SF3B1基因突变在混合性PRL阳性垂体腺瘤辅助诊断中的应用的制作方法

sf3b1基因突变在混合性prl阳性垂体腺瘤辅助诊断中的应用
技术领域
1.本发明涉及垂体腺瘤辅助诊断领域，尤其涉及在混合性prl阳性垂体腺瘤辅助诊断及分型产品中的应用。


背景技术：

2.垂体瘤是最常见的颅内肿瘤之一，约占颅内肿瘤的10-15％，人群发病率约为8-9/万。随着影像技术的发展，其检出率呈现逐年增高的趋势。垂体瘤根据不同的内分泌特性，可分为泌乳素型、生长激素型、促肾上腺皮质激素型、促甲状腺素型、无功能型以及混合型等若干亚型。肿瘤通过异常分泌各种激素，导致患者出现不孕不育、肢端肥大、cushing综合征、甲亢等显著的内分泌紊乱症状。
3.多激素垂体腺瘤(plurihomonal pituitary adenomas(ppas))是病理检查表现为泌乳素(prl)、生长激素(gh)、促甲状腺激素(tsh)、卵泡刺激素(fsh)/黄体生成素(lh)或促肾上腺皮质激素(acth)等不同激素免疫组化染色阳性类型的组合，临床可表现为垂体功能异常以及肿瘤压迫症状，包括头痛、视力、视野障碍等，其中prl和acth混合型细胞腺瘤是最常见的多激素和双激素腺瘤，prl、gh和tsh免疫组化染色阳性归类为pit-1阳性的多激素垂体腺瘤。对于临床上诊断无功能腺瘤的患者，若出现压迫症状，手术治疗为首选治疗方案。
4.prl/gh混合性腺瘤是prl和gh染色阳性的混合型垂体腺瘤，包括prl-gh细胞腺瘤和prl-gh混合性细胞腺瘤，临床表现为血清gh和igf-1的高水平和肢端肥大症或巨人症的体征和症状，部分患者可有停经、泌乳、性欲减退等高泌乳素血症的症状和体征。该两种垂体腺瘤免疫组化染色均表现为prl阳性和gh阳性，其中prl-gh细胞腺瘤为同一细胞可见prl和gh两种激素染色阳性；prl-gh混合性细胞腺瘤为分泌不同激素的细胞混合，即分泌prl细胞和分泌gh细胞的混合。肢端肥大症的首选治疗方案是手术治疗，可以应用生长抑素类药物包括奥曲肽，兰瑞肽。
5.混合性prl阳性垂体腺瘤为激素免疫组化染色包含prl染色阳性的两种或两种以上激素染色阳性的垂体腺瘤的统称，其激素染色除prl染色阳性外，还具有选自以下至少一种激素染色阳性：gh、tsh、fsh、lh和acth。混合性prl阳性垂体腺瘤包括prl阳性多激素垂体腺瘤、prl-gh细胞腺瘤和prl-gh混合性细胞腺瘤等。该类型中的部分肿瘤表现为体积巨大，同时向周边侵袭性生长，手术中极难获得肿瘤全切除，并且该部分患者预后较差，推测他们可能分属于混合性prl阳性垂体腺瘤两种不同的亚型，对其应该采取不同的临床治疗策略。目前尚无特异性的分子诊断标记物可以对他们进行诊断，甚至鉴别诊断。
6.作为rna加工过程的关键步骤，rna剪接的精确性是基因得以正常表达的先决条件之一，rna剪接异常导致的基因表达紊乱是多种疾病发生的重要原因。近年来，高通量测序技术检测发现各类肿瘤细胞中存在多种剪接因子突变，这些突变均不同程度地影响了rna剪接，导致下游基因表达异常。
7.剪接因子sf3b是一种多蛋白复合物，包括亚基，例如sf3b1、sf3b3和phf5a。sf3b复合体是u2 snrna、剪接因子sf3a和sf3b以及其他相关蛋白组装而成的u2 snrna-蛋白质复
合体(snrnp)的一部分。它们一起形成17s u2 snrnp，其以atp依赖性方式在内含子的3'侧组装形成a复合物。sf3b核心复合体包含几个剪接体相关蛋白(sap)，包括sf3b1/sap155、sf3b2/sap145、sf3b3/sap130、sf3b4/sap49、sf3b5/sap10、sf3b6/sap14a和phf5a/sap14b。
8.研究表明，诸如sf3b1、u2af1和srsf2之类的剪接因子牵涉到包括慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征在内的血液系统恶性肿瘤以及乳腺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌和葡萄膜黑色素瘤。中国专利申请cn107405383a公开了在骨髓增生异常综合征(mds)和癌症两者中确认的sf3b1突变包括例如r625h。
