技术特征：
1.一种包含至少两种不同的核酸载体的组合物，其中：所述至少两种不同的腺相关病毒(aav)载体中的每一种都包含编码序列，所述编码序列编码支持细胞靶蛋白的不同部分，所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分中的每一个的氨基酸序列可以任选地与所述编码的部分中的不同的一个部分的氨基酸序列部分地重叠；所述至少两种不同的载体中单一载体均不编码全长支持细胞靶蛋白；所述编码序列中的至少一个包含跨越支持细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述两个相邻外显子之间缺少内含子序列；以及所述至少两种不同的载体，当被引入到灵长类动物细胞中时，经历彼此串联或同源重组，从而形成编码全长支持细胞靶蛋白的重组核酸。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述编码的部分之一的氨基酸序列与所述编码的部分中的不同的一个部分的氨基酸序列重叠。3.如权利要求2所述的组合物，其中所述编码的部分中的每一个的氨基酸序列与不同的编码的部分的氨基酸序列部分地重叠。4.如权利要求2所述的组合物，其中所述重叠氨基酸序列的长度为30个氨基酸残基至约390个氨基酸残基。5.如权利要求1
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4中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种包含内含子的不同区段，其中所述内含子包含存在于支持细胞靶基因组dna中的内含子的核苷酸序列，并且其中所述两个不同的区段在序列上重叠至少100个核苷酸。6.如权利要求5所述的组合物，其中所述两个不同的区段在序列上重叠约30个核苷酸至约390个核苷酸。7.如权利要求1
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6中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种的核苷酸序列的长度为约30个核苷酸至约390个核苷酸。8.如权利要求7中所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种的核苷酸序列的长度为30个核苷酸至340个核苷酸。9.如权利要求1
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8中任一项所述的组合物，其中所述组合物中不同载体的数目为2。10.如权利要求9所述的组合物，其中所述两种不同的载体中的第一载体包含编码所述支持细胞靶蛋白的n末端部分的编码序列。11.如权利要求10所述的组合物，其中所述支持细胞靶蛋白的n
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末端部分的长度为约30个氨基酸至约390个氨基酸。12.如权利要求11所述的组合物，其中所述支持细胞靶蛋白的n
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末端部分的长度为约30个氨基酸至约340个氨基酸。13.如权利要求10
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12中任一项所述的组合物，其中所述第一载体还包含启动子和kozak序列之一者或两者。14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一载体包含启动子，所述启动子为诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。15.如权利要求10
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14中任一项所述的组合物，其中所述两种不同的载体中的第二载体包含编码所述支持细胞靶蛋白的c末端部分的编码序列。16.如权利要求15所述的组合物，其中所述支持细胞靶蛋白的c
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末端部分的长度为约
30个氨基酸至约390个氨基酸。17.如权利要求16所述的组合物，其中所述支持细胞靶蛋白的c
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末端部分的长度为约30个氨基酸至约340个氨基酸。18.如权利要求15
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17中任一项所述的组合物，其中所述第二载体还包含poly(da)序列。19.一种包含两种不同的核酸载体的组合物，其中：所述两种不同的核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子3’的编码支持细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列和位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列；以及所述两种不同的核酸载体中的第二核酸载体包含剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3'末端的编码支持细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多聚腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分的氨基酸序列不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长支持细胞靶蛋白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号序列与另一个转录物上的所述剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长支持细胞靶蛋白的重组rna分子。20.如权利要求19所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越支持细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述相邻外显子之间缺乏内含子序列。21.