一种兼有IgG结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种兼有igg结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白g-sa，及其免疫pcr试剂盒。
背景技术：
：链球菌蛋白g是一种能够和多种哺乳动物的igg以及人血清白蛋白(hsa)相结合的蛋白质，spg同igg的亲和力强，结合谱广。研究表明，spg的三个同源的氨基酸序列c1、c2和c3区域与抗体iggfc端的结合相关，并且c3区与抗体igg的结合能力相当于c1区的7倍（kobatake，1990）。而spg的a、b区则具有与抗体fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。链霉亲和素（streptavidin，sa）是由链霉菌streptomycesavidinii分泌的一种四聚体蛋白，与亲和素(avidin，av)有相似生物学特性。sa可高度特异性地与生物素结合，一分子链霉亲和素可以与四分子生物素结合，形成生物素-链霉亲和素系统。该系统被认为是最稳定的非共价相互作用之一，并在生物
技术领域：
具有广泛的应用，如分子标记、分子定位和靶向药物递送。日本血吸虫病是我国一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，它的感染问题已经受到世界各国的普遍关注，血吸虫病诊断在血吸虫病防治工作中起到重要作用。目前血吸虫病的确诊仍是依据粪检虫卵或毛蚴，但该法缺乏灵敏性，虫卵计数也因人而异，且对轻度感染的血吸虫病人和晚期血吸虫病及经过有效防治的疫区感染人群的诊断效果并不理想，常会出现漏诊。目前，应用免疫学方法诊断病人日趋广泛，然而迄今已建立的免疫学检测系统虽有较高的敏感性与特异性，但对病人的早期诊断及疗效考核仍无理想的有效方法。因此建立一种快速、灵敏、特异的检测手段，对日本血吸虫感染的诊断尤为重要。已有研究表明，ibps被广泛用作免疫化学试剂用来鉴定与纯化抗体、在免疫测定与酶联免疫吸附测定系统中可作为加强反应物、作为融合附加物方便重组蛋白质的固定与纯化，并且ibps还被用于临床上体外免疫吸附，已成为非常有价值的诊断、治疗及制备的工具。但是现有的ibps的广谱性和结合力仍然不高，并且生产成本也居高不下。而且使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记g蛋白的方法存在检测灵敏度低的问题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。无论是用碱性磷酸酶还是辣根过氧化物酶这些常用的酶标记蛋白，都面临着一套复杂的操作，例如加化学试剂进行偶联反应，纯化，透析。以此得到的产品存在蛋白失活，标记不均一等多种问题。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。本发明将具有与多物种igg结合的g蛋白与链霉亲和素进行重构，形成一种新型的双性分子，既具有与igg结合的活性，又具有与生物素的结合活性，这样获得的重组蛋白纯度高，质量稳定，与现有的商品化的生物素标记酶配套，既实现了与抗体的结合，又结合生物素标记的酶，实现了抗体标记。由于引入了生物素标记的dna，可通过pcr进一步放大信号，比单纯的标记g蛋白标记酶的灵敏性更高，而且由于g蛋白与链霉亲和素本身的特点，应用的领域更广。为了实现上述技术方案，本发明提供一种融合蛋白，基于spgc3区和sa的特点，将这两段基因连接起来，重构一种兼有igg结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白g-sa。本发明同时提供一种交联剂，所述交联剂为双功能蛋白g-sa，可以通过g-sa重组蛋白将生物素标记的dna和抗体igg联系起来。因此，可以将该重组蛋白作为交联剂，用于免疫学诊断。本发明同时提供一种免疫pcr体系中的交联剂，所述交联剂为双功能蛋白g-sa。本发明同时提供一种免疫pcr方法，该方法与elisa技术的基本原理类似，不同点就在于elisa是以酶作为标记物，根据酶催化底物的显色程度来反应待测抗原的含量，而免疫pcr则是以一段dna分子作为标记物，根据pcr扩增dna报告分子的产物量来表明检测结果。为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种兼有igg结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白g-sa，包括链球菌蛋白g（spg）片段和sa蛋白，所述链球菌蛋白g（spg）片段为含有spg的c3区段的序列；本发明同时提供一种密码子优化的序列，对spg和sa序列进行密码子优化，拼接后蛋白表达量提高，可溶性增加。