9.然而，目前还没有将剪接因子亚基sf3b1突变应用于垂体腺瘤，特别是混合性prl阳性垂体腺瘤诊断的报道。基于现有技术中诊断上述疾病的手段的局限性，若能筛选出其易感的sf3b1突变作为分子诊断标记物，从而找到一种有效、廉价的能够在辅助诊断垂体腺瘤，特别是对于混合性prl阳性垂体腺瘤的有效的治疗方法是亟待解决的问题。


技术实现要素：

10.为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于筛选出垂体腺瘤，特别是混合性prl阳性垂体腺瘤易感的sf3b1突变作为分子诊断标记物，并研制相应的诊断试剂盒，进行垂体腺瘤检测，从而使得垂体腺瘤诊断更加方便易行，使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，同时该方法也适用于垂体腺瘤，特别是混合性prl阳性垂体腺瘤的肿瘤分型、恶性程度评价以及为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供一种简单而有效的辅助手段，开辟新的途径。
11.具体来说，本发明提出了如下技术方案：
12.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1基因c.1874g>a突变的产品在制备用于辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途。
13.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1蛋白r625h突变的产品在制备用于辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途。
14.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1基因c.1874g>a突变的引物。
15.在一方面，本发明提供了一种辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂盒。
16.下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：
附图说明
17.图1示出了探针检测的特异性。
18.图2示出了探针检测的灵敏度。
19.图3示出了cck-8活性检测感染sf3b1突变型腺病毒的细胞的增殖能力。
20.图4示出了克隆形成试验检测感染sf3b1突变型腺病毒的细胞的增殖能力。
21.图5示出了感染sf3b1突变型腺病毒的细胞的细胞凋亡能力。
具体实施方式
22.除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文中所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明实践或测试中，但是描述了优选方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
23.术语“混合性prl阳性垂体腺瘤”是指激素免疫组化染色包含prl染色阳性的两种或两种以上激素染色阳性的垂体腺瘤的统称，其激素染色除prl染色阳性外，还具有选自以下至少一种激素染色阳性：gh、tsh、fsh、lh和acth。混合性prl阳性垂体腺瘤包括prl阳性多激素垂体腺瘤、prl-gh细胞腺瘤和prl-gh混合性细胞腺瘤等。
24.术语“基因”指参与产生多肽链的dna区段；其包括参与基因产物的转录/翻译和所述转录/翻译调节的编码区之前和之后的区域(前导区和尾部区)，以及单个编码区(外显子)之间的插入序列(内含子)。
25.术语“等位基因”是在染色体上占据同一位置的基因或dna非编码区的多种替代形式之一。术语等位基因可用于描述来自任何生物的dna，所述生物包括但不限于细菌、病毒、真菌、原生动物、霉菌、酵母、植物、人、非人、动物和古生菌。
26.术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即，抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
27.术语“sf3b1”是指剪接因子3b1。sf3b1基因位于染色体2q33.1，编码剪接因子3b的亚基1，它是u2小核核糖核蛋白复合体的核心部分。sf3b1对于识别和结合靠近3’剪接位点的分支点序列是必需的，并且在从前mrna中精确切除内含子以形成成熟mrna中发挥重要作用。sf3b1突变可能是肿瘤发生过程中的驱动事件，不仅导致转录偶联中的剪接异常，而且还影响基因组不稳定和干细胞的分化。
