一种Fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种fluoxapiprolin(bcs-cs55621)抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。

背景技术：

辣椒疫霉(phytophthoracapsici)是一类重要的植物病原卵菌，其寄主广泛，能够侵染茄科、豆科、葫芦科等植物并造成毁灭性的灾害。在温暖潮湿的环境条件下，辣椒疫霉侵染寄主引起的病害具有爆发性的特点，给其防治带来了困难。目前，生产上主要使用杀菌剂防治辣椒疫霉引起的植物病害。fluoxapiprolin是拜耳作物科学公司研发的新药剂，开发代码bcs-cs55621，其分子结构与杜邦的氟噻唑吡乙酮非常相似，靶标为氧化固醇结合蛋白(osbp)，对晚疫病、霜霉病、根腐病、茎腐病、疫病等在内的卵菌纲病害表现出卓越的防效。

病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的抗性菌株的检测方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药平板上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性，该方法检测周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，pcr技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂，不能满足快速检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。

环介导等温扩增反应(lamp)是日本学者notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换dna聚合酶在等温条件(65℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。在lamp的反应过程中，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。lamp方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；通过肉眼即可判定结果；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，及适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。该技术在植物病原菌抗药性基因型检测报道很少，目前国内外尚未有辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型g700v的lamp快速分子鉴定的相关报道。

技术实现要素：

植物病原微生物在农药的长时间胁迫压力下，会产生抗性，发现其产生抗性的机理，对植物病害的防治具有非常重要的意义。

本发明的发明人在长期的植物病害抗药性的研究中发现辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗药性菌株主要是靶标蛋白pcorp1第700位氨基酸密码子突变造成，第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变对fluoxapiprolin表现出高抗。这对研究病原的抗性机制和病害防控具有非常重要的意义。

基于此，发明目的：提供一种一种辅助鉴定辣椒疫霉是否产生对fluoxapiprolin的抗型的方法，是检测辣椒疫霉中的基因型是否为fluoxapiprolin抗性基因型g700v，所述fluoxapiprolin抗性基因型g700v为辣椒疫霉基因组中的genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1所示的基因，自5’端第2103位核苷酸由g突变为t,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变。

由于检测该位点存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点。

本发明在抗药性机制研究的基础上，进一步提供一种fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。通过对辣椒疫霉的序列分析，设计了可特异性区分不同的抗性基因型的lamp引物，基于lamp技术能快速、准确鉴定辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型g700v。该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏度高等特点，能大大提高检测效率，对辣椒疫病的抗药性治理、监测及抗药性流行预警具有重要的现实意义。

本发明所述的辣椒疫霉对fluoxapiprolin的抗性基因型g700v是指辣椒疫霉fluoxapiprolin的靶标蛋白pcorp1(genbank:bt031593.1所示的基因编码的蛋白质)第700位氨基酸密码子突变造成对fluoxapiprolin表现出高抗，即自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2103位核苷酸由g突变为t,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变，从而表现出对fluoxapiprolin表现出高抗。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种用于检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp引物组合物：由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、环引物lf和环引物lb组成，各引物序列具体如下：

fip：5′-gactggtatgtttcgcccaggagactgcaccacagtatcat-3′(序列表中序列1)；

bip：5′-tgtgaacacacgagccacca-gcacaaacccagcaatgga-3′(序列表中序列2)；

f3：5′-agcgcttcaagtacgtagtg-3′(序列表中序列3)；

b3：5′-tgacgctcatactggcatg-3′(序列表中序列4)；

lf：5′-cgggttgaatggtttcagct-3′(序列表中序列5)；

lb：5′-cccacctatcagtaacttccagttc-3′(序列表中序列6)。

本发明还提供一种检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测试剂盒，包括上述的lamp引物组合物。

所述lamp检测试剂盒中，还包括pcr反应试剂。

所述的检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp引物组合物或者所述的lamp检测试剂盒在检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测方法。

