用于鉴定抗原特异性T细胞的组合物和方法与流程

用于鉴定抗原特异性t细胞的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年2月12日提交的美国临时申请号62/804,649、2019年3月29日提交的美国临时申请号62/826,823、2019年7月19日提交的美国临时申请号62/876,380和2019年6月26日提交的美国临时申请号62/867,165的优先权，其内容通过引用整体并入，并要求其优先权。
3.序列表
4.本技术包含序列表，其以ascii格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ascii拷贝，在2020年1月21日生成，命名为087520_0125_sl.txt，并且大小为292,725字节。


背景技术：

5.t细胞是适应性免疫的主要介质。在每个t细胞独特的t细胞受体(tcr)的特异性的指导下，t细胞调节自身免疫，帮助激活b细胞和先天效应子，并以精确靶向的方式直接杀死感染细胞和癌细胞。每个tcr识别由靶细胞上的主要组织相容性复合体(mhc)分子呈递的配体。相关肽
‑
mhc复合物配体的鉴定在理解对肿瘤和病原体的免疫反应中发挥作用。mhc复合体配体对于理解对自身和饮食抗原的反应也很有价值。这种理解使得启动、放大或减弱对靶抗原的免疫反应的临床有益免疫疗法(例如tcr基因转移和疫苗)成为可能。
6.突变的“新表位”是针对癌症的内源性和工程化免疫反应的重要靶标。新表位反应性肿瘤浸润白细胞(til)存在于内源性库中，并在过继转移后消退肿瘤。同样，肿瘤突变负荷预测ctla
‑
4或pd
‑
1阻断的临床有效性，表明这些检查点抑制策略通过释放新表位反应性t细胞影响肿瘤消退。由于新表位由肿瘤细胞的体细胞突变引起，它们通常不会由胸腺上皮细胞呈递以诱导中枢耐受。因此，针对这些新表位的t细胞反应是肿瘤特异性的，可能是高度亲和力的，并且是患者特异性的(即私有的)。从临床角度来看，这既是机遇也是挑战：新表位是免疫治疗的优异靶点，但tcr分离方法应具有足够高的通量，以便以临床上有用的规模实现治疗应用。
7.对用于基础和转化研究的快速和稳健的tcr配体发现技术的需求未得到满足。肽
‑
mhc多聚体能够根据tcr的抗原特异性对t细胞进行分选，这是分离用于基因治疗的肿瘤特异性tcr的重要步骤。当前典型的肽
‑
mhc生产协议从感兴趣的肽配体的固相合成开始。同时，通用β2
‑
微球蛋白和相关的mhc i类分子在大肠杆菌中异源表达，产生错误折叠的包含体。将每个肽添加到包含β2
‑
微球蛋白和相关mhc i类分子的重折叠反应中。最后，可以纯化并配制正确重折叠的三元复合物部分，用于肽
‑
mhc多聚体生产。为了促进具有许多不同肽配体的特定mhc分子的平行生产，schumacher及其同事设计了一种光裂解肽，该肽结合特定mhc分子作为条件配体。执行单个重折叠反应以生成与其条件配体结合的mhc分子。在暴露于紫外线后，条件配体被切割并交换为过量存在的期望的肽。许多此类交换反应可以并行进行，从而能够为该特定mhc等位基因构建pmhc文库。即便如此，这种最先进的技术也具有挑战性的局限性。首先，在大肠杆菌包含体中表达的mhc分子的生产、纯化和重折叠是费力的，并且正确折叠的肽
‑
mhc复合物的产量低。其次，商业肽合成的周转时间(周)与针对患者
特异性新表位的个性化按需tcr基因疗法的最佳时间尺度不一致。第三，许多预测的配体不能通过这种方法用于筛选t细胞，因为肽的生物物理特性(例如疏水性)阻止了它的合成或交换。第四，交换效率通常很差(大多数预测的hla结合肽的交换效率<50％)。由此产生的正确折叠的交换mhc和错误折叠的未配体mhc的混合物导致具有低信噪比的多聚体染色，当用肽
‑
mhc试剂的多路复用(multiplexed)池筛选t细胞时，这个问题会加剧。第五，为每个新的mhc等位基因设计和验证条件配体是一项费力且不可靠的工作。由于mhc基因座是人类基因组中最多的多等位基因基因座，这是在不同mhc单倍型患者中实施新表位靶向基因治疗的主要障碍。总之，这些限制强调了该领域中对新技术的需求。本文公开了解决这些限制的用于产生肽
‑
mhc多聚体的各种组合物和方法。
8.发明概述
9.本公开提供了用于鉴定新表位、鉴定和分离t细胞受体、工程化原代细胞以表达特异性t细胞受体、扩增工程化t细胞以及使用细胞疗法治疗病症的组合物和方法。在各种实施方案中，本发明提供了改进的细胞疗法和组合物，用于鉴定新表位、鉴定和分离t细胞受体、工程化原代细胞以表达特异性t细胞受体、扩增工程化的t细胞以及用于治疗增殖性疾病、病症和病况。
10.在一个方面，本文提供了一种用于鉴定t细胞的抗原特异性的方法，包括提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；通过其相关联的第一和第二识别标记分离结合至颗粒集合的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的颗粒集合相结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；并基于该比率鉴定t细胞的抗原特异性。
11.在一个方面，本文提供了一种用于鉴定t细胞的抗原特异性的方法，包括：获得或已经获得与两个或更多个不同颗粒集合结合的至少一种抗原特异性t细胞，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽的身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，其中每个集合包含含有第一识别标记的第一颗粒和含有不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；进行或已经进行了至少一种测定以鉴定可检测地结合到与t细胞结合的颗粒集合的一个或多个条形码；并且确定或已经确定了与鉴定t细胞的抗原特异性的t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的。
12.在一个方面，本文提供了一种用于鉴定t细胞的抗原特异性的方法，包括：获得或已经获得数据集，该数据集包含与直接或间接结合到t细胞的颗粒集合可检测地结合的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；并且确定或已经确定了与鉴定t细胞抗原特异性的t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的。
13.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码和一个或多个条形码拷贝数。
14.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
15.在一些实施方案中，第一颗粒包含第一条形码并且第二颗粒包含不同于第一条形码的第二条形码，其中所述第一和第二条形码与抗原的身份相关联。
16.在一些实施方案中，条形码的比率对应于分离的t细胞的抗原特异性。
17.在一些实施方案中，如果条形码的比率高于阈值，则分离的t细胞被鉴定为抗原特异性t细胞。
18.在一些实施方案中，阈值至少为2或大于2。
19.在一些实施方案中，阈值至少为5或大于5。
20.在一些实施方案中，阈值至少为10或大于10。
21.在一些实施方案中，阈值在2和5之间。
22.在一些实施方案中，阈值在5和10之间。
23.在一些实施方案中，阈值是至少或大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,2
‑
5,3
‑
6,4
‑
7,5
‑
8,5
‑
10,7
‑
10或大于10。
24.在一些实施方案中，该测定是基于核苷酸的测定。
25.在一些实施方案中，基于核苷酸的测定是pcr测定、rt
‑
pcr测定、测序测定或杂交测定。
26.在一些实施方案中，该测定确定一个或多个条形码的序列。
27.在一些实施方案中，该测定确定一个或多个条形码的序列和拷贝数。
28.在一些实施方案中，该方法进一步包括获得t细胞受体(tcr)cdr序列。
29.在一些实施方案中，该方法进一步包括获得tcrα和β链序列。
30.在一些实施方案中，t细胞的抗原特异性包括(a)抗原肽的序列和(b)结合的t细胞的tcr序列中的每一个。
31.在一些实施方案中，每个第一颗粒的第一识别标记在每个集合中是相同的。
32.在一些实施方案中，每个第二颗粒的第二识别标记在每个集合中是相同的。
33.在一些实施方案中，每个第一颗粒的第一识别标记在每个集合中是相同的，并且其中每个第二颗粒的第二识别标记在每个集合中是相同的。
34.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
35.在一些实施方案中，第一荧光团是别藻蓝蛋白(apc)。
36.在一些实施方案中，第二荧光团是藻红蛋白(pe)。
37.在一些实施方案中，颗粒集合包含第三颗粒，所述第三颗粒包含不同于第一和第二条形码的第三条形码，其中所述第一、第二和第三条形码与抗原的身份相关联。
38.在一些实施方案中，独特的抗原肽选自由以下各项组成的组：肿瘤抗原肽、新抗原肽、肿瘤新抗原肽、病毒抗原肽、细菌抗原肽、磷酸抗原肽和微生物抗原肽。
39.在一些实施方案中，独特的抗原肽是新抗原肽。
40.在一些实施方案中，其中新抗原源自受试者的肿瘤测序数据，所述肿瘤测序数据用于鉴定数据中存在的相对于野生型的一个或多个体细胞突变。
41.在一些实施方案中，使用计算机预测算法来确定新抗原。
42.在一些实施方案中，预测算法进一步包括mhc结合算法以预测新抗原和mhc肽之间
的结合。
43.在一些实施方案中，样品选自血液样品、骨髓样品、组织样品、肿瘤样品或外周血单核细胞(pbmc)样品。
44.在一些实施方案中，样品是pbmc样品。
45.在一些实施方案中，样品是肿瘤样品。
46.在一些实施方案中，样品是骨髓样品。
47.在一些实施方案中，t细胞是人t细胞。
48.在一些实施方案中，t细胞是cd8+t细胞。
49.在一些实施方案中，cd8+t细胞是人cd8+t细胞。
50.在一些实施方案中，该方法包括不同颗粒集合的文库。
51.在一些实施方案中，文库包括2至500个不同的颗粒集合。
52.在一些实施方案中，文库包括至少60个不同的颗粒集合。
53.在一些实施方案中，每个颗粒包含mhc肽。
54.在一些实施方案中，mhc肽是哺乳动物mhc肽。
55.在一些实施方案中，mhc肽是人mhc肽。
56.在一些实施方案中，mhc肽是i类hla肽。
57.在一些实施方案中，hla肽包括hla
‑
a、hla
‑
b或hla
‑
c肽。
58.在一些实施方案中，hla肽包含hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02,或hla
‑
c*17:01。
59.在一些实施方案中，hla肽包含y84a或y84c突变。
60.在一些实施方案中，每个颗粒包含hlai肽和β2m肽。
61.在一些实施方案中，β2m肽是哺乳动物β2m肽。
62.在一些实施方案中，β2m肽是人β2m肽。
63.在一些实施方案中，β2m肽包含允许或增加与硫醇染料结合的突变。
64.在一些实施方案中，突变是s88c。
65.在一些实施方案中，每个颗粒包含多肽，该多肽在氨基到羧基末端方向上包含(i)抗原肽，(ii)β2m肽，和(iii)mhc肽。
66.在一些实施方案中，多肽进一步包含在抗原肽之前的第一通用靶肽，以及在抗原肽和β2m肽之间不同于第一通用靶肽的第二通用靶肽。
67.在一些实施方案中，每个颗粒包含多肽，该多肽在氨基到羧基末端方向包含(i)第
一通用靶肽，(ii)抗原肽，(iii)不同于第一个通用靶肽的第二通用靶肽，(iv)β2m肽，和(v)mhc肽。
68.在一些实施方案中，抗原肽的长度为7
‑
15个氨基酸，7
‑
10,8
‑
9,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸。
69.在一些实施方案中，包含独特抗原肽的多肽被生物素化。
70.在一些实施方案中，不同颗粒集合中的每个颗粒包含链霉亲和素核心和独特抗原肽的至少一个拷贝。
71.在一些实施方案中，颗粒包含独特抗原肽的一个、两个、三个或四个拷贝。
72.在一个方面，本文提供了包含两个或更多个不同颗粒集合的文库，每个颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽的身份可操作地相关联的定义的条形码，其中每个集合包含含有第一识别标记的第一颗粒和含有不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒。
73.在一些实施方案中，识别标记是荧光团。
74.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
75.在一个方面，本文提供了一种颗粒，其包含与独特条形码结合的四聚体固相支持体和三个或更少的附接的多肽分子，所述多肽分子在氨基至羧基末端方向包含(i)抗原肽，(ii)β2m肽，和(iii)mhc肽，其中条形码与抗原肽的身份可操作地相关联。
76.在一些实施方案中，多肽进一步包含在抗原肽之前的第一通用靶肽，以及在抗原肽和β2m肽之间不同于第一通用靶肽的第二通用靶肽。
77.在一些实施方案中，固相支持体是链霉亲和素核心。
78.在一些实施方案中，多肽分子被生物素化。
79.在一些实施方案中，多肽分子通过生物素
‑
链霉亲和素相互作用结合至链霉亲和素核心。
80.在一些实施方案中，颗粒进一步包含识别标记。
81.在一些实施方案中，识别标记是荧光团。
82.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
83.在一个方面，本文提供了包含颗粒的文库，其中所述文库包含两个或更多个不同的颗粒，其中每个不同的颗粒包含独特的抗原肽。
84.在一个方面，本文提供了一种监测受试者免疫组库的方法，包括：提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品，其中该样品是随时间从受试者获得的；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；分离与第一和第二识别标记相关联的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(e)主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；基于该比率鉴定t细胞的抗原特异性；并监测受试者中通过该方法鉴定的抗原特异性t细胞的变化。
85.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
86.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
87.在一个方面，本文提供了一种监测受试者中免疫组库的方法，包括获得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；确定或已经确定了与鉴定t细胞抗原特异性的t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(a)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；鉴定与抗原特异性t细胞结合的独特抗原肽的序列；并监测受试者中通过该方法鉴定的抗原特异性t细胞的变化。
88.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码和一个或多个条形码拷贝数。
89.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
90.在一些实施方案中，监测t细胞的变化包括向受试者施用可溶的、标记的抗原特异性tcr。
91.在一些实施方案中，基于所鉴定的抗原特异性t细胞的变化对受试者施用免疫疗法。
92.在一些实施方案中，免疫疗法是检查点抑制剂。
