动子和mChery片段，并将所获得的微型启动子和mChery片段克隆至逆转录病毒载体中，获得活性增强子筛选载体。所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述荧光素酶报告载体为PGL4.23荧光素酶报告载体。所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体pMX-GFP。所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，活性增强子筛选载体的构建方法具体包括：S1、去除PGL4.23荧光素酶报告载体中原有的luc2报告基因，将mCherry基因连接到miniP后面；S2、扩增miniP-mCherry片段，并将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP，用miniP-mCherry替换GFP基因，构建成最终的活性增强子筛选载体。所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述步骤S1具体为：利用限制性内切酶XbaI/NcoI通过双酶切去除PGL4.23荧光素酶报告载体中luc2报告基因的原始编码序列，将mCherry基因连接到miniP后面；所述的活性增强子筛选载体的构建方法，其中，所述步骤S2具体为：利用携带NcoI或NotI酶切位点的引物扩增miniP-mCherry片段，并通过这两个酶切位点将其连接至逆转录病毒载体pMX-GFP中，用miniP-mCherry替换GFP基因，最终获得活性增强子筛选载体。一种活性增强子筛选载体，其中，利用如上所述的方法构建而成。有益效果：本发明提供一种活性增强子筛选载体及其构建方法，利用该方法构建的活性增强子筛选载体，只需将待筛选文库直接插入到载体特定位置即可直接进行活性增强子的筛选，大大简便了全基因组水平活性增强子的筛选，对研究增强子的作用机制具有重要意义。附图说明图1为本发明本发明具体实施例中活性增强子筛选载体图谱；图2为本发明实验原理流程图；图3为本发明具体实施例中利用XhOI和HindIII对增强子筛选表达载体酶切后琼脂糖凝胶电泳检图；图4为本发明具体实施例中同源重组质粒pmx-mp-N25-mchery琼脂糖凝胶电泳检图；图5为本发明随机序列文库转染细胞荧光图。图6为本发明细胞流式筛选富集结果。图7为本发明两步法建库测序琼脂糖凝胶电泳检图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明活性增强子筛选载体(pMX-miniP-mCherry)是基于改良的逆转录病毒载pMX-GFP改造的(CellBiolabs,USA)。其中miniP为微小启动子，来源于pGL4.23载体。mCherry红色荧光报告基因，其序列通过基因合成得到。具体为：从改良的PGL4.23荧光素酶报告载体(Promega,USA)中获得微型启动子(mini-promoter)和mChery片段。首先用限制性内切酶XbaI/NcoI消化PGL4.23，去除luc2报告基因的原始编码序列，将mCherry基因连接到miniP后面，然后利用携带NcoI或NotI酶切位点的引物扩增miniP-mCherry片段，并通过这两个酶切位点将其连接至pMX-GFP载体，最终获得活性增强子筛选载体命名为pMX-miniP-mCherry，如图1所示。如果在miniP上游连接了增强子序列，即能启动mCherry报告基因的表达。如图2所示，本发明将随机合成序列(20-50bp)同源重组到mini启动子的上游，如果随机序列有增强子活性将激活下游报告基因mChery的表达，通过流式富集把增强子阳性细胞筛选下来，通过建库再去高通量测序得到增强子序列。活性增强子筛选过程大致如下：1、构建活性增强子的筛选文库；2、将筛选文库构建到活性增强子筛选载体上；3、筛选文库进行细胞转染；4、流式细胞仪进行阳性细胞富集；5、高通量测序鉴定增强子序列。具体实验过程如下：1、随机序列文库的合成：25bp长随机序列文库委托金唯智生物科技有限公司合成。随机文库稀释：12000g，RT，离心90s，加无菌水稀释成浓度为50ng/ul的溶液。2、载体线性化2.1载体双酶切利用XhOI(NEB.Cat.No.R0146V)和HindIII(NEB.Cat.No.R0104b)在NEBuffer2.1(NEB.Cat.No.B7202S)缓冲液中对活性增强子筛选载体进行酶切，酶切后序列电泳图如图3所示，酶切体系如下：组分用量NEBuffer2.15ulXhoI2ulHindIII2ulDNA20ugddwaterTo50ul2.2酶切载体胶回收称取0.5g胶粉溶于50ul1xTAE中，微波炉加热1分钟，拿出摇晃数下继续加热1min，倒入胶板中静置30min。以超螺旋DNALadder(NEB；Cat.No.N0472S)为对照，每孔200-500ng上样量，设置参数120V，130mA，45min进行琼脂糖电泳；用胶回收试剂盒(Zymo；Cat.No.D4008)回收目的条带。质粒文库构建3.1同源重组质粒(pmx-mp-N25-mchery)构建利用同源重组酶(Vazyme；Cat.No.C112)对线性载体和随机文库进行同源重组，每个反应随机文库10ng，线性载体120ng，37℃反应30min，将重组产物加入到感受态细胞(TSINGKE；Cat.No.TSC01)中，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴45S，立即取出冰上静置2-3min，每管感受态加入500ulSOC培养基在37℃，200rpm摇床中活化1h，取出后在离心机中2000g，RT，5min，弃上清，留100ulSOC重悬菌体，将菌液均匀涂布在固体培养板上，37℃培养箱过夜培养(具体时间视感受态效率而定)。