本发明提供的检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测方法，包括下述步骤：提取待检辣椒疫霉的dna，以提取的dna为模板，利用上述lamp检测引物组合物或lamp检测试剂盒进行lamp扩增，扩增产物若从粉色变为黄色，且进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，若存在梯状条带，则证明所检测辣椒疫霉为fluoxapiprolin抗性基因型g700v；若无梯状条带，则证明所检测辣椒疫霉为非fluoxapiprolin抗性基因型g700v；若扩增产物的颜色为粉色，判定为非fluoxapiprolin抗性基因型g700v的辣椒疫霉。

所述lamp扩增反应的反应体系包括12.5μlwarmstartcolorimetriclamp2xmastermix，1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、0.4μm环引物lf和0.4μm环引物lb组成，1μl模板dna，加ddh2o至25μl。

所述方法中，lamp反应参数为61－69℃，15－60min；优选为68℃，45min。

在lamp的反应过程中，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断是否为辣椒疫霉的fluoxapiprolin抗性基因型g700v；粉色表示检测结果为阴性，是辣椒疫霉的非fluoxapiprolin抗性基因型g700v。

上述的lamp引物组合物或lamp检测试剂盒在检测fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉中的应用也属于本发明的保护范围。

上述lamp检测引物组合物、lamp检测试剂盒、或者所述的方法在辅助筛选对fluoxapiprolin产生抗性的辣椒疫霉中应用也属于本发明的保护范围。

本发明的关键技术之一是根据辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白pcorp1上第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变来设计和优选出的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证能鉴定出辣椒疫霉的fluoxapiprolin(bcs-cs55621)抗性基因型g700v的特异性引物序列，本发明分别选取辣椒疫霉对fluoxapiprolin的敏感菌株(bya5、lt1534、hnjz10、lp3)、抗性基因型g700v菌株、抗性基因型n765s/i807f、抗性基因型n767y；以及侵染辣椒的辣椒炭疽(coletotrichumtruncatum)、匍丝腐霉(pythiumchamaehyphon)、灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)；选择另外两株卵菌病原菌大豆疫霉(phytophthorasojae)、致病疫霉(phytophthorainfestans)为供试材料，采用ctab法提取供试菌株的dna。具体方法如下：收集菌丝，在球磨仪中研磨2min，加入800μl3％ctab提取液，水浴1h，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后，12000rpm离心10min；取上清于新离心管中，加入650μl氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀后，12000rpm离心10min；取上清于新离心管中，加入0.6倍异戊醇沉淀dna，-20℃冷却30min以上；12000rpm离心10min，倒掉异丙醇；加入800μl75％乙醇洗涤；4℃7500rpm离心5min，倒去上清，留下dna，用干燥仪干燥10min，加入30μlddh2o溶解dna。

当lamp进行反应扩增时，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，阴性的反应结果显示为粉色，阳性的反应结果会变为黄色。通过显色结果所示，辣椒疫霉的fluoxapiprolin抗性基因型g700v反应管均为黄色，其为阳性结果，而辣椒疫霉敏感菌株及其它抗性基因型和其它病原菌等阴性对照反应管为粉色，为阴性结果，证明设计和优选的lamp引物组合物具有特异性。同时，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增的反应产物，辣椒疫霉的fluoxapiprolin抗性基因型g700v出现了典型的梯状条带，而其它阴性对照无梯状条带。这说明该lamp引物组合物可被用于辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v快速可靠的试剂盒鉴定，为辣椒疫霉的抗性监测及抗性评估提供理论基础和技术支撑，对我国作物辣椒疫病的发生流行和抗性治理具有重要的理论指导意义。

本发明提供的快速鉴定辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：本发明提供的检测辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的lamp方法克服了现有检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，不能实现快速检测的问题。本发明在61～69℃的任一等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株，不需要复杂和昂贵的仪器，能较好满足对抗性菌株的现场检测。