93.在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体或抗ctla
‑
4抗体。在一些实施方案中，抗pd
‑
1抗体选自包括派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)和西米普利单抗(cemiplimab)的组。在一些实施方案中，抗pd
‑
li抗体选自包括阿特珠单抗(atezolizumab)、avelumab和度伐鲁单抗(durvalumab)的组。在一些实施方案中，抗ctla4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗tigit抗体。在一些实施方案中，抗tigit抗体选自包含ab154(arcus),tiragolumab(genentech),bms
‑
986297(bms),mk
‑
7684(merck)和etigilimab(oncomed)的组。
94.在一个方面，本文提供了一种鉴定抗原的方法，包括提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；分离与第一和第二识别标记相关联的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和来自步骤(e)的不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；并且鉴定与抗原特异性t细胞结合的独特抗原肽的序列。
95.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
96.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
97.在一个方面，本文提供了一种鉴定抗原的方法，包括获得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；确定或已经确定了与t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和来自步骤(a)的不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；并鉴定与抗原特
异性t细胞结合的独特抗原肽的序列。
98.在一些实施方案中，步骤(a)包括获得基于t细胞的样品并对其进行测定以获得数据集。
99.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码和一个或多个条形码拷贝数。
100.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
101.在一个方面，本文提供了一种鉴定hla和肽复合物的方法，包括提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；分离与第一和第二识别标记相关联的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定主要条形码的第一拷贝数和来自步骤(e)的不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；并鉴定与抗原特异性t细胞结合的hla和肽复合物。
102.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
103.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
104.在一个方面，本文提供了一种鉴定hla和肽复合物的方法，包括获得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；确定或已经确定了与t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(a)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；并鉴定与抗原特异性t细胞结合的hla和肽复合物。
105.在一些实施方案中，步骤(a)包括获得基于t细胞的样品并对其进行测定以获得数据集。
106.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码和一个或多个条形码拷贝数。
107.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
108.在一个方面，本文提供了一种鉴定用于用免疫疗法治疗的受试者的方法，包括提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；分离与第一和第二识别标记相关联的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(e)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的。
109.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
110.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
111.在一个方面，本文提供了一种鉴定用于用免疫疗法治疗的受试者的方法，包括获
得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；和确定或已经确定了与t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(a)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的。
112.在一些实施方案中，步骤(a)包括获得基于t细胞的样品并对其进行测定以获得数据集。
113.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码和一个或多个条形码拷贝数。
114.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
115.在一些实施方案中，免疫疗法包括t细胞疫苗、树突细胞疫苗、核酸疫苗、肽疫苗、病毒疫苗、可溶性tcr、tcr
‑
药物缀合物、抗体或抗体
‑
药物缀合物。
116.在一些实施方案中，抗体包括单克隆抗体。
117.在一个方面，本文提供了一种鉴定独特的tcr序列的方法，包括提供两个或多个不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽和与抗原肽身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码，并且每个集合包括包含第一识别标记的第一颗粒和包含不同于第一识别标记的第二识别标记的第二颗粒；提供已知或怀疑包含一种或多种t细胞的样品；使样品与两个或更多个颗粒集合接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原的条件；分离与第一和第二识别标记相关联的一个或多个t细胞；进行测定以鉴定与分离的t细胞结合的一个或多个条形码；确定与分离的t细胞结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(e)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；和鉴定独特的tcr序列。
118.在一些实施方案中，第一和第二识别标记是荧光团。
119.在一些实施方案中，荧光团是apc或pe。
120.在一个方面，本文提供了一种鉴定独特的tcr序列的方法，包括获得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；确定或已经确定了与t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(a)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；和鉴定独特的tcr序列。
121.在一些实施方案中，步骤(a)包括获得基于t细胞的样品并对其进行测定以获得数据集。
122.在一些实施方案中，数据集包括一个或多个条形码序列和一个或多个条形码拷贝数。
123.在一些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。
124.在一些实施方案中，该方法进一步包括制造包含经鉴定的独特tcr序列的可溶性tcr多肽。
125.在一些实施方案中，可溶性tcr多肽与标记或药物连接。
126.在一些实施方案中，重复该方法以鉴定至少两种独特的tcr序列。
127.在一些实施方案中，该方法进一步包括制造包含至少两种独特tcr序列的文库。
128.在一个方面，本文提供了一种治疗受试者癌症的方法，包括获得或已经获得数据集，该数据集包含与可检测地直接或间接结合至t细胞的一个或多个条形码相关联的数据，其中所述一个或多个条形码各自与独特的抗原肽可操作地相关联；确定或已经确定了与鉴定t细胞抗原特异性的t细胞相结合的条形码的比率，其中所述比率是通过鉴定来自步骤(a)的主要条形码的第一拷贝数和不同条形码的第二拷贝数并且将第一拷贝数除以第二拷贝数来计算的；鉴定至少一种或全部两种t细胞的tcr序列，并产生包含至少一种或全部两种tcr序列的工程化t细胞；和将工程化的t细胞施用于受试者。
129.在一些实施方案中，该方法进一步包括施用免疫疗法。
130.在一些实施方案中，免疫疗法是检查点抑制剂。
131.在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体或抗ctla
‑
4抗体。
132.在一些实施方案中，t细胞是自体的。
133.在一些实施方案中，工程化t细胞是自体的。
134.在一些实施方案中，独特的抗原肽由受试者癌症的细胞表面上的i类hla呈递。
135.在某些实施方案中，当前公开的主题提供了用于处理t细胞的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)使样品与多个不同的颗粒集合接触；(b)分离与颗粒结合的一个或多个t细胞；(c)鉴定与分离的t细胞结合的颗粒的条形码；和(d)确定每个条形码的比率。在某些实施方案中，每个颗粒包含独特的抗原肽、可操作地相关联的条形码和至少一个识别标记。在某些实施方案中，样品包含t细胞。在某些实施方案中，接触包括提供适合单个t细胞结合至至少一个颗粒集合的独特抗原肽的条件。
136.在某些实施方案中，该比率是通过鉴定第一条形码的拷贝数和第二条形码的拷贝数并将第一条形码的拷贝数除以第二条形码的拷贝数来计算的。在某些实施方案中，独特的抗原肽对于每个不同的颗粒集合是相同的。在某些实施方案中，每个不同的颗粒集合包含至少一个或多个条形码，其中每个条形码与抗原肽的身份相关联。在某些实施方案中，每个条形码的比率对应于分离的t细胞的抗原特异性。在某些实施方案中，如果第一条形码的比率高于阈值，则分离的t细胞被鉴定为抗原特异性t细胞。在某些实施方案中，阈值是至少或大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,2
‑
5,3
‑
6,4
‑
7,5
‑
8,5
‑
10,7
‑
10或大于10。
137.在某些实施方案中，识别条形码包括基于核苷酸的测定。在某些实施方案中，基于核苷酸的测定是pcr、rt
‑
pcr、测序或杂交测定。在某些实施方案中，基于核苷酸的测定确定每个条形码的序列。在某些实施方案中，基于核苷酸的测定确定每个条形码的拷贝数。在某些实施方案中，基于核苷酸的测定确定(a)每个条形码的序列和/或(b)每个条形码的拷贝数。
138.在某些实施方案中，该方法进一步包括获得t细胞受体(tcr)cdr序列。在某些实施方案中，该方法进一步包括获得tcr基因序列。在某些实施方案中，tcr基因序列是tcrα或tcrβ链序列。
139.在某些实施方案中，该方法包括鉴定t细胞的抗原特异性。在某些实施方案中，t细胞的抗原特异性包括抗原肽的序列和结合的t细胞的tcr序列。
140.在某些实施方案中，至少一个识别标记在每个不同的颗粒集合中是相同的。在某些实施方案中，该方法包括至少两个不同的识别标记。在某些实施方案中，至少一个识别标记是荧光团。在某些实施方案中，荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
在某些实施方案中，至少两个不同的识别标记是荧光团，其中荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
141.在某些实施方案中，抗原肽选自由以下各项组成的组：肿瘤抗原、新抗原、肿瘤新抗原、病毒抗原、细菌抗原、磷酸抗原(phospho
‑
antigen)和微生物抗原。在某些实施方案中，新抗原是从受试者的肿瘤测序数据中鉴定的。在某些实施方案中，计算机预测算法用于确定新抗原。在某些实施方案中，预测算法进一步包括mhc结合算法以预测新抗原和mhc肽之间的结合。
142.在某些实施方案中，样品选自血液样品、骨髓样品、组织样品、肿瘤样品或外周血单核细胞(pbmc)样品。在某些实施方案中，其中t细胞是人t细胞。在某些实施方案中，t细胞是cd8
+
t细胞。
143.在某些实施方案中，该方法包括不同颗粒集合的文库。在某些实施方案中，文库包括2至500个不同的颗粒集合。在某些实施方案中，每个颗粒包含mhc肽。在某些实施方案中，mhc肽是人mhc肽。在某些实施方案中，mhc肽是i类hla肽。在某些实施方案中，hla肽包括hla
‑
a、hla
‑
b或hla
‑
c肽。在某些实施方案中，hla肽包含hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02或hla
‑
c*17:01。
144.在某些实施方案中，每个颗粒包含hla肽和β2m肽。在某些实施方案中，β2m肽是人β2m肽。在某些实施方案中，β2m肽包含突变。在某些实施方案中，突变是s88c。
145.在某些实施方案中，每个颗粒包含多肽，该多肽在氨基到羧基末端方向上包含(i)抗原肽，(ii)β2m肽，和(iii)mhc肽。在某些实施方案中，抗原肽的长度为7
‑
15个氨基酸，7
‑
10,8
‑
9,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸。在某些实施方案中，多肽是生物素化的。在某些实施方案中，颗粒选自由以下各项组成的组：磁珠、琼脂糖珠、苯乙烯聚合物颗粒和葡聚糖聚合物颗粒。在某些实施方案中，其中颗粒被链霉亲和素包被。
146.在某些实施方案中，当前公开的主题提供了用于监测受试者中免疫组库的方法。在某些实施方案中，该方法包括监测受试者中抗原特异性t细胞的变化。在某些实施方案中，该方法包括对受试者施用免疫疗法。在某些实施方案中，免疫疗法是过继细胞转移或检查点抑制剂。在某些实施方案中，本文公开的任何方法用于监测受试者中的免疫组库。
147.在某些实施方案中，当前公开的主题提供了用于鉴定至少一个tcr序列的方法。在某些实施方案中，至少一个tcr序列是tcrα序列、tcrβ序列或其组合。在某些实施方案中，该方法进一步包括制造可溶性tcr多肽。在某些实施方案中，本文公开的任何方法用于鉴定至
少一个tcr序列。
148.在某些实施方案中，当前公开的主题提供了颗粒的文库。在某些实施方案中，文库包括至少两个颗粒集合。在某些实施方案中，每个颗粒集合包含抗原肽、与抗原肽的身份可操作地相关联的条形码和至少一个识别标记。在某些实施方案中，至少一个识别标记在每个颗粒集合中是相同的。在某些实施方案中，每个不同的颗粒集合中有至少两个不同的识别标记。在某些实施方案中，至少一个识别标记是荧光团。在某些实施方案中，荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。在某些实施方案中，至少两个不同的识别标记是荧光团，其中荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