其中，链球菌蛋白g（spg）片段和sa蛋白之间的连接序列为如seqidno.8所示；所述链球菌蛋白g（spg）片段的核苷酸序列如seqidno.6所示；sa蛋白的核苷酸序列如seqidno.7所示；所述双功能蛋白g-sa的核苷酸序列如seqidno.5所示；本发明同时提供一种双功能蛋白g-sa的构建方法，所述方法为：（1）根据g蛋白的c3片段的基因序列，从含有c3片段的菌液中pcr扩增出c3序列；（2）通过pcr从含有sa序列的菌液中扩增出sa序列；（3）先将扩增出的sa序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将c3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；（4）将表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；（5）经破碎、纯化后制得融合蛋白g-sa其中，步骤（1）中使用的引物对如seqidno.1、2所示；步骤（2）中使用的引物对如seqidno.3、4所示；上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本发明对表达载体、共表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pet-28、pet-32、pet-15或pet-11的等，共表达载体可为pcdfduet-1等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。本发明中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(pcr)完成。进一步的，本发明提供一种免疫pcr方法，其中所述方法：1.生物素标记dna报告分子的制备；2.免疫pcr法检测；3.结果判断。其中，步骤1具体为：利用生物素标记的上游引物ⅰ和无生物素标记的下游引物ⅱ，通过pcr扩增出生物素化dna作为免疫pcr的报告分子；步骤2具体为：（1）包被：（2）封闭；（3）加一抗；（4）加g-sa；（5）加生物素标记的dna；（6）预变性；（7）pcr扩增；（8）电泳。本发明中，上述免疫pcr方法可用于各种形式的免疫分析，例如抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。有益效果(1)本发明将spg基因的igg结合片段进行重构，只保留蛋白g能与抗体igg的fc端特异性相结合的c3区，并连接sa，制备的重组蛋白具有igg结合活性及生物素结合活性的双功能。(2)本发明的融合蛋白g-sa可高效、高密度的捕获目标分子，达到快速、高灵敏的检测。(3)本发明的融合蛋白g-sa制备过程简单、易行，可适用于不同的免疫检测模式，如可用于间接elisa、夹心elisa、免疫pcr等，仅仅是替换原有检测方法中的一种试剂，不改变原有操作步骤，不需要额外的设备和仪器。附图说明图1spg的结构示意图。图2对重组蛋白的原核表达质粒，进行pcr鉴定，其中，m：核酸标志物；1：g-sa片段；2：c3片段；3.sa片段。图3重组质粒的双酶切鉴定，其中，m：核酸标志物1：pet-28a空载体；2：g-sa片段。图4sds-page分析pet-28a（+）-c3-sa表达情况，其中，m：蛋白标志物；0：无iptg诱导；1、2、4、6、8：iptg诱导1h，2h，4h，6h，8h。图5sds-page分析pet-28a（+）-c3-sa上清蛋白纯化情况m：蛋白标志物；1：超声破碎上清液；2：上样后；3：超声破碎沉淀；4：bindingbuffer纯化后；5：washingbuffer纯化后；6：stripbuffer纯化后。图6westernblotting检测g-sa蛋白与不同物种igg、生物素以及his抗体的结合活性图a：1：蛋白maker；2：鼠抗兔；图b：1：蛋白maker；2：驴抗羊；图c：1：蛋白maker；2：羊抗鼠；图d：1：蛋白maker；2：兔抗山羊；图e：1：蛋白maker；2：hrp-bio；图f：1：蛋白maker；2：his抗体。图7g-sa与不同物种抗体、生物素的亲和常数曲线图8.生物素标记dna报告分子凝胶中电泳结果m：marker；1：pcr阴性对照；2：生物素标记dna图9.免疫pcr阴阳性对照实验图m：marker；1-5：兔阳性血清1:1000、1:2000、1：4000、1:8000、1:16000稀释6：兔阴性血清1:100稀释；7：兔阳性血清1:100稀释。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1重组蛋白的构建1.1生物材料大肠埃希氏杆菌bl21购自南京诺唯赞生物科技有限公司；sa（訾静,张月娟,万一.