用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法与流程

文档序号:22179191发布日期:2020-09-11 21:38阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶;还包括其他的建库试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,每一对引物探针组分别包含5’延伸引物和3’阻滞探针;其中,

所述5’延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解,所述5’延伸引物包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续pcr扩增引物序列相对应的第二部分;

所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解,所述3’阻滞探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续pcr扩增引物序列特异性杂交的第二部分;

所述多对引物探针组的序列信息如seqidno:1-98所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸外切酶的修饰为硫代修饰,即所述3’阻滞探针的5'端磷酸化修饰,3'端硫代修饰;所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶;所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。

4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述其他的建库试剂包括:

(1)dna变性液:含有变性剂的缓冲液;

(2)引物探针混合液:用于多对引物探针组溶解在杂交缓冲液;

(3)核酸外切酶缓冲液;

(4)延伸连接缓冲液:为核酸聚合酶和核酸连接酶的pcr反应及连接反应提供反应组分及缓冲环境;

(5)延伸连接酶混合液:用于核酸聚合酶及核酸连接酶配比混合;

(6)pcr缓冲液:为核酸聚合酶提供反应组分及缓冲环境;

(7)taqdna聚合酶;

(8)磁珠悬浮液;

(9)磁珠洗脱液a及磁珠洗脱液b。

5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述dna变性液组分为:0.6875×te,ph8.0,1.25×gcsolution;

所述引物探针混合液组分为:0.003μm/延伸引物,0.006μm/阻滞探针,30mmtris-cl,150mmnacl,0.3mmedta,ph8.0,5ng/μl鱼精;

所述核酸外切酶缓冲液组分为:4.5×exoibuffer,20mmmgcl2;

所述延伸连接缓冲液组分为:0.76×gcsolution,3.05×hemoklentaqbuffer,nad3.05mm,mgcl27.63mm,dntp0.61mm;

所述延伸连接酶混合液组分为:0.4μlhemoklentaq+0.1μltaqdnaligase;

所述pcr缓冲液组分为:1.65×gcbuffer1,0.49dntp,0.82mmmgcl2;

所述磁珠纯化洗脱液a组分为:30mmkcl10mmtris-cl,ph8.0;

所述磁珠纯化洗脱液b组分为:10mmtris-cl,ph8.0。

6.一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤一、利用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒,提供一反应体系;

步骤二、杂交;

所述5’延伸引物和所述3’阻滞探针在高温变性、退火过程中与待测样本的目标核酸片段特异性杂交,获得杂交产物,所述5’延伸引物的3'末端与所述3’阻滞探针的5'末端至少间隔1个核苷酸的距离;

步骤三、酶切纯化;

对步骤二的所述杂交产物,用核酸外切酶进行消化处理,再用磁珠进行纯化,从而获得经纯化的反应混合物,所述反应混合物中含有未被消化的所述杂交产物;

步骤四、延伸连接纯化;

在核酸聚合酶作用下,所述5’延伸引物沿目标核酸片段进行dna链延伸,延伸至所述3’阻滞探针的5'末端时被其阻滞,获得5’延伸引物延伸dna链;以及

在核酸连接酶的作用下,将所述5’延伸引物延伸dna链3'端与所述3’阻滞探针5'端连接,从而形成含连接产物的反应混合物;

和任选地重复上述“变性-退火-延伸-连接”,从而增加所述反应混合物中所述连接产物的数量;

对所述反应液混合物中的所述连接产物用磁珠进行纯化;

步骤五、富集

以步骤四的所述纯化后的连接产物为模板,进行pcr扩增,从而获得pcr扩增产物,即为富集的核酸片段;

将所述pcr扩增产物再用磁珠进行纯化,即可得到核酸片段测序文库。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述5'延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解,能够被3'端方向核酸外切酶降解,所述5'延伸引物的5'端带有防止核酸外切酶降解的保护基团;

所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解,能够被5'端方向核酸外切酶降解,所述3’阻滞探针的3'端带有防止核酸外切酶降解的保护基团。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,每一对引物探针组的5’延伸引物的第二部分是相同或基本相同的;每一对引物探针组的3’阻滞探针的第二部分是相同或基本相同的。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述步骤五中,所述pcr扩增过程中,采用的pcr引物包括正向引物和反向引物;

所述正向引物包含能够与所述5’延伸引物的第二部分序列的反向互补序列特异性杂交的序列,所述反向引物包含与所述3’阻滞探针的第二部分特异性杂交的序列;

所述正向引物和所述反向引物中含有与illumina高通量芯片测序平台兼容的通用序列;

所述正向引物和所述反向引物中含有标签序列,针对不同的样本采用不同的标签序列。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述5’延伸引物的第二部分序列为:

5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’;

所述3’阻滞探针的第二部分序列为:

5’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtctt3’;

所述正向引物序列为:

5’aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacac3’;

所述反向引物序列为:

5’caagcagaagacggcatacgagat[x]atggcaaaaatggtgctcaagg3’,其中[x]为标签序列。


技术总结
本发明涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒。其包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶,还包括其他的建库试剂。本发明还涉及一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法。其包括步骤一、提供一反应体系;步骤二、杂交;步骤三、酶切纯化;步骤四、延伸连接纯化;步骤五、富集。本发明提供的试剂盒及文库构建方法具有全基因组文库构建、操作简单、实验步骤短、成本低、准确性高、富集效率高达80%以上等优点。

技术研发人员:徐湘民;滕祥云;李琦;黄少亚;周姗;阳治国;陆世鑫
受保护的技术使用者:广州赛乐斯密医学科技有限公司;南方医科大学
技术研发日:2020.07.09
技术公布日:2020.09.11
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