1.基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定点突变引物设计
设计两对引物，其中一对为突变引物即mpf和mpr，这对引物的5'端互补序列长度为12-15bp，互补区可以任意引入单点或多点突变，任意长度的缺失突变，插入突变1-20bp；另一对引物是协助pcr的引物，由于这一对引物的位置可以设置在已知序列区内，是可变动的，可以在突变位点的前面或后面设置，称之为pcr可变引物pcrvf和pcrvr；
(2)聚合酶链式反应设置和产物纯化
(i)以0.5-1ngdna为模板，用phantamax超保真dna聚合酶分别设立两个不同的pcr反应；
(ii)pcr热循环；
(iii)利用axygen胶回收试剂盒按照试剂盒说明书回收纯化以上两种pcr产物，利用琼脂糖凝胶电泳对回收产物进行鉴定；
(3)重组酶连接反应
将上述步骤(2)中子步骤(iii)中纯化的dna按照等摩尔数混合，利用重组酶exnaseii完成连接反应；
(4)转化，质粒提取和测序分析。
2.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法，其特征在于，步骤(2)中子步骤(i)两个不同的pcr反应的体系如下：
pcr反应体系i包括：dna模板0.5ng或稀释的dna1μl，引物mpf和引物pcrvr各0.5μl，含phantamax超保真dna聚合酶反应混合物(2x)20μl，双蒸水18.5μl，共40μl；
pcr反应体系ii包括：dna模板0.5ng或稀释的dna1μl，引物pcrvf和引物mpr各0.5μl，含phantamax超保真dna聚合酶反应混合物(2x)20μl，双蒸水18.5μl，共40μl。
3.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法，其特征在于，步骤(2)中的子步骤(ii)pcr热循环为：(1)95℃3分钟；(2)95℃1分钟，55℃15秒，72℃1-10分钟，取决于pcrdna产物长度，1kb/30秒，35个循环；(3)72℃5分钟。
4.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法，其特征在于，步骤(3)所述的连接反应，为20μl反应体系：pcr产物ixμl，pcr产物iiyμl，5x连接酶缓冲液，exnaseii1μl，加ddh2o至20μl。
5.根据权利要求1所述的基于重组酶和超保真dna聚合酶的大载体dna的定点突变方法，其特征在于，步骤(4)转化，质粒提取和测序分析，具体步骤为：
(i)转化：取细菌感受态细胞30μl置于冰上，加入步骤(3)中的连接产物3μl，冰浴45min；冰浴完成后于42℃水浴锅中热激60sec，置冰上冰浴2min后加入200μlsoc溶液，转至37℃摇床上振荡1h；将转化连接产物的感受态细胞均匀涂在含抗生素的lb固体培养基上并置于37℃恒温箱培养14-16h；
(ii)质粒提取：用接菌环从lb培养皿中挑取单菌落接种于3mllb液体培养基中，转至37℃摇床振荡培养过夜或16h；菌液转入离心管中和在12000rpm速度下离心，收集菌体；利用axygen质粒提取试剂盒按照试剂盒说明书提取质粒；取3μl质粒完成琼脂糖凝胶电泳分析；
(iii)测序分析：取1微克质粒，送测序公司完成dna测序，分析定突变位置的序列是否突变；若每个突变反应完成多个质粒的提取和测序分析，则可分析出此方法完成的每个突变反应的突变效率。