2、实用性好：pcr检测方法需要进行凝胶电泳，很容易造成产物扩散，成为实验室气凝胶污染的一个主要来源。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，可以直接通过颜色变化即可直接判断结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程，增加了在农业生产中抗性监测的应用价值。

3、恒温扩增：本发明提供的检测辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的lamp方法，不像pcr法必须要热循环仪，这样就摆脱了对热循环仪的依赖，只要有温度的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的的动态平衡中，在bstdna聚合酶的作用下实现扩增。

4、灵敏度高：将模板dna稀释成不同的浓度，分别用lamp法和pcr法进行灵敏度检测，本发明提供的检测辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的lamp方法检测下限为0.001ng/μl，是pcr法检测下线的10000倍。

5、特异性强：本发明在设计和优选引物时，对辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白700位进行相应的突变，将点突变落在f2的3′端，并对倒数第二位进行错配，最终优选出一套能特异性鉴定辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的lamp引物组合物，该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低。

6、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源dna和杂质的影响，不需要从样本中纯化dna，可直接利用发病组织提取dna进行快速检测，大大提高检测准确度。

7、本发明为辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的抗性检测提供了新的技术平台，可用于辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的快速检测，是国内外首次利用lamp技术检测辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。

附图说明

图1是辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp温度特异性检测颜色显色图。1，3，5，7，9：辣椒疫霉敏感菌株，2，4，6，8，10：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株；1，2：65℃；3，4：66℃；5，6：67℃；7，8：68℃；9，10：69℃。

图2是辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp温度特异性检测琼脂糖凝胶电泳图。1，3，5，7，9：辣椒疫霉敏感菌株，2，4，6，8，10：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株；1，2：65℃；3，4：66℃；5，6：67℃；7，8：68℃；9，10：69℃；m：dnamarker

图3是辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp时间特异性检测颜色显色图。1，3，5，7：辣椒疫霉敏感菌株，2，4，6，8：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株；1，2：15min；3，4：30min；5，6：45min；7，8：60min。

图4是辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp时间特异性检测琼脂糖凝胶电泳图。1，3，5，7：辣椒疫霉敏感菌株，2，4，6，8：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株；1，2：15min；3，4：30min；5，6：45min；7，8：60min；m：dnamarker。

图5辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp灵敏度检测的颜色显色图。1：100ng/μl；2：10ng/μl；3：1ng/μl；4：0.1ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.001ng/μl；7：0.0001ng/μl；8：ntc。

图6辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp灵敏度检测琼脂糖凝胶电泳图。1：100ng/μl；2：10ng/μl；3：1ng/μl；4：0.1ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.001ng/μl；7：0.0001ng/μl；8：ntc；m：dnamarker。

图7辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感性菌株的lamp灵敏度检测的颜色显色图。1：100ng/μl；2：10ng/μl；3：1ng/μl；4：0.1ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.001ng/μl；7：0.0001ng/μl；8：ntc。

图8辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感菌株的lamp灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。1：100ng/μl；2：10ng/μl；3：1ng/μl；4：0.1ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.001ng/μl；7：0.0001ng/μl；8：ntc；m：dnamarker。

图9是pcr灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中m：dnamarker；1：100ng/μl；2：10ng/μl；3：1ng/μl；4：0.1ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.001ng/μl；7：0.0001ng/μl；8：敏感菌株dna浓度为100ng/μl；9：ntc。

图10辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感菌株和其它抗性基因型菌株的lamp灵敏度检测的颜色显色图。1：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；2：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；3：辣椒疫霉敏感菌株(hnjz10)；4：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为hnjz10)；5：辣椒疫霉敏感菌株(lt1534)；6：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n765s/i807f抗性菌株(亲本为lt1534)；7：辣椒疫霉敏感菌株(lp3)；8：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n767y抗性菌株(亲本为lp3)；9：ntc。