28.术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。在本文中，氨基酸可用iupac-iub生物化学命名委员会推荐的通用三字母代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。
29.术语“模板”指能用于本发明所述扩增的任意核酸分子。非天然双链的rna或dna可制成双链dna从而用作双链dna。含有多种不同双链dna分子的任意双链dna或制品可用作模板dna以扩增包含在模板dna内的一个或多个感兴趣基因座。
30.术语“引物”指能用于扩增方法如聚合酶链反应(pcr)的寡核苷酸，所述扩增方法用于根据多核苷酸序列扩增核苷酸序列，所述多核苷酸对应于特定基因组序列。用于扩增多核苷酸序列的至少一种pcr引物对所述序列为序列特异性。
31.术语“探针”是指与另一分子的特异性序列或子序列或其他部分结合的分子。除非另有说明，否则术语“探针”通常是指通过互补碱基配对与另一种多核苷酸(通常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以结合与探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸，
这取决于杂交条件的严格性。探针可以被直接或间接标记。
32.术语“扩增反应”指用于一次或多次拷贝核酸的过程。在实施方式中，所述扩增方法包括但不限于：聚合酶链反应，自持序列反应，连接酶链反应，cdna末端快速扩增，聚合酶链反应和连接酶链反应，q-β噬菌体扩增，链置换扩增，或重叠延伸拼接聚合酶链反应。在一些实施方式中，扩增单分子核酸，例如，通过数字pcr。
33.术语“扩增产物”是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
34.术语“野生型”是指一种基因或基因产物，当从天然存在的来源中分离时，它具有基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常见的基因，因此被随意称为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”或“多态的”是指一种基因或基因产物，与野生型基因或基因产物相比，它显示序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。应当指出，天然存在的突变体能够分离；它们的鉴定是根据以下事实：与野生型基因或基因产物相比，其特征发生改变。
35.术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物与泌乳素(prl)型腺瘤有关。这些生物标志物包括(但不限于)生物分子，其包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还包括生物分子的部分或片段，例如，包含至少5个连续的氨基酸残基、至少6个连续的氨基酸残基、至少7个连续的氨基酸残基、至少8个连续的氨基酸残基或更多个连续的氨基酸残基的蛋白质或多肽的肽片段。
36.术语“患者”和“受试者”可互换使用，是指人类或其他哺乳动物的患者和受试者，并且包括使用本发明的方法进行检查或治疗的任何个体。但是，应当理解，“患者”并不意味着存在症状。落入本发明范围内的合适的哺乳动物包括但不限于灵长类动物、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如猫、狗)和圈养的野生动物(例如考拉、熊、野猫、野狗、狼、澳洲野狗、狐狸等)。
37.术语“试剂盒”是指用来递送物质的任何递送系统。在反应测定中，这类递送系统包括将反应试剂(例如适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行测定的说明书等)贮存、从一个位置转运或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包含一个或多个外壳(例如盒子)，其中包含有关的反应试剂和/或支持材料。