149.在某些实施方案中，当前公开的主题进一步提供颗粒。在某些实施方案中，颗粒包含至少一个多肽、条形码和识别标记。在某些实施方案中，多肽包含抗原肽、β2m肽和mhc肽。在某些实施方案中，条形码与抗原肽的身份可操作地相关联。在某些实施方案中，颗粒选自由以下各项组成的组：磁珠、琼脂糖珠、苯乙烯聚合物颗粒和葡聚糖聚合物颗粒。在某些实施方案中，识别标记是荧光团。在某些实施方案中，颗粒被链霉亲和素包被。在某些实施方案中，多肽被标记。
150.在某些实施方案中，当前公开的主题进一步公开了治疗受试者中癌症的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)制备多个颗粒，每个颗粒包含多个标记的多肽；(b)在适合t细胞与颗粒抗原特异性结合的条件下，使多个颗粒与来自受试者的多个t细胞接触；(c)分离与颗粒结合的t细胞并鉴定分离的t细胞的tcr基因序列；(d)制备包含同源臂和至少一个tcr基因序列的多核苷酸；(e)将多核苷酸重组到受试者t细胞的内源基因座中；(f)培养修饰的t细胞以产生t细胞群；和(g)将治疗有效数量的修饰的t细胞施用至受试者，从而治疗癌症。在某些实施方案中，多肽包含抗原肽、β2m序列、hla序列和可检测标记。在某些实施方案中，tcr基因序列是患者特异性的。在某些实施方案中，tcr基因序列位于同源臂之间。
151.在某些实施方案中，当前公开的主题进一步公开了修饰细胞的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)将同源重组(hr)模板核酸序列引入细胞中；和(b)将hr模板核酸重组到细胞的内源基因座中。在某些实施方案中，hr模板核酸包含：(a)与细胞的第一和第二内源序列同源的第一和第二同源臂；(b)通过本文公开的任何方法获得的t细胞受体(tcr)基因序列；和(c)位于tcr基因序列上游的第一2a编码序列和位于tcr基因序列下游的第二2a编码序列，其中第一和第二2a编码序列编码彼此密码子分歧的(codon
‑
diverged)相同氨基酸序列。在某些实施方案中，第一和第二内源序列与hr模板核酸的第一和第二同源臂同源。在某些实施方案中，tcr基因序列位于第一和第二hr臂之间。在某些实施方案中，2a
‑
编码序列是p2a
‑
编码序列。在某些实施方案中，hr模板进一步包含编码柔性接头的序列。在某些实施方案中，编码柔性接头的序列位于2a编码序列的紧上游。在某些实施方案中，柔性接头具有gly ser gly氨基酸序列。在某些实施方案中，hr模板进一步包含编码蛋白酶切割序列的序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列是弗林蛋白酶序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列是tev序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列在第二2a编码序列的上游。
152.在某些实施方案中，当前公开的主题进一步公开了包含修饰的细胞的组合物。在某些实施方案中，修饰的细胞包含整合到内源基因座中的外源核酸序列。在某些实施方案中，外源核酸序列包含：(a)tcr基因序列；和(b)位于tcr基因序列上游的第一2a编码序列和位于tcr基因序列下游的第二2a编码序列。在某些实施方案中，tcr基因序列是通过本文公
开的任何方法鉴定的。在某些实施方案中，第一和第二2a编码序列编码彼此密码子分歧的相同氨基酸序列。在某些实施方案中，2a
‑
编码序列是p2a
‑
编码序列。在某些实施方案中，外源核酸序列进一步包含编码柔性接头的序列。在某些实施方案中，编码柔性接头的序列位于2a编码序列的紧上游。在某些实施方案中，柔性接头具有gly ser gly氨基酸序列。在某些实施方案中，外源核酸进一步包含编码蛋白酶切割序列的序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列是弗林蛋白酶序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列是tev序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割序列在第二2a编码序列的上游。
153.附图简述
154.所公开的组合物和方法的这些和其他特征、方面和优点将通过以下描述和附图得到更好的理解，其中：
155.图1显示了示例性compact小基因的设计。ss指可选的信号序列；us1指第一通用靶标位点；neoe是指新表位，即抗原肽序列位点；us2是指第二通用靶标位点；l1是指可选的第一接头序列；beta2m是指β
‑2‑
微球蛋白结构域序列；l2是指可选的第二接头序列；mhc重链是指mhc重链等位基因；l3是指可选的第三接头序列；并且纯化簇是指具有生物素化序列、蛋白酶切割位点和亲和标签序列的可选的纯化簇。虽然图1显示了his6(seq id no:34)(6
‑
his标签(seq id no:34))作为亲和标签，但可以使用任何其他合适的亲和标签，包括但不限于不同长度的组氨酸标签(poly
‑
his标签)、hat标签、flag标签(或flag表位)、对任何用于纯化的抗体特异性的表位、半乳糖结合蛋白标签、荧光标签、gst标签、ha标签、halo标签、mbp标签、myc标签、poly
‑
asp标签、poly
‑
phe标签、蛋白质c、链霉亲和素/生物素标签、strep
‑
标签、蛋白质g或能够纯化compact多肽的任何其他蛋白质纯化标签。
156.此外，虽然图1显示使用镍树脂(参见图中的“ni”)来纯化带有his6标签的(seq id no:34)compact多肽，但其他his6(seq id no:34)亲和树脂已被使用。具体而言，锌树脂已被用于从溶液中成功纯化带有his6标签(seq id no:34)的compact多肽。钴和钙树脂是可以使用的另外两种示例性his6(seq id no:34)亲和树脂。
157.图2显示了示例性模块化现成平台的示意图，用于快速组装与所选mhc等位基因复合的抗原肽配体的文库。图2按出现顺序分别公开了seq id no:9、11和13。
158.图3是用所选的新表位序列替换mhc模板中的虚拟插入片段的示例性限制性消化克隆反应的示意图。虚拟插入片段(下划线的、粗体的；图中顶部序列)包含不同框架中的四个终止密码子和用于破坏未切割或重新连接的模板的独特限制性位点。插入片段任一侧的限制位点显示在框中。底部序列组显示了在虚拟插入片段被切割并与正确的neoe序列连接后的neoe插入片段。图3按出现顺序分别公开了seq id no:270
‑
274。
159.图4是在mhc模板中插入选择的新表位序列的示例性限制性消化克隆反应的示意图。新表位序列(下划线的、粗体的)作为引物合成，侧接两个不同的限制性位点(方框的)。在pcr反应中使用具有3’限制性位点的反向互补序列的通用引物以形成新表位序列的双链引物二聚体。新表位和mch模板载体二者的限制性消化允许连接反应以将选择的新表位序列插入mhc模板序列中。将连接反应转化到大肠杆菌中，并且从转化的大肠杆菌中制备的质粒用于哺乳动物生产细胞转染反应。图4按出现顺序分别公开了seq id no:275
‑
276、271
‑
274和277。
160.图5是在mhc模板中插入选择的新表位序列的限制性消化克隆反应的示例性替代
形式的图。合成具有部分5’和3’限制性位点的两个互补的neoe编码引物。将这些引物退火并模拟限制性消化的突出端。然后将预切载体(其突出端主要保留5’磷酸酯)与退火的neoe插入片段连接，并将连接产物转化到大肠杆菌中用于质粒生产。图5按出现顺序分别公开了seq id no:278
‑
279、271
‑
274和277。
161.图6是在mhc模板中插入选择的新表位序列的示例性基于pcr的方法的图。合成了两个互补的neoe编码引物，正向引物具有针对mhc模板中第二通用位点的3’序列；并且反向引物具有针对mhc模板中第一通用位点的互补序列的3’序列。这些引物与具有第一通用序列位点的mhc模板的5’片段以及具有第二通用位点和compact小基因其余部分的mhc模板的第二片段混合。第一pcr扩增循环产生两个核苷酸片段，一个片段编码具有下游新表位的第一通用位点区域，另一个编码新表位然后是compact基因的其余部分。然后将在独特的新表位序列重叠的这两个片段组装起来，并扩增和清理完整组装以进行转染。
162.图7显示了在7天时间过程中用compact基因(neo12)转染的30ml哺乳动物细胞中的总蛋白质表达和使用检测his
‑
标签的nta
‑
hrp试剂的蛋白质印迹。
163.图8显示了neo12 compact蛋白的ni
‑
nta亲和层析纯化的凝胶。pre代表粗裂解物，ft代表流穿，w代表洗涤，e代表洗脱的。
164.图9显示了纯化的neo12蛋白的大小排阻层析图。主要峰是neo12蛋白，次要峰是在生物素化步骤中添加的atp。
165.图10显示了类似于图8所示的纯化实验，使用0.7细胞培养体积。
166.图11显示了八种不同的neoe compact蛋白质的粗制和纯化蛋白质，每种蛋白质具有不同的抗原序列。图11按出现顺序分别公开了seq id no:11和13。
167.图12显示了图11的八种neoe compact蛋白的大小排阻层析谱。
168.图13a显示了与从质粒产生的neoe compact蛋白质(特别是neo12compact蛋白质)相比，使用图6中描述的pcr组装方法(线性扩增子)产生的neoe compact蛋白质(特别是neo12 compact蛋白质)。图13b显示了通过pcr组装方法产生的线性扩增子的dna凝胶。每个泳道包含具有不同新表位序列的compact小基因(特别是neo12 compact小基因)。
169.图14显示了链霉亲和素珠下拉测定以测试compact蛋白的完全生物素化。图14公开了“(his6)”作为seq id no:34。
170.图15显示了粗细胞裂解物中不同compact蛋白的生物素化，使用链霉亲和素
‑
hrp通过蛋白质印迹可视化。图15公开了“his6”作为seq id no:34。图15还按照出现顺序分别公开了seq id no:280、280
‑
281和281。
171.图16a、16b和16c显示了大肠杆菌中bira酶(图16b和16c)和tev蛋白酶(图16a)的产生和纯化。
172.图17显示了使用bira的compact蛋白的生物素化(泳道2)和使用tev蛋白酶的his6标签(seq id no:34)的切割(泳道3)。
173.图18显示了基于v5表达的用bira和v5转导的细胞的细胞分选。
174.图19显示了使用多聚化compact蛋白的t细胞的抗原特异性捕获。
175.图20显示了使用s88cβ2m compact蛋白的compact ntamer生产。
176.图21显示了cy5与s88c compact蛋白单体的偶联。
177.图22a显示了制造compact多核苷酸的克隆策略的示例图。图22b提供了从824个单
序列为seq id no:307,306,208,208,208,208,208,208和208，“tra.cdr3”序列为seq id no:308
‑
310,310
‑
312,312,312和312，“trb.cdr3”序列为seq id no:313
‑
314,304,304,303,305,305,305和305，以及“肽肿瘤”序列为seq id no:306,306,208,208,208,208,208,208和208。图37d提供了使用compact9 dextramer对impact分析进行验证筛选的示例。
193.图38a提供了从患者样品中分离的新抗原特异性tcr的总结。图38b提供了表格，该表格总结了til中发现的hal类型、癌症、靶标数量和tcr数量。
194.图39a显示了hcmv和ebv t细胞的抗原特异性。图39b显示了tcr命中数。
195.图40a显示了使用f5t细胞的四聚体、三聚体和dextramer分离方法的比较。图40b显示了使用neo12 t细胞的四聚体、三聚体和dextramer分离方法的比较。
196.图41a显示了使用pbmc样品和neo12 t细胞、cmv t细胞和m1wt细胞的三聚体和dextramer分离方法的比较。图41b显示了使用三聚体或dextramer时的平均条形码信噪比。
197.图42a显示了患者pact157外周血中新抗原特异性t细胞随时间的变化。图42a按出现顺序分别公开了seq id no:315
‑
317。图42b显示了患者pact132外周血中新抗原特异性t细胞随时间的变化。图42b按出现顺序分别公开了seq id no:318
‑
319。图42c显示了患者pact131外周血中新抗原特异性t细胞随时间的变化。图42c按出现顺序分别公开了seq id no:320
‑
323。
198.图43显示了来自一名患者的新抗原特异性t细胞的表型表征。
199.图44a显示针对pik3ca新抗原靶标分离的tcr克隆的功能表征。图44b显示针对pik3ca新抗原靶标分离的tcr克隆的功能表征。
200.图45提供了在患者pact135的抗pd
‑
1抗体治疗过程中收集的每个t细胞样品中每个cd8 t细胞的新抗原特异性t细胞的数量的总结。图45公开了“ktyfkpfhpk”作为seq id no:256和“yfkpfhpkf”作为seq id no:227。
201.图46显示了在cd4和cd8 t细胞二者中14个neo tcr的强t细胞基因编辑效率。
202.图47显示了在有和没有ifnγ预温育的情况下,在与neotcr t细胞同源(cognate)compact
‑
dextramer和黑色素瘤匹配的细胞系m489共培养时,neo tcr被内化。
203.图48显示源自患者pact135的neotcr t细胞表达活化标志物4
‑
1bb。
204.图49显示源自患者pact135的neotcr t细胞表达活化标志物ox40。
205.图50提供了与从pact135鉴定的所有neotcr t细胞共培养后肿瘤细胞汇合百分比的图。
206.图51a提供了与每个neotcr t细胞共培养后肿瘤细胞汇合百分比的单独图。图51b提供了与每个neotcr t细胞共培养后肿瘤细胞汇合百分比的单独图。
207.图52显示了与m489细胞共培养后tcr218 t细胞的ifnγ、il2和tnfα分泌。
208.图53显示了与m489细胞共培养后tcr221和tcr227 t细胞的ifnγ、il2和tnfα分泌。
209.图54显示了与m489细胞共培养后tcr222 t细胞的ifnγ和tnfα分泌。
210.图55显示了在有或没有ifnγ预处理的情况下,与m489细胞共培养后，tcr219,tcr220,tcr223,tcr224,tcr225,tcr228,tcr229,tcr232,tcr240,tcr241 t细胞的ifnγ分泌。
211.图56提供了从患者pact035中分离的新抗原特异性t细胞数量的总结。
212.图57a显示了kv1858细胞系中的hla
‑
a2表达。图57b显示了kv1832细胞系中的hla
‑
a2表达。图57c显示了sw620细胞系中的hla
‑
a2表达。图57d显示了转染的sw620细胞中的gfp表达。
213.图58显示了与对于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞共培养的tcr089 neotcr t细胞中的nur77表达。
214.图59a显示表达neotcr的t细胞杀死sw620纯合肿瘤细胞。图59b显示没有杀死野生型sw620细胞。
215.图60显示了tcr089杀死了对于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞，但不是野生型sw620细胞。
216.图61显示了在与对于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞共培养后tcr089 t细胞中的ifnγ分泌。