核心链霉亲和素在毕赤酵母中的表达及纯化[j].中国生物制品学杂志,2018,31(05):485-488）、spg（许瑞,赵登云,洪炀,陆珂,李浩,林矫矫,冯金涛,徐玉梅,朱传刚.链球菌蛋白g的结构域重构、表达及鉴定[j].中国动物传染病学报,2015,23(05):46-52）、质粒pet-28a(+)为实验室保存。1.2重组蛋白g-sa的构建和合成根据spg的c片段以及链霉亲和素基因序列，利用primer5软件设计引物，分别在上游和下游引物中加入酶切位点，引物序列如表1所示。表1扩增引物转入bl21中。1.3重组质粒鉴定对重构的g-sa序列进行pcr反应，反应体系如下：将各组分混匀后，短暂离心置于pcr仪中进行反应，反应参数如下：退火温度如下表：对pcr产物进行电泳鉴定（图2）和双酶切鉴定（图3），测序鉴定结果显示与设计的序列一致。目的基因全片段大小约为680bp。c3片段大小约为170bp，sa片段大小约为480bp。（c3片段pcr对应上下游引物：seqidno.1、2；sapcr对应上下游引物：seqidno.3、4；全片段pcr对应上下游引物：seqidno.1、4）实施例2重组蛋白的表达和纯化2.1重组质粒的表达时相：（1）挑取适量含有目的片段的bl21穿刺菌，接种于5ml含kan+的lb液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。（2）当生长至对数期（od600约为0.6时），加入终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导表达。在诱导表达前、诱导表达后1h、2h、4h、6h、8h分别取0.5ml菌液，应用sds-page电泳分析最佳诱导时间。sds-page分析显示（图4），重组质粒pet-28a（+）-c3-sa在大肠杆菌bl21（de3）中成功表达，且1mmol/liptg诱导后1-8h表达量随着时间的增长变化不明显，诱导2h后表达量达到最高并趋于稳定。当诱导时间超过4h时，杂蛋白的表达量不断增加，使得目的蛋白的表达量减少，所以选择诱导时间为2h时最佳。大量表达：（1）挑取适量含有目的片段的bl21穿刺菌，接种于150ml含kan+的lb液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。（2）当生长至对数期（od600约为0.6时），加入终浓度为0.1mmol/l的iptg进行诱导表达，将诱导后的菌液5000rpm离心15min弃上清，沉淀用10mlbindingbuffer重悬，反复冻融三次后，冰浴超声破碎25min（超2s隔9s）后5000rpm离心15min，收集沉淀和上清。（3）将离心后的沉淀用5ml8mol尿素重悬，冰上溶解2h，重复上述离心步骤，收集上清。（4）将超声后上清、沉淀重悬后上清，分别加入等体积蛋白电泳缓冲液，用sds-page电泳分析表达产物的可溶性。2.2重组蛋白的纯化使用ni-ntahisbindresin对重组蛋白进行纯化（ni-ntahisbindresin序列号：70666-3），按照试剂盒说明书进行操作，简易操作步骤如下：（1）取5ml树脂加入新空柱中静置平衡，当液面降到树脂表面时，依次进行以下步骤；（2）用2cvddh2o*2，chargebuffer*3，bindingbuffer*2;（3）上样前留50ul；（4）3cvbindingbuffer*3(刚加上需要留50ul下清)；（5）3cvwashbuffer*2，同留50ul;（6）2cvelutionbuffer*2，同留50ul;（7）少量stripbuffer(3ml)，反复上样，全留，同取50ul。（8）将上述收集的溶液进行sds-page电泳，分析蛋白纯化情况。sds-page分析显示（图5），重组质粒pet-28a（+）-g-sa表达的蛋白在超声上清和沉淀中均存在，沉淀中的蛋白含量高于上清中的蛋白含量，表明该蛋白具有一定的水溶性。重组蛋白超声上清经过ni-ntahisbindresin纯化后，在经过stripbuffer洗脱后，得到纯化。实施例3g-sa重组蛋白活性鉴定3.1westernblotting检测重组蛋白与igg的结合活性（1）将纯化后的蛋白进行sds-page电泳，之后将蛋白转移至nc膜上，130ma，75min。（2）将nc膜浸泡于pbst稀释的5%脱脂奶粉中，室温封闭2h。（3）将封闭后的nc膜用pbst洗涤三次，每次5min。（4）将nc膜用hrp标记的山羊抗小鼠igg，兔抗山羊igg，小鼠抗兔igg，驴抗山羊igg，生物素（用pbst1:2000稀释）作为抗体，室温孵育1h。（5）将孵育后的nc膜用pbst洗涤三次，每次10min。（6）将nc膜用dab双组份显色液试剂盒进行显色，显色后用流水冲洗，终止反应。