38.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1基因c.1874g>a突变的产品在制备用于辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途。
39.在一个优选的技术方案中，所述混合性prl阳性垂体腺瘤为激素染色包括prl阳性以及选自以下至少一个激素染色阳性的垂体腺瘤：gh、tsh、fsh、lh和acth；优选地，所述混合性prl阳性垂体腺瘤选自prl阳性多激素垂体腺瘤或prl和gh染色阳性的混合型垂体腺瘤；优选地，所述prl阳性多激素垂体腺瘤为tsh、prl和acth激素染色阳性的prl阳性多激素垂体腺瘤；优选地，所述prl和gh染色阳性的混合型垂体腺瘤选自prl-gh细胞腺瘤或prl-gh混合性细胞腺瘤。
40.在一个优选的技术方案中，所述产品包括通过pcr技术检测所述sf3b1基因
c.1874g>a突变的试剂。
41.在一个优选的技术方案中，所述产品包括pcr扩增反应试剂混合液、针对sf3b1基因c.1874g>a突变的引物对以及突变型等位基因探针；优选地，所述pcr扩增反应试剂混合液包括taqdna聚合酶、dntp混合液、mgcl2溶液、荧光定量pcr反应缓冲液和去离子水。
42.在一个优选的技术方案中，所述产品还包括野生型等位基因探针。
43.在一个优选的技术方案中，所述pcr为数字pcr或荧光定量pcr(qpcr)。
44.在一个优选的技术方案中，所述探针是taqman mgb探针，更优选地，所述taqman mgb探针的5'末端标记了荧光报告基团，3'末端标记了非荧光淬灭基团mgb；优选地，所述荧光报告基团是fam或hex荧光报告基团。
45.在一个优选的技术方案中，所述sf3b1基因的野生型基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
46.在一个优选的技术方案中，所述引物对中的正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述引物对中的反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
47.在一个优选的技术方案中，所述突变型等位基因探针的核苷酸序列如seq id no:5所示；优选地，所述野生型等位基因探针的核苷酸序列如seq id no:6所示。
48.在一个具体实施方案中，所述突变型等位基因探针的结构如下：
49.hex-5'-atgtccataacacaac-3'-mgb；
50.在一个具体实施方案中，所述野生型等位基因探针的结构如下：
51.fam-5'-agtatgtccgtaacaca-3'-mgb。
52.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1蛋白r625h突变的产品在制备用于辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂或试剂盒中的用途。
53.在一个优选的技术方案中，所述产品包括检测sf3b1蛋白r625h突变的抗体和/或蛋白质芯片；优选地，所述sf3b1蛋白的野生型蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
54.在一个具体实施方案中，sf3b1基因的sf3b1 c.1874g>a突变导致该基因编码的野生型sf3b1蛋白第625位氨基酸由精氨酸(r)突变为组氨酸(h)，即发生r625h突变。
55.在一方面，本发明提供了一种检测sf3b1基因c.1874g>a突变的引物，其包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述引物对中的反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
56.在一方面，本发明提供了一种辅助诊断混合性prl阳性垂体腺瘤、区分混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1突变型和野生型、或预测混合性prl阳性垂体腺瘤是否恶性的试剂盒，所述试剂盒包含针对sf3b1基因c.1874g>a突变的引物对以及突变型等位基因探针，和/或所述试剂盒包含检测sf3b1蛋白r625h突变的抗体和/或蛋白质芯片。