217.图62显示了impact分离技术的方法：从用检查点抑制剂治疗的患者中分离neoe特异性tcr，进行测序，鉴定肿瘤抗原，使用算法来选择新表位以使用compact多肽和impact分离技术进行筛选，并且捕获新表位特异性t细胞。
218.图63显示了来自对抗pd
‑
1治疗没有反应的患者的患者样品，患者的neoe
‑
hla复合物分解和所得的鉴定的tcr。图63公开了seq id no:324。
219.图64显示neotcr
‑
t细胞杀死自体黑色素瘤肿瘤细胞。
220.图65a显示了neotcr
‑
t细胞杀死自体肿瘤细胞的能力。图65b显示neotcr
‑
t细胞在与自体肿瘤细胞共培养时表达活化标志物。图65c显示neotcr
‑
t细胞在与自体肿瘤细胞共培养时分泌干扰素γ。
221.图66a显示neotcr t细胞疗法根除植入小鼠的肿瘤。图66b显示了在neotcr t细胞输注后第4天和输注后第35天小鼠血液中存在的人cd8t细胞数/ml。
222.图67a和67b说明了用于将新抗原特异性tcr构建体(neotcr)整合到tcrα基因座中的新抗原特异性tcr构建体设计。图67a说明了靶标tcrα基因座(内源性trac，上图)及其crispr cas9靶标位点(水平条纹，切割位点由箭头指定)，以及带有编码neotcr的多核苷酸的环状质粒同源重组(hr)模板(下图)，其在整合前位于左右同源臂(分别为“lha”和“rha”)之间。rnp：crispr/cas9复合物。图67b说明了tcrα基因座中整合的neotcr(上图)、转录和剪接的neotcr mrna(中图)以及表达的neotcr的翻译和加工(下图)。
223.详细说明
224.定义
225.除非另有说明，权利要求和说明书中使用的术语定义如下。
226.如本文所用，术语“抗原特异性t细胞”是指通过它们的t细胞受体(tcr)彼此区分的细胞，t细胞受体(tcr)赋予它们抗原特异性。
227.本文公开的组合物和方法的实施方案包括能够与同源t细胞配对的重组抗原
‑
mhc复合物。如本文所用，“抗原
‑
mhc”、“抗原
‑
mhc复合物”、“重组抗原
‑
mhc复合物”、“肽mhc”和“p/mhc”可互换使用，指在抗原结合沟中具有肽的主要组织相容性复合物。
228.如本文所用，“抗原”包括任何抗原，包括患者特异性抗原。
[0229]“抗原肽”和“抗原肽”以及“新表位”和“neoe”可互换使用，是指衍生自在感兴趣的细胞上鉴定的抗原(例如，如果它是肿瘤细胞，由肿瘤细胞表达的抗原)的肽，使用本文所述
的分子生物学技术将其掺入到compact多肽中。此外，如实施例中明确说明的，术语“新抗原序列”和“新抗原插入片段”可以具有与“抗原肽”和“抗原肽”以及“新表位”和“neoe”相同的含义。该术语还指能够结合mhc分子的肽或肽片段。
[0230]“抗原
‑
mhc复合物”和“抗原
‑
mhc”和“重组抗原
‑
mhc复合物”和“肽mhc”和p/mhc”和“新抗原
‑
mhc复合物”都可以互换使用，是指由hla/mhc重链、β2m链和抗原肽组成的三元复合物。
[0231]“抗ctla4抗体”抗体附着于ctla
‑
4并阻止其工作。这可以增强身体对癌细胞的免疫反应。包括伊匹单抗。包括ab154(arcus)、tiragolumab(genentech/roche)、bms
‑
986297(bms)、mk
‑
7684(merck)和etigilimab(oncomed)。除抗ctla4抗体外，ctla4抑制剂(大分子和小分子)可与任何neotcr产品联合使用。
[0232]
抗pd
‑
1抗体”和“结合pd
‑
1的抗体”和“抗pd
‑
1疗法”是指结合并且能够以足够的亲和力结合pd
‑
1的抗体，使得抗体可用作靶向pd
‑
1的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合或能够结合pd
‑
1的抗体能够阻断pd
‑
1和pd
‑
l1的相互作用并增强针对癌细胞的免疫反应。抗pd
‑
1抗体包括但不限于派姆单抗、纳武单抗和西米普利单抗。除抗pd1抗体外，pd1抑制剂(大分子和小分子)可与任何neotcr产品联合使用。
[0233]“抗pd
‑
l1抗体”和“结合pd
‑
l1的抗体”和“抗pd
‑
l1疗法”是指结合并且能够以足够的亲和力结合pd
‑
l1的抗体，使得抗体可用作靶向pd
‑
l1的诊断和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合或能够结合pd
‑
l1的抗体能够阻断pd
‑
1和pd
‑
l1的相互作用并增强针对癌细胞的免疫反应。抗pd
‑
l1抗体包括但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、avelumab和度伐鲁单抗(durvalumab)。除抗pd
‑
l1抗体外，pd
‑
l1抑制剂(大分子和小分子)可与任何neotcr产品联合使用。
[0234]“附接部分”是指可用于将多核苷酸或多肽附接到化学或生物基质的任何化学或生物部分。如本文所用，附接部分用于将多核苷酸或多肽附接至颗粒。
[0235]“检查点抑制剂”是指阻断由一些类型的免疫系统细胞(例如t细胞)和一些癌细胞产生的某些蛋白质的药物类型。这些蛋白质有助于使免疫反应受控制，并可以防止t细胞杀死癌细胞。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统的“刹车”被松开，并且t细胞能够更好地杀死癌细胞。在t细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括pd
‑
1/pd
‑
l1和ctla
‑
4/b7
‑
1/b7
‑
2。一些免疫检查点抑制剂用于治疗癌症。
[0236]“条形码”和“条形码序列”和“核苷酸条形码”和“条形码化的多核苷酸”和“neoid”和“neoid条形码”可以互换使用并且指用于标记和鉴定特定肽的核苷酸序列。
[0237]“条形码化的颗粒”是指附有条形码的颗粒。
[0238]“beta
‑2‑
微球蛋白”、“β
‑2‑
微球蛋白”、“β2m”可互换使用且具有相同含义。
[0239]“compact”和“compact构建体”可互换使用，并表示多核苷酸或多肽，基于如何使用该术语的上下文，包括新抗原和mch复合物。compact还可包含信号序列、通用靶位点、接头和纯化簇。图1显示了compact的非限制性代表。
[0240]“compact文库”和“compact
‑
neoid文库”可互换使用并表示一个或多个compact。
[0241]“compact小基因”或“compact多核苷酸”或“compact基因”或“compact多核苷酸分子”可互换使用并且意指编码compact蛋白的核酸序列。
[0242]“compact蛋白”或“compact多肽”或“compact多肽分子”是指表达为通用靶序列、
抗原肽、第二通用靶序列、β2
‑
微球蛋白和mhci类重链的单一多肽融合体的mhc分子，其包含形成mhc展示部分的α1、α2和α3结构域。本文所述的compact多肽还可任选地在compact多肽的任何或所有单独组分之间包含接头序列。图1的compact小基因中显示了在compact多肽中放置可选接头序列的示例。
[0243]“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。
[0244]“表位”或“表位标签”是指亲和标签，其中肽序列被基因工程改造为多肽并且其中抗体可以与肽序列结合。表位标签包括但不限于v5标签、myc标签、ha标签、spot标签、ne标签和所有其他可用作亲和标签的表位。表位标签可以由连续的氨基酸序列(线性表位)形成或包含非连续的氨基酸(构象表位)，例如，由于抗原的折叠而在空间上接近。“接头”是指用于连接融合蛋白中的组分的任何氨基酸序列(或编码此类氨基酸序列的核酸序列)。当应用于compact蛋白(融合蛋白)时，接头可用于例如将neoe连接到β2m或将β2m连接到mhc重链或将mhc重链连接到纯化簇。
[0245]“宿主细胞”和“生产细胞”均指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而与传代次数无关。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可以包含突变。本文中包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
[0246]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些方面中，个体或受试者是人。
[0247]“分离的”核酸指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
[0248]“mhc复合物”是指包含β2
‑
微球蛋白和mhc重链的复合物。mhc复合物可以是多肽或编码这种多肽的多核苷酸。mhc复合物包含在所有compact蛋白中，并且编码这种β2
‑
微球蛋白和mhc重链的多核苷酸包含在所有compact小基因中。图1和图2显示了在compact小基因中包含mhc复合物的两个示例。例如，图11显示了包含mhc i类重链复合物的compact蛋白的蛋白质印迹。
[0249]“mhc展示部分”是指包含α1、α2和α3结构域的mhc i类重链。
[0250]“mhc”是指主要组织相容性复合物，它是一组基因，其编码对获得性免疫系统或识别外来分子必不可少的细胞表面蛋白。mhc分子的主要功能是与外源抗原(包括内源性细胞上呈递的对生物体(例如人类)造成伤害的抗原)结合，并将它们展示在细胞表面以供适当的t细胞识别。mhc家族的三个亚组是i类、ii类和iii类。
[0251]“mhc i类”是指包含beta
‑2‑
微球蛋白亚基的mhc家族的亚组。
[0252]“新抗原”是指具有至少一个改变的抗原，该改变使得新抗原或新抗原的呈递与其对应的野生型抗原不同，例如，所述改变为多肽序列中的突变，差异是翻译后修饰或表达水平的差异。“新抗原”和“肿瘤新抗原”是指细胞上的特定抗原，可用作识别靶标进行杀伤。当应用于癌症和肿瘤时，新抗原是对肿瘤或癌症具有特异性的抗原。当应用于病原体和病原体感染的细胞时，新抗原是对病原体或病原体感染的细胞具有特异性的抗原。“肿瘤新抗原”是指源自肿瘤或癌症，例如源自患者肿瘤的新抗原。
[0253]“neotcr产品”和“neotcr t细胞疗法”以及“neotcr t细胞治疗”和“neotcr t细胞”可互换使用，并且均指表达识别新表位的tcr的基因工程改造的t细胞，其中所述新表位已使用comppact多肽和多核苷酸以及impact分离技术鉴定并设计。
[0254]“neo12”和“neo12蛋白”是指示例性新表位。
[0255]“ntamer”是指包含compact多肽的复合物。
[0256]“现成的”是指，就compact多核苷酸和由其制备的compact多肽的设计而言，包含beta
‑2‑
微球蛋白、mhc重链等位基因以及在此类构建体中插入新表位的位置的compact小基因。在某些实施方案中，构建体从5'到3'的顺序是1)新表位，2)beta
‑2‑
微球蛋白，和3)mhc重链等位基因。在某些实施方案中，信号序列、通用靶位点(例如限制酶位点)、柔性接头和纯化簇也被掺入构建体中。在某些实施方案中，具有附加元件的所述构建体的结构是图2中公开的构建体。
[0257]“可操作地关联”是指，就颗粒的构建而言，使用给定的compact(其中表达了特异性的新抗原)构建的每个颗粒与该颗粒独有的一个或多个条形码相关联。通过这种方式，下游测序确定哪些条形码与特异性细胞结合，可用于确定哪个compact(以及哪个新抗原)负责该结合。
[0258]“颗粒”、“颗粒集合”、“颗粒对”和“不同的颗粒集合”均表示，就术语“颗粒”而言，是指包含能够被特异性分选或分离的基质并且可以将compact的组分(以及额外的多肽、多核苷酸和化学物质)附接到其上的compact的核心。在某些实施方案中，“颗粒集合”是指多个颗粒。
[0259]
术语“药物组合物”或“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0260]“药学上可接受的载体”是指药物组合物或制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
[0261]
如本文所用，“多核苷酸”或“核酸”可互换使用并且包括含有核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为5'至3'。多核苷酸是指任何dna(包括但不限于cdna、ssdna和dsdna)和任何rna(包括但不限于ssrna、dsrna和mrna)，还包括dna和rna的合成形式以及包含这些分子的两种或多种的混合聚合物。本领域技术人员可以理解指的是哪种形式，例如，基于使用多核苷酸的上下文。多核苷酸可以是线性的或环状的。此外，术语多核苷酸包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。多核苷酸可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。多核苷酸涵盖适合作为在体外和/或体内直接表达本发明多肽的载体的dna和rna分子。
[0262]“增殖性病症”是指多细胞生物体中一个或多个细胞亚群的过度细胞增殖，导致对所述多细胞生物体的伤害(即不适或预期寿命降低)。细胞增殖病症可发生在不同类型的动物和人类中。如本文所用，增殖性病症包括瘤性病症。
[0263]“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
[0264]“纯化簇”是指compact的可选部分，其包括允许compact纯化的基因编码元件。
[0265]“信号序列”是指存在于新合成的蛋白质的n
‑
末端处的短肽，其注定朝向分泌途径。在compact设计和生产中可以包含信号序列。
[0266]
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变被治疗的个体疾病的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发，缓和症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和缓和或改善的预后。在一些方面中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0267]“通用靶位点”、“通用靶序列”和“通用序列”可以互换使用，并且意指可以被限制性内切酶切割的多核苷酸序列，或可以用于引物的结合和所需序列扩增的引物结合位点。
[0268]“载体”、“表达载体”和“表达构建体”可以互换使用并且是指用于将异源dna引入细胞以用于其表达或复制的离散元件。如本文所用，载体可被工程化改造并用于体内或体外表达由插入载体中的编码序列编码的多肽基因产物。
[0269]“年轻的”或“年轻”在与t细胞相关时是指记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆细胞(t
cm
)。这些细胞在特定激活时具有t细胞增殖，并且能够进行多次细胞分裂。它们还具有在重新输注后植入的能力，在暴露于其同源抗原后迅速分化为效应t细胞并靶向并杀死肿瘤细胞，以及持续进行癌症监测和控制。
[0270]
如本文所用，术语“条形码化的t细胞”、“配对的t细胞”、“t细胞结合纳米颗粒”和“t细胞配对的抗原mhc复合物”是指具有t细胞受体的t细胞的复合物，所述t细胞受体与条形码化的np
‑
抗原
‑
mhc复合物(即颗粒
‑
compact复合物)上的mhc分子呈递的抗原肽结合。
[0271]
如本文所用，“抗体”或“多个抗体”以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。“抗体片段”指除不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab’、fab
’‑