一种组合物，其包含：第一核酸载体，其包含启动子、位于所述启动子的3'的编码支持细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列，和位于所述剪接供体信号序列的3’的第一可检测标记基因；以及第二核酸载体，其与所述第一核酸载体不同，包含第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3’末端的编码支持细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分的各自的氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长支持细胞靶蛋白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号序列与另一个转录物上的所述剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长支持细胞靶蛋白的重组rna分子。22.如权利要求21所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越支持细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述相邻外显子之间缺乏内含子序列。23.如权利要求21所述的组合物，其中所述第一可检测标记基因或所述第二可检测标记基因是碱性磷酸酶。24.如权利要求21或23所述的组合物，其中所述第一可检测标记基因和所述第二可检
测标记基因是相同的。25.一种组合物，其包含：第一核酸载体，其包含启动子、位于所述启动子的3’的编码支持细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列的3’的f1噬菌体重组发生区；和第二核酸载体，其与所述第一核酸载体不同，包含第二f1噬菌体重组发生区、位于所述第二f1噬菌体重组发生区的3’的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3’末端的编码支持细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多聚腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分中的各自的氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长支持细胞靶蛋白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号与另一个转录物上的所述剪接受体信号之间发生剪接，从而形成编码全长支持细胞靶蛋白的重组rna分子。26.如权利要求25所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越支持细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述两个相邻外显子之间缺乏内含子序列。27.一种包含单一腺相关病毒(aav)载体的组合物，其中所述单一aav载体包含编码支持细胞靶蛋白的核酸序列；以及当被引入到灵长类动物细胞中时，在支持细胞靶基因的基因座处产生编码全长支持细胞靶蛋白的核酸，并且所述灵长类动物表达所述支持细胞靶蛋白。28.如权利要求1
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27中任一项所述的组合物，其中所述支持细胞靶基因是缝隙连接蛋白β2(gjb2)。29.如权利要求1
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27中任一项所述的组合物，其中所述支持细胞靶基因是溶质运载蛋白家族26成员4(slc26a4)。30.一种包含至少两种不同的核酸载体的组合物，其中：所述至少两种不同腺相关病毒(aav)载体中的每一种都包含编码毛细胞靶蛋白的不同部分的编码序列，所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分中的每一个的氨基酸序列可以任选地与所述编码的部分中的不同的一个部分的氨基酸序列部分地重叠；所述至少两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长毛细胞靶蛋白；所述编码序列中的至少一个包含跨越所述毛细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述两个相邻外显子之间缺乏内含子序列；以及所述至少两种不同的载体当被引入所述灵长类动物细胞时，经历彼此串联或同源重组，从而形成编码全长毛细胞靶蛋白的重组核酸。31.如权利要求30所述的组合物，其中所述编码的部分中的一个的氨基酸序列与所述编码的部分中的不同的一个部分的氨基酸序列重叠。32.如权利要求31所述的组合物，其中所述编码的部分中的每一个的氨基酸序列与不同的编码的部分的氨基酸序列部分地重叠。
33.如权利要求31所述的组合物，其中所述重叠的氨基酸序列的长度为30个氨基酸残基至约390个氨基酸残基。34.如权利要求30
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33中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种包含内含子的不同区段，其中所述内含子包含存在于毛细胞靶基因组dna中的内含子的核苷酸序列，并且其中所述两个不同区段在序列上重叠至少100个核苷酸。35.如权利要求34所述的组合物，其中所述两个不同的区段在序列上重叠约30个核苷酸至约390个核苷酸。36.如权利要求30
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35中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种的核苷酸序列的长度为约30个核苷酸至约390个核苷酸。37.如权利要求36所述的组合物，其中所述至少两种不同的载体中的每一种的核苷酸序列的长度为30个核苷酸至340个核苷酸。38.如权利要求30
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37中任一项所述的组合物，其中所述组合物中不同载体的数量为2。39.如权利要求38所述的组合物，其中所述两种不同的载体中的第一载体包含编码所述毛细胞靶蛋白的n末端部分的编码序列。40.如权利要求39所述的组合物，其中所述毛细胞靶蛋白的n末端部分的长度为约30个氨基酸至约390个氨基酸。41.如权利要求40所述的组合物，其中所述毛细胞靶蛋白的n末端部分的长度为约30个氨基酸至约340个氨基酸。42.如权利要求39
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41中任一项所述的组合物，其中所述第一载体还包含启动子和kozak序列之一者或两者。43.如权利要求42所述的组合物，其中所述第一载体包含启动子，所述启动子为诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。44.如权利要求39