57.在一个优选的技术方案中，所述试剂盒还包含pcr扩增反应试剂混合液；优选地，所述pcr扩增反应试剂混合液包括taqdna聚合酶、dntp混合液、mgcl2溶液、荧光定量pcr反应缓冲液和去离子水。
58.在一个优选的技术方案中，所述试剂盒还包括野生型等位基因探针。
59.在一个优选的技术方案中，所述试剂盒中的所述探针是taqman mgb探针，更优选地，所述taqman mgb探针的5'末端标记了荧光报告基团，3'末端标记了非荧光淬灭基团
biosystems公司)，其具体结构如下：
79.突变型等位基因探针：hex-5'-atgtccataacacaac-3'-mgb(seq id no:5)。
80.野生型等位基因探针标记有6-羧荧光素(fam)荧光标记(购自北京擎科生物科技有限公司)，其具体结构如下：
81.野生型等位基因探针：fam-5'-agtatgtccgtaacaca-3'-mgb(seq id no:6)。
82.探针特异性检测：
83.根据sf3b1 c.1874g>a设计针对野生型等位基因探针的野生型模板作为阳性对照(其核苷酸序列如seq id no:7，tsingke biological technology)，以水作为阴性对照，检测结果如图1a所示。图1a示出了野生型探针的特异性。
84.根据sf3b1 c.1874g>a设计了针对突变型等位基因探针的突变型模板作为阳性对照(其核苷酸序列如seq id no:8，tsingke biological technology)，以水作为阴性对照，检测结果如图1b所示。图1b示出了突变型探针的特异性。
85.探针灵敏度检测：
86.以突变样本为模板，进行倍比稀释其dna浓度，分别为30ng/μl、15ng/μl、7.5ng/μl、3.75ng/μl、1.875ng/μl。进行数字pcr扩增并检测，发现荧光数量随着模板样本浓度的降低而减少(图2)。图2示出了探针的灵敏度。
87.实施例2混合性prl阳性垂体腺瘤sf3b1 c.1874g>a突变的检测
88.收集医院神经外科经垂体腺瘤根治术的手术标本，且每位患者签署知情同意书。此项研究已获伦理委员会批准。
89.混合性prl阳性垂体腺瘤入组标准如下：
90.1、prl阳性多激素垂体腺瘤(plurihomonal pituitary adenomas(ppas))入组标准：
91.(1)垂体功能异常表现以及肿瘤占位效应，包括性功能减退、闭经、甲减、头痛、视力障碍等；
92.(2)病理诊断为垂体腺瘤，激素免疫组化染色为prl阳性以及其他激素gh、tsh、fsh/lh和acth等不同类型的组合。
93.(3)头颅mri/ct显示鞍区病变。
94.2、prl-gh细胞腺瘤/prl-gh混合性细胞腺瘤
95.(1)血清人生长激素(hgh)大于正常、葡糖糖抑制试验阳性或者血清胰岛素样生长因子-1(igf-1)高于同年龄、同性别的正常人均值2个标准差以上；
96.(2)与肢端肥大症相关的表现以及部分与高泌乳素血症相关临床症状以及肿瘤占位效应，包括停经、泌乳、不孕、性功能减退、头痛、视力障碍等。
97.(3)病理诊断为垂体腺瘤，免疫组化显示为prl阳性和gh阳性；
98.(4)头颅mri/ct显示鞍区病变。
99.本实施例共检测了28例收集的混合性prl阳性垂体腺瘤手术标本的sf3b1基因是否发生突变。其中，用实施例1设计的引物和taqman-mgb探针对病例组检测样本进行sf3b1c.1874g>a突变的检测，同时以对照组检测样本为对照，具体方法如下：
100.步骤1：待测样本基因组dna的提取
101.使用allprep dna/rna mini kit(80204,qiagen)提取样本中的基因组dna。使用
generead dna ffpe kit(180134,qiagen)从福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织中提取基因组dna。
102.步骤2：pcr扩增
103.以步骤1提取的dna为模板，在实施例1设计的引物和taqman-mgb探针的引导下，进行扩增反应，并通过ep1
tm
数字芯片(fluidigm)ddpcr系统对sf3b1的突变体进行检测。