sh、f(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv和scfab)；单结构域抗体(dab)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0272]
术语“体内”是指在活生物体(包括细胞)中发生的过程。
[0273]
如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
[0274]
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“百分比序列同一性”是指两个或多个序列或子序列，当比较并比对以获得最大对应性时，它们具有相同核苷酸或氨基酸残基的特定百分，如使用下述序列比较算法之一(例如，blastp和blastn或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查所测量的。根据应用，“百分比序列同一性”可以存在于被比较序列的一个区域上，例如在一个功能域上，或者备选地，存在于待比较的两个序列的全长上。
[0275]
为了进行序列比较，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，基于制定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0276]
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过pearson&lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施(gap,bestfit,fasta和tfasta，其在wisconsin genetics软件包中,genetics computer group,575science dr.,madison,wis.)，或通过目视检查(参见ausubel等人，如下)。
[0277]
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是blast算法，其描述于altschul等人,j.mol.biol.215:403
‑
410(1990)中。执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
[0278]
必须注意的是，如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
[0279]
其他解释性公约
[0280]
本文所述的范围被理解为该范围内的所有值的简写，包括所述的端点。例如，1至50的范围被理解为包括任何数目或其分数、数目或其分数的组合、或来自由1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49和50组成的组(包括来自组的任何数目的分数)的子范围。
[0281]
引言
[0282]
t细胞介导的免疫的特征在于抗原特异性细胞毒性t细胞的活化，所述细胞毒性t细胞能够诱导在其表面上主要组织相容性复合物(mhc)中展示抗原的细胞的死亡。这些展示载有抗原的mhc复合物的细胞包括病毒感染的细胞、带有细胞内细菌的细胞、具有内化的或吞噬的细胞外蛋白质来源的细胞以及展示肿瘤抗原的癌细胞。
[0283]
天然i类mhc重链包含约350个氨基酸；天然β2
‑
微球蛋白包含约100个氨基酸，并且i类抗原肽通常具有约7至约15个氨基酸的长度。i类重链由主要组织相容性复合体的基因编码，在人类中称为hla
‑
a、
‑
b和
‑
c，在小鼠中称为h
‑
2k、d和l。i类重链和β2
‑
微球蛋白分别编码在不同的染色体上。抗原肽通常由来自蛋白质来源的细胞加工，例如病毒、细菌或癌细胞。已鉴定出由人类hla
‑
a、
‑
b和
‑
cmhc基因以及鼠h
‑
2k、d和lmhc基因编码的多肽的不同变体。
[0284]
本文公开的方法的实施方案涉及制造单分子的方法，其中选定的新抗原与包含β2
‑
微球蛋白(β2m)和mhc重链的mhc复合物连接。不同的mhc重链可以连接到β2m分子上，形成不同数量的mhc模板。本文公开的通过利用新表位插入位点(也称为新抗原插入位点)侧翼的通用靶序列通过限制性消化或基于pcr的组装将新抗原插入mhc模板的方法导致能够以高通量方法构建不同新抗原
‑
mhc复合物的文库，其可以针对特定患者进行个性化。这些复合物被称为“compact蛋白”，然后可以连接到例如颗粒、条形码颗粒或表面，用于分离和鉴定靶向患者特异性新抗原的患者特异性t细胞群。2018年3月8日提交的pct/us2018/21611中公开了连接抗原
‑
mhc复合物的方法和此类复合物的用途，通过引用将其整体并入本文。
[0285]
核苷酸和肽组合物
[0286]
mhc复合物
[0287]
简而言之，如本文所用，compact多肽是指表达为通用靶序列、抗原肽、第二通用靶序列、β2
‑
微球蛋白和mhci类重链的单一融合多肽的mhc分子，其包含形成mhc展示部分的α1、α2和α3结构域。本文所述的compact多肽还可任选地在compact多肽的任何或所有单独组分之间包含接头序列。图1的compact小基因中显示了在compact多肽中放置可选接头序列的示例。mhc展示部分可包括重组mhc分子。2019年4月2日提交的国际申请pct/us2019/025415中描述了单个compact多肽和compact多肽分子文库的设计和制造，该申请通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，compact多肽可包含二硫化物阱，如美国公开号2009/0117153和美国公开号2008/0219947中所述；其中每个文献都以引用方式并入本文。由compact蛋白形成的抗原
‑
mhc复合物导致抗原的展示，使得它们能够被同源tcr分子识别。在一些实施方案中，mhc复合物可以是与cd8阳性(cd8+)t“杀伤”细胞配对的mhc i类(mhc i)复合物。在一些实施方案中，mhc复合物可以是与cd4阳性(cd4+)t细胞配对的mhc ii类(mhc ii)复合物。
[0288]
在一些实施方案中，compact的mhc i类重链序列可以包括单个氨基酸置换、添加和/或缺失，例如用除脯氨酸之外的非芳香族氨基酸置换tyr
‑
84。在这些实施方案中，氨基酸置换可以是由标准遗传密码编码的任何氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸或甘氨酸，或者可以是修饰的或不常见的氨基酸。在一个实施方案中，compact的mhc i类重链序列包含酪氨酸84到丙氨酸的置换。在另一个实施方案中，compact的mhc i类重链序列包含tyrosine
‑
84到半胱氨酸的置换。
[0289]
β2
‑
微球蛋白(β2m)可以包括重组β2m分子。在一些实施方案中，β2m序列可以包括如上所述的单个氨基酸置换、添加和/或缺失。在一个实施方案中，该置换包括丝氨酸
‑
88到半胱氨酸的置换。在一个实施方案中，该置换可以是将β2m的任何天然存在的非半胱氨酸氨基酸置换为半胱氨酸，其中该置换不会负面影响compact多肽内β2m的功能，并且该置换允许硫醇
‑
反应性部分的缀合。例如，可以通过使用本领域技术人员已知的诱变技术通过蛋白质的半胱氨酸筛选来实现此类置换。此类硫醇反应性部分可用于检测β2m或整个compact多肽。在某些实施方案中，硫醇反应性部分是硫醇反应性染料(荧光团)缀合物，其允许使用compact测量tcr
‑
compact结合的动力学参数(参见例如实施例8)。在某些实施方案中，硫醇反应性部分是包含巯基反应性交联剂反应性基团的染料(荧光团)，包括但不限于马来酰亚胺、碘乙酰胺或其衍生物、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物和所有其他硫醇反应性缀合配偶体(参见，例如haugland,2003,molecular probes handbook of fluorescent probes and research chemicals,molecular probes,inc.；brinkley,1992,bioconjugate chem.3:2；garman,1997,non
‑
radioactive labelling:a practical approach,academic press,london；means(1990)bioconjugate chem.1:2；hermanson,g.in bioconjugate techniques(1996)academic press,san diego,pp.40
‑
55,643
‑
671)。
[0290]
通用序列
[0291]
抗原肽通常侧接通用序列或其部分。这些序列允许用于在多核苷酸mhc模板中替换或插入抗原肽编码核苷酸的快速、高通量方法。通用序列可以包含用于基于限制性消化的克隆的限制性位点。示例性限制性位点包括但不限于nco1，bamhi，blpi，bspei，bstbi，xbal，hindiii，ecori，apai，noti，不存在于β2m、mhc重链、neoe、信号序列(如果存在)纯化
簇(如果存在)或其任何组分的融合体(包括任选的接头序列)的任何限制性位点，以及它们的任何组合。或者，通用序列可以是引物结合位点。本领域已知的通用引物序列可以用于本文公开的组合物和方法中，或者该序列可以不同于先前描述的通用引物序列并且可以被设计成促进特异性结合/扩增并消除非特异性结合/扩增。通用序列的长度可为4
‑
50之间、4
‑
15之间、15
‑
40之间、15
‑
35之间、15
‑
30之间、20
‑
40之间、25
‑
40之间或30
‑
40个核苷酸之间。通用序列的长度可为至少4、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸。在一些实施方案中，通用靶序列的长度为4
‑
8个核苷酸。在其他实施方案中，通用靶序列的长度在9
‑
25个核苷酸之间。在其他实施方案中，通用靶序列的长度在25
‑
35个核苷酸之间。在其他实施方案中，通用靶序列的长度为至少约15个核苷酸。在某些方面，一种或多种通用靶序列不存在于被操作的遗传材料中，例如以便减少或消除脱靶效应和/或增加特异性。
[0292]
接头
[0293]
在各种实施方案中，compact可以包含插入在抗原肽区段和β2
‑
微球蛋白区段之间的第一柔性接头。这种接头可以从抗原肽区段的羧基末端延伸并将抗原肽区段的羧基末端连接到β2
‑
微球蛋白段的氨基末端。在非限制性实例中，当表达compact时，连接的肽配体可折叠到结合沟中，产生功能性compact蛋白。在各种实施方案中，接头是至少约10个氨基酸和多至约15个氨基酸。在各种实施方案中，接头为4和32个氨基酸之间。
[0294]
在各种实施方案中，compact可以包含插入在β2
‑
微球蛋白区段和mhc重链区段之间的第二柔性接头。此类接头可从β2
‑
微球蛋白区段的羧基末端延伸并将β2
‑
微球蛋白区段的羧基末端连接至mhc重链区段的氨基末端。在非限制性实例中，当表达compact时，β2
‑
微球蛋白和mhc重链可折叠到结合沟中，产生可在促进t细胞扩增中起作用的分子。在各种实施方案中，该接头可包含至少约15个氨基酸，多至约20个氨基酸。在各种实施方案中，接头是至少约10个氨基酸和多至约15个氨基酸。在各种实施方案中，接头为4和32个氨基酸之间。
[0295]
在各种实施方案中，compact可包含插入在mhc重链区段和纯化簇之间的第三柔性接头。此类接头可从mhc重链区段的羧基末端延伸并将其连接到纯化簇的氨基末端。在各种实施方案中，接头是至少约10个氨基酸和多至约15个氨基酸。在各种实施方案中，接头为4和32个氨基酸之间。在一些实施方案中，接头仅为2或3个氨基酸。
[0296]
在某些实施方案中，相同的接头可用于第一和第二接头，并且任选地第三接头(如果存在)。在某些实施方案中，相同的接头用于第一、第二和第三接头。在某些实施方案中，所有三个接头都是(g4s)4接头(seq id no:19)。在某些实施方案中，所有三个接头都是(g3s)n接头(seq id no:201)。在某些实施方案中，所有三个接头都是(gsggs)n接头(seq id no:11)。
[0297]
在某些实施方案中，所有三个接头都是(gcggs)n接头(seq id no:13)。
[0298]
在某些实施方案中，不同的序列用于第一和第二接头中的每一个，和任选地第三接头(如果存在)。
[0299]
在某些实施方案中，第一、第二和任选的第三接头中的两个是相同的，并且一个是不同的。
[0300]
可以使用本领域已知的任何合适的柔性接头序列。合适的接头序列包括但不限于
包含ggggs(g4s)(seq id no:9),gggs(g3s)(seq id no:201),gsggs(seq id no:11)或gcggs(seq id no:13)序列基序的重复单元的甘氨酸
‑
丝氨酸序列。在某些实施方案中，可切割接头可用于第一、第二和第三接头中的任一个。在某些实施方案中，可切割接头仅用于第一、第二或第三接头。在某些实施方案中，可切割接头仅用于第一接头。在某些实施方案中，可切割接头仅用于第二接头。在某些实施方案中，可切割接头仅用于第三接头。
[0301]
在某些实施方案中，接头(第一、第二和/或第三)可选自包括刚性或柔性较小的接头的组。
[0302]
信号序列
[0303]
在各种实施方案中，compact多核苷酸和多肽包含信号序列和信号肽。在一个实施方案中，信号序列是来自人类生长激素(hgh)的信号序列。也可以使用额外的信号序列，包括但不限于来自β2m的信号序列，或本领域已知的任何其他真核或原核信号序列。可以使用将compact蛋白引导至分泌途径(用于从细胞中分泌compact)的任何信号序列。
[0304]
在某些实施方案中，信号序列包含seq id no:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，信号序列包含seq id no:1的核酸序列。
[0305]
信号序列的长度可以在70和80个核苷酸之间。信号序列的长度可以在40
‑
90,40
‑
60,45
‑
70,50
‑
80,60
‑
90,55
‑
70,60
‑
80或70
‑
80个核苷酸之间。信号肽的长度可以在10
‑
30,10
‑
20,15
‑
30或20
‑
30个氨基酸之间。
[0306]
启动子
[0307]
compact多核苷酸组合物可进一步包含用于将编码的多核苷酸转录成可由宿主细胞翻译的mrna转录物的启动子。启动子的来源可以是原核、病毒或真核(例如但不限于哺乳动物)。可以使用用于细胞中基因转录的任何合适的启动子。在某些实施方案中，可以使用真核启动子。在某些实施方案中，真核启动子的类型是组成型启动子、诱导型启动子或特异性启动子。在某些实施方案中，真核启动子是ef1a、巨细胞病毒(cmv)、cag、pgk、re、u6或uas启动子。在某些实施方案中，可以使用原核启动子。在某些实施方案中，原核启动子的类型是组成型启动子、需要特定聚合酶(例如，t7或sp6 rna聚合酶)存在的组成型启动子、在不存在阻遏物的情况下是组成型的并且在存在诱导剂的情况下是诱导型的启动子(例如，但不限于，在不存在lac阻遏物的情况下是组成型但可以由iptg或乳糖诱导的lac启动子)、诱导型启动子、阻遏型启动子或调节型启动子。在某些实施方案中，原核启动子是t7,sp6,lac,arabad,trp或ptac启动子。在某些实施方案中，可以使用病毒启动子。在某些实施方案中，病毒启动子的类型是aav启动子或sv40启动子。
[0308]
在一些实施方案中，compact多核苷酸包含sv40或任何病毒启动子。在某些实施方案中，取决于细胞系和试剂，强病毒启动子可能是有益的。
[0309]
在一些实施方案中，compact多核苷酸包含cmv启动子。
[0310]
亲和标签
[0311]
compact多核苷酸组合物可以进一步包含编码亲和标签或表位标签的至少一个序列。在一些实施方案中，compact多核苷酸包含至少两个亲和标签或表位标签序列。任何合适的亲和标签或表位标签可用于compact多核苷酸或多肽中。此类表位标签包括但不限于avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素标签)、strep标签、多组氨酸(his6)