结果显示重组蛋白g-sa具有与兔igg，驴igg，鼠igg，羊igg，生物素等的结合能力。（图6）3.3elisa法测定重组蛋白与不同物种igg亲和常数（1）用bca法测定重组蛋白的浓度，并用商品化的标准蛋白g（spg）作为对照。（2）用包被液将蛋白从10μg/ml开始进行倍比稀释，共进行8个稀释度，以100μl每孔包被于96孔板上，每个浓度设置3个重复，4℃包被过夜。（3）将96孔板用pbst洗涤三次，200μl每孔，每次5min。（4）加入用pbst稀释的5%脱脂奶粉的溶液，150μl每孔，37℃封闭2h。（5）将96孔板用pbst洗涤三次，200μl每孔，每次5min。（6）将hrp标记的山羊抗小鼠igg，兔抗山羊igg，小鼠抗兔igg，驴抗山羊igg，生物素，用pbst按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行倍比稀释，100μl每孔，37℃孵育2h。（7）将96孔板用pbst洗涤三次，200μl每孔，每次5min。（8）加入tmb进行显色，100μl每孔，室温反应15min。（9）加入2mol/lh2so4终止反应，30μl每孔，读取od450值。以od450值作为纵坐标，以抗原浓度的对数值作为横坐标，进行曲线拟合，亲和曲线如图7所示根据拟合的曲线，代入相应的公式中，分别计算亲和常数ka，将得到的ka值取其平均数，获得了重组蛋白的亲和常数值，结果见表2。表2g-sa与不同物种抗体、生物素的亲和常数抗体亲和常数山羊4.12*10^4驴1.26*10^5兔5.12*10^4鼠1.03*10^5hrp-bio7.73*10^4结果显示该重组蛋白同时具有spg与不同物种igg结合的能力以及sa的与生物素结合的功能，是一种新型的双功能重组蛋白。经western和elisa测亲和常数均显示重组蛋白具有与igg的结合能力和与生物素的结合能力。实施例4免疫pcr检测血清中日本血吸虫抗体4.1生物素标记dna报告分子的制备采用红色荧光蛋白（rfp）dna为模板（pet-28a（+）-rfp，上海兽医研究所保存），利用生物素标记的上游引物ⅰ和无生物素标记的下游引物ⅱ，通过pcr扩增出340bp的生物素化dna作为免疫pcr的报告分子。上游引物：5’atggcctcctccgagaacgtcatcac3’（5’端标记生物素）(seqidno.9)下游引物：5’agactactatcttgggtaaccgtgg3’(seqidno.10)反应体系如下：组分所需用量（μl）takarataq™hotstartversion25基因序列2上游引物（10μm）2下游引物（10μm）2ddh2o19total50将各组分混匀后，短暂离心置于pcr仪中进行反应，反应参数如下：温度反应时间94℃3min94℃30s60.0℃30s20cycles72℃1min72℃10min4℃infinite将rfp模板的pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并设置ddh2o为模板进行pcr作为阴性对照。经紫外凝胶成像系统观察结果，如图8所示，结果显示以pet-28a（+）-rfp为模板进行的pcr能扩增出目的条带，条带大小为430bp，阴性对照没有扩增出条带，验证正确，说明引物设计正确，并且没有出现假阳性。4.2免疫pcr法检测日本血吸虫抗体（1）包被：包被液稀释日本血吸虫虫卵可溶性抗原（sea）至0.5ug/ml，100ul/孔，4℃过夜。（2）封闭：5%脱脂奶粉200ul/孔，37℃封闭1h，pbst洗三次。（3）加一抗：用封闭液1：1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000稀释兔日本血吸虫阳性血清，用封闭液分别稀释1:100兔日本血吸虫阴性血清，和1:100兔日本血吸虫阳性血清，分别以80ul/孔，37℃、2h，pbst洗三次。（4）加g-sa：用pbs稀释g-sa至100ng/ml，70ul/孔，37℃、2h、pbst洗三次。（5）加4.1制备获得的生物素标记的dna：用pbs稀释dna-bio至1ng/ml，50ul/孔，37℃，2h，用pbst洗三次，灭菌水洗三次后，每孔加入50ul加热的灭菌水。（6）预变性：96℃，10-15min，迅速置于冰上，取少量（2-5ul）上清作为pcr模板。（7）pcr扩增：用常规引物扩增，pcr反应条件同4.1。（8）电泳：pcr产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，经紫外凝胶成像系统观察结果并保存图片，实验结果如图9所示，结果显示，1:100稀释的阴性血清孔未扩增出目的条带，1:100稀释的阳性血清有扩增出目的片段，说明，以此方法进行的血清检测可行，没有出现假阳性。