104.在实验中使用了两个不同的芯片。
105.1)12.765芯片(bmk-m10-12.765，fluidigm)
106.反应体系为8μl，该混合物包含：
107.①
dna样品0.8μl，
108.②
20
×
ge sample loading reagent(pn 85000746，fluidigm)0.4μl，
109.③
10μm基因特异性试剂(对突变和野生型sf3b1具有特异性的引物和taqman探针)
110.2.8μl
111.④
gene expression master mix(pn 4369016，life technologies)4μl；
112.2)48.770芯片(dpcr 37k ifc，100-6151，fluidigm)
113.反应体系为4μl，该混合物包括：
114.①
dna样品0.88μl，
115.②
20
×
ge sample loading reagent(pn 85000746，fluidigm)0.4μl，
116.③
20μm基因特异性试剂(对突变和野生型sf3b1具有特异性的引物和taqman探针
117.0.72μl
118.④
gene expression master mix 2μl。
119.将加载的芯片放入ep1 cycler。
120.pcr过程如下：在50℃下120s，在95℃下10分钟，在95℃变性15s并在60℃退火和延伸1分钟(该步40个循环)。
121.步骤3：等位基因鉴别分析
122.对步骤2的扩增产物进行等位基因鉴别分析。若荧光检测通道检测到hex荧光信号，即检测到的是突变型等位基因，根据结果判定是突变；若荧光检测通道检测到fam荧光信号，即检测到的是野生型等位基因，根据结果判定是未突变。
123.使用ep1数据收集和分析软件来处理数据，分析pcr扩增并计算每个面板中hex阳性和fam阳性的数量。使用6-羧基-x-罗丹明(6-carboxy-x-rhodamine(rox))信号作为内部阳性pcr对照；使用双蒸水(dd水)做阴性对照。采用阳性和阴性对照评估了该系统可行性、扩增方案、建立的cq范围和定量阈值。
124.采用来自于sf3b1 c.1874g>a的一个450bp的dna片段(其核苷酸序列如seq id no:7所示)作为阳性对照(tsingke biological technology)。来自对照组的健康个体的dna样本作为阴性对照。为了确定测定的特异性，使用水和健康组织的dna作为阴性对照进行了ddpcr扩增。在没有添加模板的对照实验中，通常没有检测到hex阳性信号。在少部分健康组织对照dna样本中检测到1至2个hex阳性信号。将最小截止频率设置为0.5％(每200个总等位基因1个突变体)，以通过ddpcr检测sf3b1突变阳性的dna样品。对于所有样品，c.1874g>a ddpcr进行了至少3次。
125.在所检测的28例混合性prl阳性垂体腺瘤标本中，10例为prl阳性多激素垂体腺瘤，18例prl/gh混合性腺瘤(包括prl-gh混合性细胞腺瘤和prl-gh细胞腺瘤)，发现具有表1所示的sf3b1 c.1874g>a突变型有2例，sf3b1r625h的突变率约为7.14％(2/28)。
126.表1
127.核苷酸核苷酸替换氨基酸替换外显子1874g
→
ar265h14
128.所述10例prl阳性多激素垂体腺瘤的激素染色情况见表2。
129.表2
130.激素染色阳性病例数prl+acth3prl+fsh2tsh+prl+acth1tsh+gh+prl3tsh+prl1
131.其中，1例患者临床诊断为无功能型，即无激素分泌增多症状。术后肿瘤组织激素免疫组化染色tsh+prl+acth阳性，其他染色阴性。可见，该例多激素垂体腺瘤属于混合性prl阳性垂体腺瘤。在该病例检测到sf3b1
r625h
突变。
132.所述18例prl/gh混合性腺瘤的激素染色情况见表3。
133.表3
134.激素染色阳性病例数prl-gh混合性细胞腺瘤14prl-gh细胞腺瘤4
135.其中，1例患者临床表现为生长激素分泌增多，肢端肥大，面容改变。血清泌乳素>200ng/ml，hgh为16.681ng/m，术后肿瘤组织激素免疫组化染色gh和prl阳性，lh、fsh、tsh、acth阴性，诊断为prl和gh混合型。可见，该例混合型垂体腺瘤属于混合性prl阳性垂体腺瘤。在该病例检测到sf3b1
