1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶;还包括其他的建库试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,每一对引物探针组分别包含5’延伸引物和3’阻滞探针;其中,
所述5’延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解,所述5’延伸引物包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续pcr扩增引物序列相对应的第二部分;
所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解,所述3’阻滞探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续pcr扩增引物序列特异性杂交的第二部分;
所述多对引物探针组的序列信息如seqidno:1-98所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸外切酶的修饰为硫代修饰,即所述3’阻滞探针的5'端磷酸化修饰,3'端硫代修饰;所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶;所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述其他的建库试剂包括:
(1)dna变性液:含有变性剂的缓冲液;
(2)引物探针混合液:用于多对引物探针组溶解在杂交缓冲液;
(3)核酸外切酶缓冲液;
(4)延伸连接缓冲液:为核酸聚合酶和核酸连接酶的pcr反应及连接反应提供反应组分及缓冲环境;
(5)延伸连接酶混合液:用于核酸聚合酶及核酸连接酶配比混合;
(6)pcr缓冲液:为核酸聚合酶提供反应组分及缓冲环境;
(7)taqdna聚合酶;
(8)磁珠悬浮液;
(9)磁珠洗脱液a及磁珠洗脱液b。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述dna变性液组分为:0.6875×te,ph8.0,1.25×gcsolution;
所述引物探针混合液组分为:0.003μm/延伸引物,0.006μm/阻滞探针,30mmtris-cl,150mmnacl,0.3mmedta,ph8.0,5ng/μl鱼精;
所述核酸外切酶缓冲液组分为:4.5×exoibuffer,20mmmgcl2;
所述延伸连接缓冲液组分为:0.76×gcsolution,3.05×hemoklentaqbuffer,nad3.05mm,mgcl27.63mm,dntp0.61mm;
所述延伸连接酶混合液组分为:0.4μlhemoklentaq+0.1μltaqdnaligase;
所述pcr缓冲液组分为:1.65×gcbuffer1,0.49dntp,0.82mmmgcl2;
所述磁珠纯化洗脱液a组分为:30mmkcl10mmtris-cl,ph8.0;
所述磁珠纯化洗脱液b组分为:10mmtris-cl,ph8.0。
6.一种用于检测地中海贫血基因突变的文库构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、利用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒,提供一反应体系;
步骤二、杂交;
所述5’延伸引物和所述3’阻滞探针在高温变性、退火过程中与待测样本的目标核酸片段特异性杂交,获得杂交产物,所述5’延伸引物的3'末端与所述3’阻滞探针的5'末端至少间隔1个核苷酸的距离;
步骤三、酶切纯化;
对步骤二的所述杂交产物,用核酸外切酶进行消化处理,再用磁珠进行纯化,从而获得经纯化的反应混合物,所述反应混合物中含有未被消化的所述杂交产物;
步骤四、延伸连接纯化;
在核酸聚合酶作用下,所述5’延伸引物沿目标核酸片段进行dna链延伸,延伸至所述3’阻滞探针的5'末端时被其阻滞,获得5’延伸引物延伸dna链;以及
在核酸连接酶的作用下,将所述5’延伸引物延伸dna链3'端与所述3’阻滞探针5'端连接,从而形成含连接产物的反应混合物;
和任选地重复上述“变性-退火-延伸-连接”,从而增加所述反应混合物中所述连接产物的数量;
对所述反应液混合物中的所述连接产物用磁珠进行纯化;
步骤五、富集
以步骤四的所述纯化后的连接产物为模板,进行pcr扩增,从而获得pcr扩增产物,即为富集的核酸片段;
将所述pcr扩增产物再用磁珠进行纯化,即可得到核酸片段测序文库。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述5'延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解,能够被3'端方向核酸外切酶降解,所述5'延伸引物的5'端带有防止核酸外切酶降解的保护基团;
所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解,能够被5'端方向核酸外切酶降解,所述3’阻滞探针的3'端带有防止核酸外切酶降解的保护基团。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,每一对引物探针组的5’延伸引物的第二部分是相同或基本相同的;每一对引物探针组的3’阻滞探针的第二部分是相同或基本相同的。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述步骤五中,所述pcr扩增过程中,采用的pcr引物包括正向引物和反向引物;
所述正向引物包含能够与所述5’延伸引物的第二部分序列的反向互补序列特异性杂交的序列,所述反向引物包含与所述3’阻滞探针的第二部分特异性杂交的序列;
所述正向引物和所述反向引物中含有与illumina高通量芯片测序平台兼容的通用序列;
所述正向引物和所述反向引物中含有标签序列,针对不同的样本采用不同的标签序列。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述5’延伸引物的第二部分序列为:
5’acactctttccctacacgacgctcttccgatct3’;
所述3’阻滞探针的第二部分序列为:
5’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtctt3’;
所述正向引物序列为:
5’aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacac3’;
所述反向引物序列为:
5’caagcagaagacggcatacgagat[x]atggcaaaaatggtgctcaagg3’,其中[x]为标签序列。