图11辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感菌株和其它抗性基因型菌株的lamp灵敏度检测的琼脂糖凝胶图。1：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；2：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；3：辣椒疫霉敏感菌株(hnjz10)；4：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为hnjz10)；5：辣椒疫霉敏感菌株(lt1534)；6：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n765s/i807f抗性菌株(亲本为lt1534)；7：辣椒疫霉敏感菌株(lp3)；8：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n767y抗性菌株(亲本为lp3)；9：ntc；m：dnamarker。

图12辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株特异性检测的颜色显色图。1：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；2：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；3：灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)；4：辣椒炭疽(coletotrichumtruncatum)；5：匍丝腐霉(pythiumchamaehyphon)；6：致病疫霉(phytophthorainfestans)；7：大豆疫霉(phytophthorasojae)；8：ntc。

图13辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图。1：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；2：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；3：灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)；4：辣椒炭疽(coletotrichumtruncatum)；5：匍丝腐霉(pythiumchamaehyphon)；6：致病疫霉(phytophthorainfestans)；7：大豆疫霉(phytophthorasojae)；8：ntc；m：dnamarker。

图14辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感菌株和其它抗性基因型菌株侵染辣椒叶片的lamp灵敏度检测的颜色显色图。1：辣椒叶片ck；2：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；3：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；4：辣椒疫霉敏感菌株(hnjz10)；5：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为hnjz10)；6：辣椒疫霉敏感菌株(lt1534)；7：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n765s/i807f/i807f抗性菌株(亲本为lt1534)；8：辣椒疫霉敏感菌株(lp3)；9：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n767y抗性菌株(亲本为lp3)。

图15辣椒疫霉对fluoxapiprolin敏感菌株和其它抗性基因型菌株侵染辣椒叶片的lamp灵敏度检测的琼脂糖凝胶图。1：辣椒叶片ck；2：辣椒疫霉敏感菌株(bya5)；3：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为bya5)；4：辣椒疫霉敏感菌株(hnjz10)；5：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株(亲本为hnjz10)；6：辣椒疫霉敏感菌株(lt1534)；7：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n765s/i807f抗性菌株(亲本为lt1534)；8：辣椒疫霉敏感菌株(lp3)；9：辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n767y抗性菌株(亲本为lp3)；m：dnamarker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。

下述为实施方式中涉及的生物材料：

辣椒疫霉对fluoxapiprolin的敏感菌株(bya5、lt1534、hnjz10、lp3)：其中bya5、hnjz10、lp3为本实验室所保存辣椒疫霉田间分离菌株(记载于：jianqiangmiao,mengcai,xuedong,etal.resistanceassessmentforoxathiapiprolininphytophthoracapsiciandthedetectionofapointmutation(g769w)inpcorp1thatconfersresistance.frontiersinmicrobiology,2016,7:615；jiewu,zhaolinxue,jianqiangmiao,etal.sensitivityofdifferentdevelopmentalstagesandresistanceriskassessmentofphytophthoracapsicitofluopicolideinchina.frontiersinmicrobiology,2020,11:185)；lt1534为目前公开的辣椒疫霉基因组测序标准菌株，由美国brettm.tyler教授馈赠。将获得的菌株接种于含有0.005μg/ml的pda平板上，若菌丝不能生长，则为敏感菌株。进一步通过基因克隆和测序发现这些菌株的基因组中均有bt031593.1所示的基因，并且，自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2103位核苷酸没有发生由g至t的突变。本领域技术人员可以田间采集并按照上述方法检测，获得辣椒疫霉对fluoxapiprolin的敏感菌株。

