基于MECP2基因的非治疗目的的将病毒注入动物特定脑区进行基因编辑的方法与流程

本发明属于非人灵长类动物的转基因技术及建模领域，具体涉及一种基于mecp2基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑从而构建非人灵长类动物asd疾病模型的方法。

背景技术：

孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd)其特征是患者出现类似自闭症的行为、运动控制能力的丧失、呼吸不规律以及骨骼问题。罹患asd类疾病的少年儿童无法参与正常的被教育过程，从而对其成年后正常融入社会并发挥社会功能产生巨大影响。目前对asd类疾病尚没有任何有效的治疗方法，因此asd对家庭幸福、社会和谐发展都有严重的负面影响，目前已经得到社会各界的广泛重视。

近年来ads患病率不断攀升已然成为危害青少年精神健康的首位疾病。国内asd患病率尚待公布，但是即使患病率小于百分之一，中国的asd患者也将逾数百万。当前asd的发病机制并不完全清楚，但已有充分的证据表明，遗传因素是该病的重要风险因子：已有asd患儿的家庭，新生儿的asd发病风险较其他普通的家庭高出10倍，同卵双胞胎的共患病率高达70％-90％。此外多种单基因遗传病的患者也表现出asd的核心症状，提示遗传突变会导致asd核心症状的出现。既然asd是一种高度遗传的疾病，那么利用易感基因构建疾病模型对于探究该病的发病机制显得尤为重要。

目前，仅有少数针对于猕猴的胚胎asd猕猴模型，但是(1)猕猴的个体间遗传背景差异大，加之胚胎转基因技术嵌合体问题无法解决，因此这些基于胚胎转基因的猕猴目前还很难帮助我们去观察和研究asd的病因及发病机制。(2)而猕猴自然性成熟时间是5-6年，妊娠期需要6个月，属单胎生殖动物，因此利用转基因猕猴交配得到纯合子的基因操作猴现阶段还很难实现。(3)基于胚胎转基因技术的转基因猴死亡率高、成功率低、转入基因保留的稳定性差、发病时间极长，目前很难建立稳定的转基因猴模型。即使建立成功，此种猴的模型很难大量繁殖且维护成本极高而难于满足现阶段迫切的研究需求。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于mecp2基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法。

本发明所采用的技术方案：一种基于mecp2基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，用微量注射器将病毒直接注射入非人灵长类动物的特定脑区中；注射量为每1m³注射病毒1ul，注射病毒的滴度为10*10¹³vg/ml。

进一步地，上述非人灵长类动物为猕猴或食蟹猴；所述非人灵长类动物的特定脑区域为海马脑区。所述可表达靶向猕猴mecp2基因的sgrna如序列表中所示。

进一步地，上述病毒以600～800nl/min的速度进行注射，注射后留针10～15min。所述病毒为腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)。

进一步地，上述微量注射器放置在立体定位仪的注射泵上，在mri的定位指导下利用多点阵列注射法进行注射。

本发明具有以下显著特点：有效避免猕猴个体间的遗传差异和胚胎转基因技术嵌合体问题，以及传统胚胎转基因技术的死亡率高、成功率低、转入基因保留的稳定性差，成模时间长等不足。直接将外源基因注入非人灵长类动物的特定脑区域，可以短时间内获得转基因猴模型，解决现阶段迫切的asd(孤独症谱系障碍)疾病研究需求。

附图说明

图1是本发明实施例所述基于mecp2基因的非治疗目的的将病毒注入非人灵长类动物特定脑区的注射原理示意图。

图2是本发明实施例中mecp2基因编辑方法的原理示意图。

具体实施方式

目前，针对于该疾病的动物模型注射要集中在以小鼠为主的啮齿类动物上，啮齿类与人类亲缘关系较远，缺乏相应发达的大脑皮层，社会行为简单，其大脑发育过程与人类也相差甚远。(johnson,wangetal.2015)，而非人灵长类，尤其是猕猴，与人类的基因相似度更是高达93.5％，与人类在生理结构、发育过程、大脑功能和行为表现上非常相近。更重要的是，猕猴是一种天然群居社交型动物，对于研究asd等具有典型社交障碍的疾病相比其他动物具有明显优势。

因此，本发明的实施例提出一种直接将病毒注入非人灵长类动物特定脑区进行基因编辑的方法，以下以猕猴为例进行说明。

如图1、2所示，本实施例采用直接向猕猴的特定脑区域注射腺相关病毒(aav)，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除注射脑区猕猴的mecp2基因，构建出能模拟asd核心症状的转基因猕猴。具体操作步骤：

(1)在病毒注射前，在猕猴生活的猴群中利用actical体动记录仪，以及录像分析的方法对猕猴进行社交行为采集，包括：自主活动、反应运动、环境探索、社会交往、刻板行为、冲突行为以及睡眠节律等。取得猕猴病毒注射前在猴群中的社交行为基线，再结合单笼脑认知功能测试，如：入侵者测试(hit)，brinkmanboardtest、socialreward、gazecommunication等范式，进一步的对猕猴各项行为学指标及脑功能进行采集。

(2)利用mri(核磁共振成像)深部脑结构精确定位技术，定位注射的特定脑区域，本实施例中为海马脑区。在mri的定位指导下，利用多点阵列注射法将病毒精确地注射入猕猴的特定脑区域中。

具体地，在本实施例所述转基因时的方法：首先麻醉猕猴，逐层打开头皮及头皮表组织，在定位处颅骨钻孔；然后采用微量注射器抽取病毒，放置在立体定位仪的注射泵上，以600～800nl/min的速度进行注射(优选800nl/min的注射速度)，注射后留针10～15min(分钟)，注射量为每1m³注射病毒1ul，注射病毒的滴度在10*10¹³vg/ml。所述转基因用的病毒载体为aav(腺相关病毒)。

(3)注射病毒后，对猕猴重新进行行为学采集及分析，通过与之前采集的基础行为对比，同时与空载病毒注射对照组猕猴进行比较，观察猕猴在转基因前后出现了哪些行为学上的改变，是否有asd疾病的症状出现。在取得行为学数据之后，处死部分猕猴进行海马及周边脑区组织学及基因突变的检测，并利用组化和电镜关注猕猴突触的改变。

另外，本发明的实施例中，所述非人灵长类动物也可以选择食蟹猴，所述方法为crispr/cas9技术敲除mecp2基因，所述动物模型为人类孤独症谱系障碍的转基因非人灵长类模型。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。