‑
标签(seq id no:34)、flag
‑
标签、ha
‑
标签和myc
‑
标签。多核苷酸compact基因中的序列被翻译成
compact多肽中的肽。这些表位标签可用于亲和层析纯化或表达的compact多肽的定量。例如，his6标签(seq id no:34)可用于通过ha
‑
标签结合亲和层析纯化compact蛋白。在某些实施方案中，金属离子树脂可用于纯化ha标签化的蛋白质。在某些实施方案中，ni2+(镍)树脂、co2+(钴)树脂、cu2+(铜)树脂、ca2+(钙)树脂、zn2+(锌)树脂或其任意组合可用于纯化ha标签化的蛋白质。在某些实施方案中，ni2+树脂用于纯化ha标签化的compact蛋白。在某些实施方案中，ni2+和zn2+树脂的混合物用于纯化ha标签化的compact蛋白。在某些实施方案中，树脂是固定化金属亲和层析树脂(imac)。在某些实施方案中，金属离子通过螯合配体与树脂基质偶联。在某些实施方案中，金属离子用次氮基三乙酸(nta)或亚氨基二乙酸(ida)偶联到树脂基质上。
[0312]
此外，avitag编码已知的生物素化位点，该位点被bira酶识别。在蛋白质中包含该肽序列允许通过bira的酶促修饰对该序列进行生物素化。因此，包含avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素标签)序列和his6标签(seq id no:34)的compact多肽可以被生物素化、通过金属亲和层析(例如ni
‑
nta亲和层析或本文所述的任何其他金属亲和树脂)经由his6标签(seq id no:34)纯化,以及通过使用链霉亲和素或其他抗生物素蛋白试剂的生物素可视化评估所纯化蛋白质的纯度或数量。在一些实施方案中，compact多核苷酸包含avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素标签)序列。在一些实施方案中，compact多肽包含avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素)表位。在一些实施方案中，compact多核苷酸包含his6序列(seq id no:34)。在一些实施方案中，compact多肽包含his6表位(seq id no:34)。在一些实施方案中，compact多核苷酸包含avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素)序列和his6序列(seq id no:34)。在一些实施方案中，compact多肽包含avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素)表位和his6表位(seq id no:34)。
[0313]
蛋白酶切割位点
[0314]
compact多核苷酸组合物还可包含编码纯化簇中蛋白酶切割位点的序列。该切割位点可以编码在第一和第二亲和标签序列之间，并且一旦compact已经表达并经过一轮纯化，就允许从compact蛋白上切割第二亲和标签。可以使用本领域已知的任何合适的蛋白酶切割位点，包括但不限于被tev、凝血酶、因子xa、肠肽酶和鼻病毒3c蛋白酶等识别的切割位点。在一个实施方案中，蛋白酶切割位点核苷酸序列编码tev切割位点。在另一个实施方案中，compact多肽包含tev蛋白酶切割位点。
[0315]
polya尾
[0316]
compact多核苷酸组合物可进一步包含聚腺苷酸化(polya)尾。可以使用真核(包括哺乳动物)或原核polya序列基序。当通过pcr组装compact多核苷酸以直接转染到宿主细胞中时(例如，不在表达构建体或载体的情况下)，可以包括该序列。任何合适的polya尾和序列基序可用于compact多核苷酸中，包括但不限于sv40、hgh、bgg和rbglob序列的polya尾。此类序列包括序列基序aauaa。在一个实施方案中，compact多核苷酸包含bhg polya尾序列。
[0317]
抗原序列
[0318]
抗原序列(即，compact多肽的新表位部分被设计以结合的新抗原的序列)的长度可以是20
‑
60之间、20
‑
30之间、25
‑
35之间、20
‑
45之间、30
‑
45之间、40
‑
60之间或45
‑
60个核苷酸之间。抗原肽可以是或源自外源性抗原、内源性抗原(包括异源、自体和同源抗原)或自
身抗原。抗原肽可以是或源自起源于外源性抗原然后随后变成内源性抗原(例如，细胞内病毒)的抗原。抗原肽可以是或源自肿瘤抗原、新抗原、肿瘤新抗原、病毒抗原、细菌抗原、磷酸抗原或微生物抗原。在一个实施方案中，抗原肽是新抗原。抗原肽可以选自患者数据并且可以包含一个或多个体细胞突变。
[0319]
为了制造具有多个新表位并进而具有多个compact多肽的包容性compact文库，需要预测和鉴定抗原序列。抗原肽的预测可以包括预测算法并且其可以被设计为预测抗原肽或新抗原与mhc等位基因的结合。抗原肽的预测在下面进一步讨论。
[0320]
在一些实施方案中，编码抗原肽的核苷酸序列的长度为20
‑
60之间、20
‑
30之间、25
‑
35之间、20
‑
45之间、30
‑
45之间、40
‑
60之间或45
‑
60个核苷酸之间。在其他实施方案中，编码抗原肽的核苷酸序列的长度在20
‑
30个核苷酸之间。在一些实施方案中，抗原肽的长度为7
‑
15个氨基酸，7
‑
10,8
‑
9,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸。
[0321]
生物素化
[0322]
本文所述的compact蛋白可以通过任何合适的方法进一步生物素化。一种这样的方法利用bira生物素
‑
蛋白质连接酶并且是可商购的。称为avitag序列(glndifeaqkiewhe(seq id no:30))的特定氨基酸序列在目标蛋白质中编码。将bira连接酶、d
‑
生物素和atp添加到含有目标蛋白质的反应混合物中。bira将生物素与avitag序列中的赖氨酸共价连接，从而使目标蛋白质生物素化。然后可以纯化新的生物素化蛋白质并用于下游应用。也可以使用本领域已知的使蛋白质生物素化的其他方法。为清楚起见，任何适用的抗生物素蛋白/链霉亲和素序列都可用于compact蛋白质制备。
[0323]
表达构建体和载体
[0324]
可将compact多核苷酸分子插入到表达构建体或表达载体中，例如用于质粒(以增加编码compact多核苷酸的表达构建体或表达载体的数量用于蛋白质生产)和蛋白质生产。表达构建体或表达载体可以是真核、原核或病毒表达载体。可以使用本领域已知的任何合适的表达构建体或表达载体，包括细菌表达质粒，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌质粒；真核表达载体，如哺乳动物表达载体或酵母表达载体；或病毒载体，例如腺病毒表达载体、慢病毒表达载体、痘苗表达载体或杆状病毒表达载体。哺乳动物表达构建体或表达载体可用于(例如，转染)培养的哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(cho)、j558、nso、sp2
‑
o、hek293、heck293t、expi293、hela或cho、hek293、expi293或hela细胞系的任何衍生物或修饰细胞系，以及任何其他合适的哺乳动物细胞系。哺乳动物表达构建体或表达载体可用于原代哺乳动物细胞系，例如直接从生物体(例如，人)获得或收集(例如，从人)，冷冻，然后根据需要解冻的免疫细胞或肿瘤细胞。除了哺乳动物表达载体和表达构建体之外，适当时，真核表达载体和表达构建体可用于(例如，转染)昆虫细胞系例如sf9或sf12(或其任何衍生物或修饰物)或酵母细胞系例如作为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(或其任何衍生物或修饰物)。此外，表达构建体或表达载体可包含核苷酸条形码。每个表达构建体或载体的核苷酸条形码可以是独特的。在一些实施方案中，可以将编码信号序列、β
‑2‑
微球蛋白和mhc等位基因的核苷酸序列连接到具有非编码或模拟抗原插入序列的表达构建体或表达载体中。然后可以通过适当的克隆技术(例如限制性消化)去除该非编码抗原插入序列，并通过连接或任何其他适当的克隆技术插入所需的抗原序列(在本例中为清楚起见，抗原序列是指新抗原序列)。
[0325]
在一些方面，本文提供了包含两个或更多个compact多肽的compact文库。通过在表达构建体或表达载体中编码两个或多个compact多肽来创建此类文库。在某些实施方案中，每个表达构建体或表达载体包含单个compact多核苷酸。在某些实施方案中，表达构建体或表达载体的数量(每个表达构建体或表达载体可以是相同的表达构建体或表达载体)与不同compact多核苷酸的数量相同。在某些实施方案中，使用相同或不同的通用靶位点将compact多核苷酸插入到表达构建体或表达载体中。在其他方面，本文提供包含两个或多个mhc的mhc文库。此类文库是通过在表达构建体或表达载体中编码两个或多个mhc多肽来创建的。在其他方面，本文提供包含两个或更多个hla的hla文库。通过在表达构建体或表达载体中编码两个或多个hla多肽来创建此类文库。
[0326]
宿主细胞
[0327]
在另一方面，本文提供包含本文所述的多核苷酸分子或表达构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是本领域已知的任何合适的宿主细胞，包括但不限于细菌细胞例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，或真核宿主细胞如中国仓鼠卵巢(cho)、j558、nso、sp2
‑
o、hek293、hek293t、expi293、hela、昆虫细胞系(例如sf9或sf12)、酵母细胞例如毕赤酵母、基于构建体和载体选择在科学上合理的其他合适的真核或原核细胞系，或任何此类细胞系的任何衍生物或修饰物。宿主细胞也可以稳定表达生物素化酶bira。宿主细胞可以是原代细胞或永生化细胞系。
[0328]
在一些实施方案中，多核苷酸被整合到细胞基因组中。在一些实施方案中，多核苷酸是染色体外的。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞选自干细胞、肿瘤细胞、永生化细胞和胎儿细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细胞表达bira蛋白或其片段。
[0329]
在某些实施方案中，可以将本文所述的任何表达构建体或表达载体插入宿主细胞中(例如，通过转染、转化或基于宿主细胞类型的类似过程插入)用于多肽生产。在某些实施方案中，如上所述的编码compact多肽文库、mhc或hla的表达构建体或表达载体可以插入宿主细胞中(例如，通过转染、转化或基于宿主细胞类型的类似过程插入)用于多肽生产和纯化。在某些实施方案中，如下所述的编码compact多肽文库的表达构建体或表达载体可以插入宿主细胞中(例如，通过转染、转化或基于宿主细胞类型的类似过程插入)用于多肽生产和纯化。
[0330]
文库
[0331]
在某些实施方案中，文库包含两个或更多个不同的compact多核苷酸分子。在某些实施方案中，文库包含两个或更多个不同的多肽分子。在某些实施方案中，文库包含附接至颗粒的两个或更多个不同的compact多肽分子。
[0332]
在某些实施方案中，1)compact多核苷酸文库，2)compact多肽文库或3)与颗粒文库附接的compact多肽中的任何一种在这样的各自文库中包含多于两个各自的(respective)分子。在某些实施方案中，1)compact多核苷酸文库、2)compact多肽文库或3)与颗粒文库附接的compact多肽中的任何一个，对此类各自文库中各自分子的数量没有上限，并且反过来包含尽可能多各自的compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在某些实施方案中，上限由检测到的肿瘤新抗原的数量确定。在某些实施方案中，
上限由基于检测到的肿瘤新抗原鉴定的潜在新表位的数量确定。在某些实施方案中，上限由算法确定。
[0333]
文库可包含2至1000个compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在一些实施方案中，文库包含2
‑
900,2
‑
800,2
‑
700,2
‑
600,2
‑
500,2
‑
480,2
‑
400,2
‑
300,2
‑
200,2
‑
100,2
‑
50,2
‑
66,2
‑
48,2
‑
30,2
‑
20,2
‑
19,10
‑
1000,10
‑
900,10
‑
800,10
‑
700,10
‑
600,10
‑
500,10
‑
480,10
‑
400,10
‑
300,10
‑
200,10
‑
100,10
‑
50,10
‑
66,10
‑
48,10
‑
30,10
‑
20,20
‑
1000,20
‑
900,20
‑
800,20
‑
700,20
‑
600,20
‑
500,20
‑
480,20
‑
400,20
‑
300,20
‑
200,20
‑
100,20
‑
50,20
‑
50,20
‑
66,20
‑
48,20
‑
30,30
‑
1000,30
‑
900,30
‑
800,30
‑
700,30
‑
600,30
‑
500,30
‑
480,30
‑
400,30
‑
300,30
‑
200,30
‑
100,30
‑
50,30
‑
50,30
‑
66,30
‑
48,30
‑
40,40
‑
1000,40
‑
900,40
‑
800,40
‑
700,40
‑
600,40
‑
500,40
‑
480,40
‑
400,40
‑
300,40
‑
200,40
‑
100,40
‑
60,40
‑
50,40
‑
66,40
‑
48,50
‑
1000,50
‑
900,50
‑
800,50
‑
700,50
‑
600,50
‑
500,50
‑
480,50
‑
400,50
‑
300,50
‑
200,50
‑
100,50
‑
60,50
‑
66,60
‑
1000,60
‑
900,60
‑
800,60
‑
700,60
‑
600,60
‑
500,60
‑
480,60
‑
400,60
‑
300,60
‑
200,60
‑
100,70
‑
1000,70
‑
900,70
‑
800,70
‑
700,70
‑
600,70
‑
500,70
‑
480,70
‑
400,70
‑
300,70
‑
200,70
‑
100,70
‑
80,70
‑
90,80
‑
1000,80
‑
900,80
‑
800,80
‑
700,80
‑
600,80
‑
500,80
‑
480,80
‑
400,80
‑
300,80
‑
200,80
‑
100个之间的compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在一些实施方案中，文库包含2
‑
19、48
‑
480、48
‑
66、66
‑
480、220
‑
240、40
‑
60、48
‑
66、50
‑
70或60
‑
80个之间的compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在一些实施方案中，文库包含至少2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,48,50,55,60,65,66,70,75,80,85,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,600,562,650,675,700,725,750,775,800,825,850,875,900,925,950,975或1000个compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在一些实施方案中，文库包含2,10,15,20,24,48,66,100,200,300,400,500,600,700,800,900或1000个compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸。在一些实施方案中，文库中的两个或更多个compact多肽、附接于颗粒的compact多肽或compact多核苷酸具有不同的新表位序列和不同的mhc序列。