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41中任一项所述的组合物，其中所述两种不同的载体中的所述第二载体包含编码所述毛细胞靶蛋白的c末端部分的编码序列。45.如权利要求44所述的组合物，其中所述毛细胞靶蛋白的c末端部分的长度为30个氨基酸至约390个氨基酸。46.如权利要求45所述的组合物，其中所述毛细胞靶蛋白的c末端部分的长度为30个氨基酸至约340个氨基酸。47.如权利要求44
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46中任一项所述的组合物，其中所述第二载体还包含poly(da)序列。48.一种包含两种不同的核酸载体的组合物，其中：所述两种不同的核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码毛细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列和位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列；以及所述两种不同的核酸载体中的第二核酸载体包含剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3’末端的编码毛细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分的氨基酸序列不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长毛细胞靶蛋
白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号序列与另一个转录物上的所述剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长毛细胞靶蛋白的重组rna分子。49.如权利要求48所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越毛细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述相邻外显子之间缺乏内含子序列。50.一种组合物，其包含：第一核酸载体，其包含启动子、位于所述启动子的3’的编码毛细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列的3’的第一可检测标记基因；和第二核酸载体，其与所述第一核酸载体不同，包含第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3’末端的编码毛细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分的各自的氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长毛细胞靶蛋白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号序列与另一个转录物上的所述剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长毛细胞靶蛋白的重组rna分子。51.如权利要求50所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越毛细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述相邻外显子之间缺乏内含子序列。52.如权利要求50所述的组合物，其中所述第一可检测标记基因或所述第二可检测标记基因是碱性磷酸酶。53.如权利要求50或52所述的组合物，其中所述第一可检测标记基因和所述第二可检测标记基因是相同的。54.一种组合物，其包含：第一核酸载体，其包含启动子、位于所述启动子的3’的编码毛细胞靶蛋白的n末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列的3’的f1噬菌体重组发生区；和第二核酸载体，其与所述第一核酸载体不同，包含第二f1噬菌体重组发生区、位于所述第二f1噬菌体重组发生区的3’的剪接受体信号序列、位于所述剪接受体信号序列的3’末端的编码毛细胞靶蛋白的c末端部分的第二编码序列和位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列；其中所述编码的部分中的每一个的长度至少为30个氨基酸残基，其中所述编码的部分的各自的氨基酸序列彼此不重叠，其中所述两种不同的载体中单一载体均不编码所述全长毛细胞靶蛋白，并且当所述编码序列在灵长类动物细胞中转录以产生rna转录物时，在一个转录物上的所述剪接供体信号序列与另一个转录物上的所述剪接受体信号序列之间发生剪接，从而形成编码全长毛细胞靶蛋白的重组rna分子。55.如权利要求54所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一个包含跨越毛细胞靶基因组dna的两个相邻外显子的核苷酸序列，并且在所述两个相邻外显子之间缺乏内含子
序列。56.如权利要求30
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55中任一项所述的组合物，其中所述毛细胞靶基因是otof基因、triobp基因或strc基因。57.一种包含单一腺相关病毒(aav)载体的组合物，其中所述单一aav载体包含编码毛细胞靶蛋白的核酸序列；以及当被引入到灵长类动物细胞时，在所述毛细胞靶基因的基因座处产生编码全长毛细胞靶蛋白的核酸，并且所述灵长类动物表达所述毛细胞靶蛋白。58.如权利要求57所述的组合物，其中所述毛细胞靶基因是pjvk基因、otof基因、ndp基因、clrn1基因、triobp基因、strc基因、tmc1基因、vegf基因或hspa1a基因。59.如权利要求1
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58中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。60.一种试剂盒，其包含权利要求1
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59中任一项所述的组合物。61.如权利要求60所述的试剂盒，所述试剂盒还包括包含所述组合物的预装式注射器。62.一种校正灵长类动物内耳的支持细胞中的支持细胞靶基因缺陷的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1