抗性基因型g700v菌株：本实验室通过亲本菌株经fluoxapiprolin药剂驯化，在离体条件下，将辣椒疫霉亲本敏感菌株(bya5、lt1534、hnjz10、lp3)的菌饼接种于含0.005μg/ml(最小完全抑制浓度)的双二氟噁唑哌啶的pda平板上，25℃黑暗培养15-20d后，观察菌落生长情况，将长出的菌落转接于带有同样浓度的新的pda平板上。重复3次，观察菌落生长情况，筛选在0.005μg/mlfluoxapiprolin处理下与空白pda平板上菌丝生长速度相近的菌落。另外，为了获得辣椒疫霉对fluoxapiprolin高水平抗性的突变体，将上述条件下获得的菌落转接于更高浓度0.01、0.02、0.05μg/ml的fluoxapiprolin的pda平板上，25℃黑暗培养30d，将长出菌落转接带有相同浓度的pda平板。不断重复，直至出现在0.1μg/ml的fluoxapiprolin的平板上生长较快的疑似突变体，用于后续抗性水平和抗药稳定性测定。对疑似突变体在无药pda平板上转接三次后接种于含0.05μg/ml的fluoxapiprolin，观察是否能正常生长，对于能正常生长的突变体进行计算抗性倍数以及提取dna进行克隆靶标基因(pcorp1-f：gctccacttcgcctcttt，pcorp1-r：ttgctcttaccgctgctc)，并经测序验证表明，这些菌株的基因组中的bt031593.1所示的基因发生突变，自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2103位核苷酸由g突变为t,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变，并且，经过药剂敏感性测定发现，这些菌株均表现出对fluoxapiprolin表现出高抗。获得的辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v抗性菌株，亲本菌株为bya5、hnjz10，驯化得到的抗性基因型g700v菌株分别为bya5-2(抗性倍数为1485)，hnjz10-1(抗性倍数为545)。作为验证本发明的方法的材料，上述抗性基因型g700v菌株，本领域技术人员既可以通过上述药剂驯化的方法获得，也可以通过基因工程如利用合成的突变基因与野生型发生同源重组、crispr/cas9定点突变、紫外诱变的方法获得，也可以从自然界中获得抗性的菌株中筛选获得。将获得的抗性菌株接种于含0.005μg/ml的pda平板上，若菌丝能正常生长，则为抗性菌株。t42-1也为抗性基因型g700v菌株，该菌株以bya5为亲本菌株，通过crispr/cas9定点编辑技术,使辣椒疫霉bya5基因组中自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2103位核苷酸由g突变为t,造成其编码的蛋白质的第700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变,获得的辣椒疫霉转化子菌株，记载于jianqiangmiao,yuandongchi,donglin,etal.mutationsinorp1conferringoxathiapiprolinresistanceconfirmedbygenomeeditingusingcrispr/cas9inphytophthoracapsiciandp.sojae.phytopathology,2018,108:1412-1419.

抗性基因型n765s/i807f菌株：本实验室通过药剂驯化，同上述获得抗性基因型g700v菌株的方法一致，并经测序验证表明，这些菌株的基因组中的bt031593.1所示的基因发生突变，自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2368位核苷酸由a突变为g,造成其编码的蛋白质的第765位氨基酸密码子aac(asn)→agc(ser)的突变，并且，经过表型鉴定发现，这些菌株均表现出对fluoxapiprolin表现出高抗。获得的辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n765s/i807f抗性菌株(lt1534-4，抗性倍数为279)，亲本菌株为lt1534。

抗性基因型n767y菌株：本实验室通过药剂驯化，同上述获得抗性基因型g700v菌株的方法一致，并经测序验证表明，这些菌株的基因组中的bt031593.1所示的基因发生突变，自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2372位核苷酸由a突变为t,造成其编码的蛋白质的第767位氨基酸密码子aac(asn)→tac(tyr)的突变，并且，经过表型鉴定发现，这些菌株均表现出对fluoxapiprolin表现出高抗。获得的辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型n767y抗性菌株(lp3-2，抗性倍数为1033)，亲本菌株为lp3。