[0334]
在某些实施方案中，文库包含两个或更多个compact多核苷酸，其中文库中的每个compact多核苷酸包含对应于从患者样品检测到的新抗原的新表位序列和mhc重链序列。
[0335]
在一些实施方案中，文库包含大于或等于两个不同的多核苷酸分子，其中每个不同的多核苷酸分子包含(i)第一通用序列，(ii)编码抗原肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列对于大于或等于两个多核苷酸分子中的每一个是不相同的，(iii)第二通用靶序列，(iv)β2m序列，和(v)mhc等位基因序列。在一些实施方案中，对于大于或等于两个多核苷酸分子中的每一个，mhc等位基因序列不同。
[0336]
在一个实施方案中，文库包含hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:03,
hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02和hla
‑
c*17:01等位基因中的至少两个或更多个。在一个实施方案中，文库包含至少hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02和hla
‑
c*17:01等位基因。
[0337]
在某些实施方案中，hla文库包含hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*17:01。在某些实施方案中，hla文库由hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*17:01组成。在某些实施方案中，hla文
库包含至少50％、60％、70％、80％或90％或更多的以下hla等位基因：hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*15:07,hla
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b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*55:01,hla
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b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*17:01。
[0338]
在一些实施方案中，文库包含大于或等于两个不同的多肽分子，其中对于大于或等于两个多肽分子中的每一个，抗原肽不相同，并且其中每个不同的多肽附接至颗粒。在一些实施方案中，文库进一步包含与每个不同多肽的身份可操作地相关联的唯一定义的条形码序列。
[0339]
实施方案包括包含定义的条形码序列的条形码化多核苷酸。条形码化多核苷酸可以是提供独特的抗原特异性序列用于t细胞分离后鉴定的多核苷酸。因此，每个独特的compact都附接在具有唯一定义的条形码序列的颗粒上。这允许给定抗原和给定条形码之间的有效关联，其中该条形码对于该对是独特的。
[0340]
条形码化的多核苷酸可以是ssdna或dsdna。包含条形码的多核苷酸可在其5’末端进行修饰以包含用于附接至颗粒的附接部分。例如，包含条形码序列的多核苷酸与生物素分子缀合，以与附接于颗粒(例如葡聚糖)的链霉亲和素核心结合。然而，任何合适的附接部分都可以用于将多核苷酸附接到颗粒上。如本文所述和本领域技术人员理解的，合适的附接部分对是本领域已知的。附接部分的非限制性实例包括硫醇、马来酰亚胺、金刚烷、环糊精、胺、羧基、叠氮化物和炔烃。
[0341]
颗粒
[0342]
如本文所用，“纳米颗粒”或备选地称为“颗粒”是指能够被特异性分选或分离并且其他实体可以附接于其上的基底。在某些实施方案中，附接于颗粒的“实体”是compact和条形码。在某些实施方案中，除了compact和条形码之外，额外的实体(例如，荧光团或其他显像剂)可以附接于颗粒。在某些实施方案中，除了compact和条形码之外，额外的蛋白质可以附接于颗粒。例如，额外的蛋白质可以附接在颗粒上以促进t细胞结合或增加compact的稳定性。在某些实施方案中，compact蛋白质、条形码、显像剂和额外的蛋白质可以附接到颗粒上。在某些实施方案中，多个compact蛋白附接于颗粒。
[0343]
在一些实施方案中，颗粒是磁性的，例如用于使用磁体进行分离。在一些实施方案中，磁性颗粒包括磁性氧化铁。磁性颗粒的实例包括但不限于dynabead(thermo fisher)。在一些实施方案中，颗粒是聚苯乙烯颗粒，例如用于通过重力分离。在其他实施方案中，颗粒可以是表面、珠或聚合物。珠的实例包括但不限于琼脂糖(agarose)珠和琼脂糖(sepharose)珠。在特定的实施方案中，颗粒可以是荧光的或直接或间接附接到荧光团。
[0344]
根据某些实施方案，用用于附接额外分子的附接部分修饰颗粒。颗粒的修饰包括可以与附接到多核苷酸的相应同源(例如，互补)附接部分配对(例如，共价结合)的附接部分。可以使用任何合适的附接部分对来修饰颗粒和用于附接的多核苷酸检测标签。附接部分对的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素系统、硫醇基团(例如，半胱氨酸)和半胱氨酸反应性部分(例如，马来酰亚胺、金刚烷和环糊精)、氨基和羧基以及叠氮基和炔基。在一些实施方案中，附接部分可包含切割部分。在其他实施方案中，与互补的同源附接部分结合的附接部分可以是可逆的，例如可还原的硫醇基团。在示例性实施方案中，修饰的颗粒是链霉亲和素包被的磁性纳米颗粒，例如1μm颗粒(例如来自thermofisher scientific的dynabeads myone链霉亲和素t1珠)，并且多核苷酸可以被生物素化以附接到修饰的颗粒上。
[0345]
颗粒可以是葡聚糖，例如生物素化葡聚糖或链霉亲和素包被的葡聚糖。修饰的葡聚糖进一步详细地描述于在bethune等人，biotechniques62:123
‑
130mar.2017和美国公开号2015/0329617中，其通过引用全部并入本文。生物素化的compacts可以附接到链霉亲和素包被的葡聚糖上。
[0346]
compact蛋白也可以组装成四聚体，包括与链霉亲和素核心结合的1、2、3或4个生物素化的compact蛋白。四聚体还可以包含荧光团，例如与链霉亲和素核心结合的藻红蛋白(pe)或别藻蓝蛋白(apc)。mhc i类和ii类四聚体是本领域众所周知的。mhc i类四聚体进一步详细描述于burrow sr等人,j immunol december 1,2000,165(11)6229
‑
6234中，并且mhc ii类四聚体进一步详细描述于nepom gt,j immunol march 15,2012,188(6)2477
‑
2482中，两者均通过引用整体并入本文。
[0347]
compact蛋白也可以组装成多聚体。在一些实施方案中，compact蛋白多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或更高阶的多聚体。在一些实施方案中，多聚体可包含至少两个或更多个compact蛋白。在一些实施方案中，多聚体可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个compact蛋白。
[0348]
颗粒集合和文库
[0349]
还考虑不同的颗粒集合，每个不同的颗粒集合包含独特的抗原肽(如本文所用，指的是compact)和至少一个与抗原肽的身份可操作地相关联的定义的条形码。颗粒集合包含至少两个颗粒，每个单独的颗粒包含独特的抗原肽和与抗原肽的身份可操作地相关联的至少一个定义的条形码。在一些实施方案中，不同的颗粒集合包括至少两个颗粒。在一些实施方案中，不同的颗粒集合包括至少三个颗粒。在一些实施方案中，不同颗粒集合包括至少四个颗粒。在一些实施方案中，独特的抗原肽(如本文所用，指的是compact)包含compact多核苷酸分子或多肽分子。
[0350]
还考虑了不同颗粒集合的文库。不同颗粒集合的文库可以包括2到1000个颗粒集合。在一些实施方案中，文库包含2
‑
900,2
‑
800,2
‑
700,2
‑
600,2
‑
500,2
‑
480,2
‑
400,2
‑
300,2
‑
200,2
‑
100,2
‑
50,2
‑
66,2
‑
48,2
‑
30,2
‑
20,2
‑
19,10
‑
1000,10
‑
900,10
‑
800,10
‑
700,10
‑
600,10
‑
500,10
‑
480,10
‑
400,10
‑
300,10
‑
200,10
‑
100,10
‑
50,10
‑
66,10
‑
48,10
‑
30,10
‑
20,20
‑
1000,20
‑
900,20
‑
800,20
‑
700,20
‑
600,20
‑
500,20
‑
480,20
‑
400,20
‑
300,20
‑
200,20
‑
100,20
‑
50,20
‑
50,20
‑
66,20
‑
48,20
‑
30,30
‑
1000,30
‑
900,30
‑
800,30
‑
700,30
‑
600,30
‑
500,30
‑
480,30
‑
400,30
‑
300,30
‑
200,30
‑
100,30
‑
50,30
‑
50,30
‑
66,30
‑
48,30
‑
40,40
‑
1000,40
‑
900,40
‑
800,40
‑
700,40
‑
600,40
‑
500,40
‑
480,40
‑
400,40
‑
300,40
‑
200,40
‑
100,40
‑
60,40
‑
50,40
‑
66,40
‑
48,50
‑
1000,50
‑
900,50
‑
800,50
‑
700,50
‑
600,50
‑
500,50
‑
480,50
‑
400,50
‑
300,50
‑
200,50
‑
100,50
‑
60,50
‑
66,60
‑
1000,60
‑
900,60
‑
800,60
‑
700,60
‑
600,60
‑
500,60
‑
480,60
‑
400,60
‑
300,60
‑
200,60
‑
100,70
‑
1000,70
‑
900,70
‑
800,70
‑
700,70
‑
600,70
‑
500,70
‑
480,70
‑
400,70
‑
300,70
‑
200,70
‑
100,70
‑
80,70
‑
90,80
‑
1000,80
‑
900,80
‑
800,80
‑
700,80
‑
600,80
‑
500,80
‑
480,80
‑
400,80
‑
300,80
‑
200,80
‑
100,100
‑
150,150
‑
200,200
‑
250,250
‑
300,300
‑
350,350
‑
400,400
‑
450或450
‑
500个之间的颗粒集合。在一些实施方案中，文库包含2
‑
19、48
‑
480、48
‑
66、66
‑
480、220
‑
240、40
‑
60、48
‑
66、50
‑
70或60
‑
80个之间的颗粒集合。在一些实施方案中，文库包含至少2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,48,50,55,60,65,66,70,75,80,85,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,600,562,650,675,700,725,750,775,800,825,850,875,900,925,950,975或1000个颗粒集合。在一些实施方案中，文库包含2,10,15,20,24,48,66,100,200,300,400,500,600,700,800,900或1000个颗粒集合。
[0351]
在某些实施方案中，本公开的颗粒集合的文库可以包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个颗粒集合。在某些实施方案中，每个颗粒集合可以包括一、两种、三种、四种、五种或更多或更多种类型的颗粒。在某些实施方案中，颗粒集合可以包括单一类型的颗粒。在某些实施方案中，颗粒集合可以包括多种类型的颗粒。例如，但不作为限制，颗粒集合可以包括结合到相同条形码的颗粒或结合到不同条形码的颗粒，或者它们的组合。在某些实施方案中，颗粒集合可包含结合到compact多肽的颗粒。在某些实施方案中，颗粒集合可包含与相同的compact多肽、不同的compact多肽结合的颗粒，或其组合。
[0352]
dextramer和四聚体
[0353]
compact多肽可以附接到葡聚糖，例如生物素化葡聚糖或链霉亲和素包被的葡聚糖。修饰的葡聚糖进一步详细地描述于在bethune等人，biotechniques 62:123
‑
130mar.2017和美国公开号2015/0329617中，其通过引用全部并入本文。生物素化的compact多肽可以附接到链霉亲和素包被的葡聚糖上。在某些实施方案中，葡聚糖包被有链霉亲和素。在某些实施方案中，链霉亲和素共价缀合至葡聚糖。在某些实施方案中，链霉亲和素非共价偶联至生物素
‑
葡聚糖。
[0354]
compact也可以组装成四聚体，包括与链霉亲和素核心结合的1、2、3或4个生物素化的compact蛋白。四聚体还可以包含荧光团，例如与链霉亲和素核心结合的藻红蛋白(pe)或别藻蓝蛋白(apc)。在某些实施方案中，荧光团选自包括percp、cy3、cy5和alexa488的组。在某些实施方案中，荧光团是量子点(非限制性示例是qdot800)。在某些实施方案中，可以使用具有高消光系数的任何荧光团。mhc i类和ii类四聚体是本领域众所周知的。mhc i类四聚体进一步详细描述于burrow sr等人,jimmunol december 1,2000,165(11)6229
‑
6234中，并且mhc ii类四聚体进一步详细描述于nepom gt,j immunol march 15,2012,188(6)2477
‑
2482中，两者均通过引用整体并入本文。
[0355]
制备compact多肽的方法
[0356]
抗原预测
[0357]
为了制造compact，初始步骤之一可以包括鉴定患者的肿瘤特异性抗原(例如，新抗原)。通过这种方法产生的组合物然后可用于t细胞介导的免疫过程，例如，用于患者特异
性癌症免疫疗法。为了鉴定患者的推定新抗原(肿瘤或病原体)，可以利用计算机预测算法程序分析肿瘤、病毒或细菌测序数据(包括全基因组、全外显子组或转录组测序数据)以鉴定对应于推定表达的新抗原的一个或多个突变。此外，可以从患者的肿瘤或血液样品中确定人类白细胞抗原(hla)分型，并且该hla信息可以与已鉴定的推定新抗原肽序列一起用于mhc结合的预测算法，(参见，fritsch等人,2014,cancer immunol res.,2:522
‑
529，其全部内容通过引用并入本文)。人群中常见的hla也可以包含在新抗原预测算法中，所述hla为例如白种人中的hla
‑
a*02,24,01；hla
‑
b*35,44,51；drb1*11,13,07；非洲裔巴西人中的hla
‑
a*02,03,30；hla
‑
b*35,15,44；drb1*13,11,03；和亚洲人中的hla
‑
a*24,02,26；hla
‑
b*40,51,52；drb1*04,15,09。也可以使用hla等位基因的特异性配对。在人群中发现的常见等位基因进一步描述于bardi等人(rev bras hematol hemoter.2012；34(1):25
–
30.)