r625h
突变。
136.综合上述28例垂体腺瘤基因突变检测结果可见，sf3b1
r625h
突变可在混合性prl阳性垂体腺瘤中发生，sf3b1
r625h
的突变率约为7.14％(2/28)。
137.实施例3sf3b1
r625h
突变对混合性prl阳性垂体腺瘤的影响
138.本实施例选取gh3细胞系atcc ccl-82.1(购自美国菌种保藏中心atcc(american typeculture collection))作为实验细胞系，gh3细胞系为大鼠垂体瘤细胞系，该细胞系可以基因表达以及分泌prl、gh，在本实验中作为混合性细胞系进行后续实验。
139.表达sf3b1野生型和突变型(sf3b1 c.1874g>a)的腺病毒的病毒液购自北京百奥川生物科技有限责任公司。
140.将gh3细胞系细胞分为以下三组：
141.(1)sf3b1野生型组：感染sf3b1野生型腺病毒(腺病毒-sf3b1
wt
)的细胞，其是用表达sf3b1野生型腺病毒的病毒液感染gh3细胞所获得的细胞；
142.(2)sf3b1突变型组：感染sf3b1突变型腺病毒(腺病毒-sf3b1
r625h
)的细胞，其是用
表达sf3b1突变型腺病毒的病毒液感染gh3细胞所获得的细胞；
143.(3)对照组：感染腺病毒空载体(腺病毒-空载体)的gh3细胞。
144.本实验分别用30moi的病毒和100moi的病毒感染后观察细胞的增殖活力；其中moi(multiplicity of infection，感染复数)表示每个细胞被多少个有活力病毒所感染。
145.1、cck-8活性检测细胞增殖能力
146.将sf3b1野生型组细胞、sf3b1突变型组细胞和对照组细胞分别以每孔4
×
103的浓度接种到96孔板中，每孔100μl培养基(该培养基成份为：f12k培养基(atcc 30-2004)、终浓度为2.5％的胎牛血清(gibco公司)，终浓度为15％的马血清(gibco公司))。感染细胞培养48h后每个实验孔各加入10μl cck-8试剂(beyotime，c0039)，置于37℃，5％co2培养箱孵育4h。用酶标仪测量od值，吸收波长为450nm。其检测结果如图3所示。实验结果表明，感染sf3b1突变型腺病毒的细胞相比于感染野生型sf3b1腺病毒的细胞以及对照组的细胞增殖能力更强。
147.2、克隆形成试验检测细胞增殖能力
148.将sf3b1野生型组细胞、sf3b1突变型组细胞和对照组细胞分别以1
×
103细胞的单细胞悬液铺板于2ml含10％胎牛血清(fbs)的dmem中。感染细胞培养3周期间，每3天更换一次培养基。然后4％多聚甲醛固定形成的集落中，并在室温下用0.04％结晶紫的pbs溶液染色15分钟。充分洗涤并风干后，用imagej测量集落数。其检测结果如图4所示。实验结果表明，感染sf3b1突变型腺病毒的细胞相比于感染野生型sf3b1腺病毒的细胞以及对照组的细胞集落数更多，即细胞增殖能力更强。
149.3、细胞流式技术检测细胞凋亡情况。
150.用beyotime公司的试剂盒(c1062m)提供的annexin v-fitc/propidium iodide双染色法分析细胞的凋亡。分别收集感染腺病毒后48h的sf3b1野生型组细胞、sf3b1突变型组细胞和对照组细胞并进行分析。离心收集每组约5
×
105个细胞，并重悬500μl结合缓冲液(1
×
annexin v binding buffer)。将5μl膜联蛋白-v-fitc(annexin v-fitc)和5μl碘化丙啶(propidium iodide)加入每个试管中，然后在黑暗中于室温孵育15分钟。通过流式细胞术在fitc和pe通道中分析染色的细胞。其检测结果如图5所示。实验结果表明，感染sf3b1突变型腺病毒的细胞的总凋亡数最低，感染sf3b1突变型腺病毒的细胞相比于感染野生型sf3b1腺病毒的细胞以及对照组的细胞凋亡能力弱。
151.以上实验结果表明，在混合性垂体腺瘤细胞系gh3细胞系中，突变型的sf3b1促进了细胞增殖以及抑制了细胞凋亡。上述细胞实验证实了sf3b1突变后对细胞的促进增殖以及抑制凋亡的作用，提示sf3b1突变型的病例相较于野生型有恶性表现的可能。因此，针对该突变位点研究得到的新的治疗方法以及药物，将对sf3b1突变型的混合性prl阳性垂体腺瘤的治疗具有重大意义。