侵染辣椒的辣椒炭疽(coletotrichumtruncatum)、匍丝腐霉(pythiumchamaehyphon)、灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)；选择另外两株卵菌病原菌大豆疫霉(phytophthorasojae)、致病疫霉(phytophthorainfestans)：均为实验室从自然界分离，按照常规方法鉴定，并保存菌株。

实施例1、辣椒疫霉菌株对fluoxapiprolin的敏感性测定

1)将fluoxapiprolin用二甲基亚砜(dmso)配成10⁴μg/ml的母液。对于辣椒疫霉菌敏感菌株的敏感性测定，将fluoxapiprolin逐级稀释成0.001μg/ml，0.0008μg/ml，0.0006μg/ml，0.0004μg/ml，0.0002μg/ml的浓度梯度；对于辣椒疫霉菌抗性菌株的敏感性测定，将供试药剂fluoxapiprolin逐级稀释成2μg/ml，1μg/ml，0.4μg/ml，0.2μg/ml，0.05μg/ml的浓度梯度。

2)用移液枪吸取药液60μl加入已灭菌的冷却至45℃的60mlpda培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9㎝的培养皿中，设只加60μldmso的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。

3)辣椒疫霉菌在pda平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。

4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各复配比例对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(x)，在microsoftexcel中作回归直线，分别求出供试辣椒疫霉菌株的毒力回归曲线方程y＝a+bx，以及相关系数r和有效抑制中浓度ec50值，并计算抗性倍数。

抗性倍数＝抗性菌株的平均ec50/敏感亲本菌株的平均ec50

表1.9株辣椒疫霉菌株对fluoxapiprolin的敏感性

通过辣椒疫霉菌对fluoxapiprolin敏感性检测，结果发现辣椒疫霉菌敏感菌株bya5、hnjz10、lt1534和lp3的平均ec50为3.63×10^-4μg/ml，而抗性菌株bya5-2、hnjz10-1、lt1534-4、lp3-2和t42-10的平均ec50为0.29μg/ml，显著高于敏感菌株的ec50，如表1。

实施例2、lamp反应引物组合物的设计

本发明的发明人前期研究发现辣椒疫霉中的对fluoxapiprolin的抗药性菌株主要是靶标蛋白pcorp1(genbank:bt031593.1)的氨基端第700位氨基酸突变gga(gly)→gta(val)会使其对fluoxapiprolin产生抗性，然而，对该位点的检测常规方法一般是先克隆该基因，然后测序鉴定，鉴定方法复杂，并且成本高昂。因此，本发明以氧化固醇结合蛋白700位氨基酸密码子gga(gly)→gta(val)的突变(自genbankaccessionvertionnumber为bt031593.1的5’端第2103位核苷酸由g突变为t)为依据，在网站primerexplorer(v5)http://primerexplorer.jp/e/上设计lamp引物，最终，将其突变位点位于正向内引物fip的3′端，在其倒数第二位进行错配，并以辣椒疫霉敏感菌株和辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的dna为模板进行lamp实验，优选出能特异性鉴定辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株的lamp引物组合物。

各引物序列具体如下：

fip：

(序列表中序列1)；

bip：5′-tgtgaacacacgagccagcacaaacccagcaatgga-3′(序列表中序列2)；

f3：5′-agcgcttcaagtacgtagtg-3′(序列表中序列3)；

b3：5′-tgacgctcatactggcatg-3′(序列表中序列4)；

lf：5′-cgggttgaatggtttcagct-3′(序列表中序列5)；

lb：5′-cccacctatcagtaacttccagttc-3′(序列表中序列6)。

其中，在正向内引物fip的3′端碱基中，带下划线的“t”碱基为辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v的点突变碱基，方框中“a”碱基为人为错配碱基。

实施例3、lamp反应条件试验

为了节省鉴定成本，保证该鉴定方法的稳定性和可靠性，对反应体系中的引物fip/bip、f3/b3、lf/lb(10μm)浓度进行优化，确定了试剂盒中引物的最佳浓度为：1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、0.4μm环引物lf和0.4μm环引物lb组成。