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29中任一项所述的组合物，其中所述施用修复所述灵长类动物内耳的支持细胞中的支持细胞靶基因缺陷。63.一种升高灵长类动物内耳的支持细胞中的支持细胞靶蛋白的表达水平的方法，所述方法包括向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述施用使得所述灵长类动物内耳的所述支持细胞中的所述支持细胞靶蛋白的表达水平升高。64.如权利要求63所述的方法，其中所述灵长类动物先前已被确定具有缺陷型支持细胞靶基因。65.一种治疗被鉴定为具有缺陷型支持细胞靶基因的灵长类动物的非综合征性感音神经性听力损失的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1
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29中任一项所述的组合物。66.如权利要求65所述的方法，所述方法还包括在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型支持细胞靶基因。67.一种恢复被鉴定或诊断为患有听力损失的灵长类动物的听力的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1
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29中任一项所述的组合物。68.如权利要求67所述的方法，所述方法还包括在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型支持细胞靶基因。69.一种恢复被鉴定或诊断为患有内耳病症的灵长类动物的突触并且/或者保留其螺旋神经节神经的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1
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29中任一项所述的组合物。70.如权利要求69所述的方法，所述方法还包括在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型支持细胞靶基因。
71.一种方法，所述方法包括向灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求1
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29中任一项所述的组合物。72.如权利要求71所述的方法，其中所述灵长类动物先前已被鉴定为具有缺陷型支持细胞靶基因。73.一种校正灵长类动物内耳的毛细胞中的毛细胞靶基因缺陷的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物，其中所述施用修复所述灵长类动物内耳的毛细胞中的所述毛细胞靶基因缺陷。74.一种升高灵长类动物内耳的毛细胞中的毛细胞靶蛋白的表达水平的方法，所述方法包括向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物，其中所述施用使得所述灵长类动物内耳的毛细胞中的所述毛细胞靶蛋白的表达水平升高。75.如权利要求74所述的方法，其中所述灵长类动物先前已被确定具有缺陷型毛细胞靶基因。76.一种治疗被鉴定为具有缺陷型毛细胞靶基因的灵长类动物的非综合征性感音神经性听力损失的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物。77.如权利要求76所述的方法，所述方法还包括在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型毛细胞靶基因。78.一种恢复被鉴定或诊断为患有听力损失的灵长类动物的听力的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物。79.如权利要求78所述的方法，所述方法还包括，在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型毛细胞靶基因。80.一种恢复被鉴定或诊断为患有内耳病症的灵长类动物的突触并且/或者保留其螺旋神经节神经的方法，所述方法包括：向所述灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物。81.如权利要求80所述的方法，所述方法还包括，在所述施用步骤之前，确定所述灵长类动物具有缺陷型毛细胞靶基因。82.一种方法，所述方法包括向灵长类动物的内耳施用治疗有效量的权利要求30
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59中任一项所述的组合物。83.如权利要求82所述的方法，其中所述灵长类动物先前已被鉴定为具有缺陷型毛细胞靶基因。84.如权利要求1
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26或30
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56中任一项所述的组合物，其中所述第二核酸载体还包含去稳定序列。85.如权利要求84所述的组合物，其中所述第二核酸载体还包含fkbp12去稳定序列。86.如权利要求27
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29或57
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59中任一项所述的组合物，其中所述核酸载体还包含去稳定序列。87.如权利要求86所述的组合物，其中所述核酸载体包含fkbp12去稳定序列。
技术总结
本文提供了包含至少两种不同的核酸载体的组合物，所述至少两种不同的载体，当被引入到灵长类动物细胞中时，经历彼此串联或同源重组，从而形成编码全长靶蛋白(例如，支持细胞靶蛋白或毛细胞靶蛋白)的重组核酸。还提供了包含单一AAV载体的组合物，所述单一AAV载体，当被引入到灵长类动物细胞中时，在支持细胞靶基因的基因座处产生了编码全长靶蛋白(例如，支持细胞靶蛋白或毛细胞靶蛋白)的核酸，并且所述灵长类动物表达靶蛋白(例如，支持细胞靶蛋白或毛细胞靶蛋白)。白或毛细胞靶蛋白)。白或毛细胞靶蛋白)。
技术研发人员：E.J.西蒙斯 R.恩格 D.伦兹 M.瓦莱罗
受保护的技术使用者：阿库斯股份有限公司
技术研发日：2019.11.07
技术公布日：2021/12/27