3.2质粒提取在固体培养皿中添加LB培养基将菌落全部刮下，并补充适当体积的LB培养基(添加AMP)到锥形瓶中，设置摇床参数37℃，200rpm摇菌12-16小时。第二天用质粒提取试剂盒(OMEGA；Cat.No.D6950)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量(图4)。细胞培养从液氮中取出细胞(293T)，空气中放置10-15s，在37℃水浴锅中快速解冻，将细胞悬液转移到离心管中，200g，RT，离心5min；弃上清，加完全培养基(90％DMEM(ThermFisher；Cat.No.10566024)+10％FBS(Gibco；Cat.No.10437028))重悬细胞，然后置于培养箱中。细胞转染及增强子阳性细胞富集待细胞生长到80％-90％汇合度时，使用脂质体试剂(promega；E2311)转染细胞，同时分别设置pmx-mp-mchery和pmx-SP40-mp-mchery为阴性和阳性对照。48h后观察荧光表达情况(图5)，每个100mm培养皿加入2ml消化酶(Thermofisher；Cat.No.A1110501)消化细胞2min,加入2ml完全培养基终止消化，200g，RT，离心5min；弃上清，加入5mlDPBS洗涤一次，再次离心收集细胞；利用流式分选细胞仪富集增强子阳性细胞(图6)。测序建库6.1阳性细胞基因组DNA提取将富集的细胞2000g，RT，离心5min,弃上清；在细胞沉淀中加入600ul细胞裂解液(STE)，70ul10％SDS(终浓度为1％)，5ul蛋白酶K(终浓度为100～200ug/ml)，并轻轻上下颠倒数下，混匀后放在56℃的烘箱内孵育1h,其间要不间断轻轻振荡使其消化完全。抽提步骤1：加入等体积平衡酚(约700μl)，上下轻轻颠倒混匀，13000g，离心10min，小心吸取上清液于新的EP管里。抽提步骤2：加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)混合液，上下轻轻颠倒混匀，13000g，RT，离心10min，小心吸取上清液于新的EP管内。如中间还有白色蛋白层，重复抽提步骤1、2，至无白色蛋白层。沉淀：在上清液中加入两倍体积的-20℃冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少1h，13000g，RT，离心15min，弃上清液。注意此步需要小心操作以防止DNA沉淀块被一起丢弃。漂洗：加入500μl的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000g，RT，离心2min，吸去上清液。若杂质较多，可以重复该步骤几次。干燥：将管倒立在卷纸上，晾干DNA沉淀块，除去残余乙醇。溶解：加入适量TE(pH8.0)或灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，保存以备电泳检测。6.2建库本发明建库分为两步PCR建库。第一步：根据载体设计扩增引物(本实验：pMX-TY1:5’—TGCAGGTGCCAGAACATTTC—3’pMX-TY2:5’—GTGGCTTTACCAACAGTACC—3’)利用高效扩增酶(KAPA；Cat.No.KK2601)以及PCR扩增程序(98℃45s，98℃10s，60℃10s，72℃5s，72℃1min)扩增基因组DNA(7循环)，再进行切胶回收纯化目的条带(图7)。第二步：将第一步的胶回收产物利用建库试剂盒(KAPA；Cat.No.KK8504)进行EndRepairandA-tailing，体系如下：按以下程序进行扩增:对上述扩增的产物加上测序用的接头(Vazyme；Cat.No.N805)，体系如下：将上述体系在PCR仪中20℃反应15分钟。在上述混合体系加入1.5倍体积DNACleanBeads(beckman；Cat.No.A63881)使用移液器吹打10次混匀，室温孵育5min；将反应管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清(约5min)，移除上清。保持EP管处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30s，移除上清，重复此步骤一次。保持EP管处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3-5min(不能使磁珠皲裂)。将EP管从磁力架中取出，加入相应体积灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置2min。将反应管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清(约5min)，小心吸取上清至新EP管中备用。将Beads纯化后的产物用KAPALibraryAmplicationPrimerMix按照第一步的扩增程序扩增4个循环，120V，130mA琼脂糖电泳35min,再进行切胶回收(图7)，对回收产物Qubit检测浓度后进行高通量测序。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。当前第1页1 2 3