为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度及时间进行了优化，得出在反应温度为68℃、69℃和反应时间45－60min时均能实现lamp扩增。如图1所示，在65℃、66℃、67℃时野生型和抗性基因型g700v菌株没有颜色差异，不能检测出来，而在68℃、69℃时野生型为粉色(阴性结果)，抗性基因型g700v菌株为黄色(阳性结果)；图2所示，只有68℃、69℃抗性基因型g700v菌株有梯状条带出现。如图3所示，在15min、30min时野生型和抗性基因型g700v菌株没有颜色差异，不能检测出来，而在45min、60min时野生型为粉色(阴性结果)，抗性基因型g700v菌株为黄色(阳性结果)；图4所示，只有在45min、60min时抗性基因型g700v菌株有梯状条带出现。从而得出最佳反应条件为68℃45min。

实施例4、lamp反应特异性试验

以辣椒疫霉对fluoxapiprolin的敏感菌株(bya5、lt1534、hnjz10、lp3，实验室保存)、抗性基因型g700v菌株(bya5-2，hnjz10-1，经过药剂驯化获得)、抗性基因型n765s/i807f、抗性基因型n767y；以及侵染辣椒的辣椒炭疽(coletotrichumtruncatum)、匍丝腐霉(pythiumchamaehyphon)、灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)；选择另外两株卵菌病原菌大豆疫霉(phytophthorasojae)、致病疫霉(phytophthorainfestans)为供试材料，进行lamp反应。

取上述供试菌株的dna溶液1μl，加入25μllamp反应体系。按照实施例2所述的反应体系进行lamp反应，反应程序是68℃45min。

结果显示基于反应体系颜色反应作为结果判定标准，当dna模板为辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株时，呈现黄色；当模板为非辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株时，呈现粉色(图10、图12)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状dna条带，阴性无条带(图11、图13)。

实施例5、lamp反应灵敏度试验

为了确定lamp反应的检测下限，提取辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株(bya5-2)提取dna，测定其浓度，以10倍梯度稀释作为模板。分别取稀释后的各浓度dna稀释液1μl作为模板进行pcr扩增，pcr引物为：f：ctgcaccacagtatcat；r：gcacaaacccagcaatggagta，pcr反应在总体积为20μl的体系中进行，包括：10μl2×pcrmix，7μlddh2o，1μl各引物，1μl模板dna。同时以上述稀释液1μl作为模板，加入25μllamp反应体系中进行lamp扩增，反应程序68℃45min。显色反应表明lamp反应的最低检测下限为0.001ng/μl；同时分别取pcr和lamp扩增产物7μl上样，在2％琼脂糖凝胶上电泳，如图5和图6所示lamp的检测下限为0.001ng/μl，图9所示pcr的检测下限为10ng/μl；这表明lamp的最低检测下限为检测下限的10000倍。图7中以敏感菌株(bya5)的10倍梯度稀释作为模板，进行lamp反应均呈现粉色；图8中2％琼脂糖凝胶电泳上也均无梯状条带出现。

实施例6、用lamp在实验室模仿田间检测

用实验室的敏感菌株及获得的抗性菌株，接种辣椒叶片，三天后，提取发病辣椒叶片dna，用未接种的辣椒叶片的dna做为对照。进行lamp反应，当dna模板为辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株时，呈现黄色；当模板为非辣椒疫霉对fluoxapiprolin抗性基因型g700v菌株时，呈现粉色(图14)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状dna条带，阴性无条带(图15)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

<110>西北农林科技大学

<120>一种fluoxapiprolin抗性基因型g700v辣椒疫霉的lamp检测引物组合物及其应用

<130>whoi201036

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

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<213>人工序列（artificialsequence）

<400>6

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