兔阳性血清梯度稀释后用此方法进行的检测，稀释至1:16000时仍检出弱阳性，说明此方法灵敏度极高。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）<120>一种兼有igg结合活性及生物素结合活性的双功能蛋白及其免疫pcr试剂盒<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>c区上游引物<400>ccgggatccacttacaaac<210>2<211>19<212>dna<213>c区下游引物<400>gctaccaccaccaccactg<210>3<211>25<212>dna<213>sa区上游引物<400>gatccgagcaaagatagcaaagccc<210>4<211>23<212>dna<213>sa区下游引物<400>ggcctcgagttattgctgaacag<210>5<211>675<212>dna<213>重组蛋白g-sa的核苷酸序列<400>acttacaaacttgttattaatggtaaaacgctgaagggtgaaaccaccaccaaagcggtggatgccgaaaccgcgcagaaggcctttaagcagtacgccaacgacaatggcgtggatggtgtttggacctacgacgacgcgaccaaaacctttcgtgttaccgaaggcggtggtggcagtggtggtggtggtagcgatccgagcaaagatagcaaagcccaagtgagtgccgcggaagccggcattacgggtacgtggtacaaccagctgggcagcaccttcattgttacggcgggtgccgatggtgccctcaccggtacgtacgaaagcgcggttggcaatgccgaaagccgttacgtgctgaccggtcgttatgatagtgcgccagcgaccgatggtagtggtaccgcgctgggttggaccgttgcgtggaagaacaactaccgcaatgcccatagcgccacgacgtggagcggtcagtacgttggcggtgccgaagcccgtatcaatacgcagtggctgctgaccagcggtacgaccgaagcgaatgcgtggaaaagtacgctggtgggccacgatacgttcaccaaggtgaagccaagcgccgcgagcatcgatgcggccaaaaaagccggcgtgaataatggcaaccctctagacgctgttcagcaataa<210>6<211>165<212>dna<213>重组蛋白spg片段的核苷酸序列<400>acttacaaacttgttattaatggtaaaacgctgaagggtgaaaccaccaccaaagcggtggatgccgaaaccgcgcagaaggcctttaagcagtacgccaacgacaatggcgtggatggtgtttggacctacgacgacgcgaccaaaacctttcgtgttaccgaa<210>7<211>480<212>dna<213>重组蛋白sa片段的核苷酸序列<400>gatccgagcaaagatagcaaagcccaagtgagtgccgcggaagccggcattacgggtacgtggtacaaccagctgggcagcaccttcattgttacggcgggtgccgatggtgccctcaccggtacgtacgaaagcgcggttggcaatgccgaaagccgttacgtgctgaccggtcgttatgatagtgcgccagcgaccgatggtagtggtaccgcgctgggttggaccgttgcgtggaagaacaactaccgcaatgcccatagcgccacgacgtggagcggtcagtacgttggcggtgccgaagcccgtatcaatacgcagtggctgctgaccagcggtacgaccgaagcgaatgcgtggaaaagtacgctggtgggccacgatacgttcaccaaggtgaagccaagcgccgcgagcatcgatgcggccaaaaaagccggcgtgaataatggcaaccctctagacgctgttcagcaataa<210>8<211>30<212>dna<213>连接序列的核苷酸序列<400>ggcggtggtggcagtggtggtggtggtagc<210>9<211>26<212>dna<213>上游引物<400>atggcctcctccgagaacgtcatcac<210>10<211>25<212>dna<213>下游引物<400>agactactatcttgggtaaccgtgg当前第1页12