[0358]
鉴定新抗原的方法的另外实例包括将测序与质谱和mhc呈递预测相结合(例如，美国公开号2017/0199961)，以及将测序与mhc结合亲和力预测相结合(例如，已发布的美国专利9,115,402)。此外，可用于鉴定患者样品中是否存在新抗原特异性t细胞的方法可与本文所述的方法组合使用，例如，如美国公开号2017/0003288和pct/us17/59598中所述，其全部通过引用并入本文。这些分析产生了患者候选新抗原肽(这些候选新抗原肽可以使用常规方法轻松合成)的排名列表，用于筛选同源抗原特异性t细胞。
[0359]
限制性消化组装
[0360]
一般而言，compact多核苷酸的制备可以通过本文公开的程序和公认的重组dna技术来完成，例如质粒dna的制备、用限制酶切割dna、dna连接、转化或转染宿主，宿主的培养，以及表达的融合复合物的分离和纯化。此类程序通常是已知的并在标准参考文献中公开，例如sambrook等人，同上。
[0361]
在一些方面，编码mhc i类重链的dna可获自合适的细胞系，例如人类淋巴母细胞。在各种配置中，编码i类重链的基因或cdna可以通过聚合酶链式反应(pcr)或本领域已知的其他方式扩增。在一些方面，pcr产物还可包括编码接头的序列，和/或用于连接此类序列的一个或多个限制酶位点。
[0362]
在一些实施方案中，可以通过将编码mhc i类重链和β2
‑
微球蛋白的序列与编码抗原肽的序列连接来制备编码compact多核苷酸的载体。
[0363]
编码抗原肽的dna可以通过从天然来源分离dna或通过已知的合成方法例如磷酸三酯方法获得。参见，例如，oligonucleotide synthesis,irl press(m.gait,ed.,1984)。合成寡核苷酸也可以使用市售的自动化寡核苷酸合成仪来制备。编码本文讨论的通用靶序列的dna序列可以插入在编码信号序列的序列和编码抗原肽的序列之间，并且可以在编码抗原肽区段的序列和编码β2
‑
微球蛋白区段的序列之间插入第二通用靶序列。在一些实施方案中，可以使用连接酶连接区段。
[0364]
pcr组装
[0365]
在一些方面，可通过聚合酶链式反应(pcr)扩增来组装compact。与限制性消化方法类似，编码mhc重链和β2
‑
微球蛋白的dna可以从合适的来源获得。编码所选信号序列的第二dna片段也可以从合适的来源获得。dna的两个片段可能具有不同的通用靶序列，使得一个通用序列的引物不会与第二通用序列退火。可以合成编码所选抗原肽的两个序列；一个正向引物，其5’端具有抗原序列，并且3’端具有mhc dna片段上的通用引物序列的互补序
列；一个反向引物，其5’端具有所选抗原序列的反向互补序列，并且3'端具有来自信号序列片段的通用引物的反向互补序列。用所有四个dna片段和5’端信号序列片段和3’端mhc等位基因片段的引物进行pcr反应将导致两个dna片段的扩增，一个具有3’端信号序列和5’端抗原序列，并且另一个具有3’端抗原序列和3’端mhc等位基因。进一步的pcr扩增循环将使重叠的抗原肽序列退火并产生单个全长dna片段。在一些实施方案中，信号肽片段进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，mhc片段进一步包含纯化簇和/或polya尾。
[0366]
宿主细胞的转染、转导和遗传修饰
[0367]
可通过已知的适当方法将compact多核苷酸插入宿主细胞，所述方法包括但不限于转染、转导、电穿孔、脂质转染、声穿孔、机械破坏或病毒载体。示例性转染试剂包括但不限于fectorpro、expifectamine、lipofectamine、聚乙烯亚胺(pei)、fugene或基于细胞类型、转染系统、转染类型、转染条件和待转染构建体提供最佳转染率的任何其他转染试剂。在一些实例中，expifectamine用于用compact多核苷酸转染哺乳动物细胞。在一些实例中，聚乙烯亚胺用于用compact多核苷酸转染哺乳动物细胞。在一些实例中，fectorpro用于用compact多核苷酸转染哺乳动物细胞。
[0368]
compact多核苷酸可以在宿主细胞中瞬时或稳定表达。在一些实施方案中，compact多核苷酸被整合到宿主基因组中。在其他实施方案中，compact多核苷酸保持在染色体外。本领域已知的任何合适的基因编辑技术也可用于用compact多核苷酸修饰宿主细胞，包括crispr/cas9、锌指核酸酶或talen核酸酶。
[0369]
表达
[0370]
可以采用多种策略来表达compact多肽。例如，可以通过已知方法例如通过使用限制酶和连接酶(参见例如sambrook等人，同上)将compact多核苷酸掺入合适的载体中。可以基于与克隆方案相关的因素来选择载体。例如，载体可以与正在使用的宿主相容并具有合适的复制子。合适的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，并且可以是易于转化并在培养基中表现出快速生长的细胞。宿主细胞的实例包括原核生物如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，以及真核生物如动物细胞和酵母，如哺乳动物细胞和人类细胞。可用作宿主以表达compact的哺乳动物细胞的非限制性实例包括j558、nso、sp2
‑
o、293t、expi293和cho(以及任何j558、nso、sp2
‑
o、293t、expi293和cho细胞系的任何衍生物或修饰)。可能宿主的其他实例包括昆虫细胞，如sf9，它们可以使用常规培养条件生长。参见sambrook等人，同上。在各种实施方案中，可以使用已知方法鉴定表达compact多肽的细胞。例如，compact多肽的表达可以通过elisa、facs或western印迹确定。在某些实施方案中，compact多肽的表达可以通过elisa、facs或western印迹使用针对compact的mhc重链部分的抗体探针或针对亲和标签例如his6(seq id no:34)的抗体，或链霉亲和素试剂(如果compact已被生物素化)来确定。
[0371]
在一些方面，compact在哺乳动物细胞中表达。在哺乳动物细胞中而不是在大肠杆菌细胞中表达蛋白质的益处是多方面的。在大肠杆菌细胞中表达的蛋白质必须小心地从脂多糖(lps)中纯化出来。蛋白质在哺乳动物细胞中的表达不会导致纯化的蛋白质受到lps污染。此外，哺乳动物细胞更可能正确折叠哺乳动物蛋白质，因为哺乳动物细胞用正确折叠所需的正确翻译后修饰(包括正确形成二硫键)来产生蛋白质。此外，哺乳动物细胞提供正确的伴侣蛋白以协助内质网或高尔基体中的蛋白质折叠。与在大肠杆菌细胞中表达的蛋白质相比，这导致均匀良好折叠的蛋白质的纯化增加。
[0372]
在一些方面，compact在原核细胞中表达。在某些实施方案中，原核细胞已被遗传修饰以对compact进行翻译后修饰。在某些实施方案中，如使用本领域已知的lps检测方法所测量的，在原核细胞中表达的compact基本上不含lps或没有可检测的lps。
[0373]
compact可以基本上不含lps。compact可以不含lps，例如，如使用本领域已知的lps检测方法所测量的，compact可以没有可检测到的lps。compact可以被糖基化。compact可以具有一个或多个翻译后修饰。可以通过在真核细胞或在特定实施方案中在哺乳动物细胞中的表达来修饰compact，例如，通过一个或多个翻译后修饰例如糖基化。compact可以包括一个或多个翻译后修饰。compact可以(1)基本上不含lps或不含lps，并且(2)被糖基化。
[0374]
示例性的compact工作流程
[0375]
图23显示了compact蛋白的组装和表达的示例性示意图。合成并退火编码所需新抗原肽序列的有义和反义寡核苷酸以形成在5’和3’末端具有突出端的双链寡核苷酸，然后可以将其连接到包含β2m基因和mhc等位基因的质粒中。完整的compact oligo可以被扩增成双链扩增子，并转染到细胞中进行蛋白质表达和可选的生物素化。可以通过sds
‑
page评估compact蛋白。然后可以选择compact多核苷酸用于在大肠杆菌中放大质粒生产。用选定的质粒转染蛋白质生产细胞，然后从生产细胞中纯化出compact，用于功能测定。
[0376]
纯化(层析法)
[0377]
可以通过已知方法分离和纯化表达的compact多肽。例如，包含his6亲和标签(seq id no:34)的compact可以通过在金属亲和层析柱(例如ni
‑
nta柱或本文所述的任何其他金属亲和树脂柱例如co2+、ca2+、zn2+、cu2+树脂或其任何组合(包括ni2+))上的亲和层析并通过公知和公开的程序进行纯化。此外，包含人hla序列的compact可以通过在单克隆抗体
‑
sepharose柱上的亲和层析通过公知和公开的程序进行纯化。
[0378]
分离抗原特异性t细胞的方法
[0379]
本文所述的compact文库已用于分离抗原特异性t细胞，并可用于分离任何呈递新抗原的细胞。根据一个实施方案，t细胞分离过程的示意图显示在图26中。该过程在本文中也可称为
‘
impact’或
‘
impact分离技术’方法。
[0380]
impact分离技术方法的步骤和组分包括但不限于图26中图示的步骤(1)
‑
(5):
[0381]
(1)创建用于患者特异性新抗原t细胞分离的compact元件库
[0382]
(2)向compact元件库添加独特的dna寡核苷酸、neoid或条形码
[0383]
(3)每个个体compact多肽及其相应的neoid条形码、dna寡核苷酸、neoid或条形码都与两个单独的荧光链霉亲和素蛋白(在图26提供的实例中为藻红蛋白(pe)和别藻蓝蛋白(apc))结合
[0384]
(4)这种组装过程导致每个compact多肽和条形码元件有两个配对的条形码化荧光四聚体
[0385]
(5)将装配有所有compact多肽和neoid条形码、dna寡核苷酸、neoid或靶向每个患者预测的新抗原候选物的条形码的四聚体文库合并在一起，用于从受试者的外周血中分离新抗原特异性t细胞。
[0386]
使用compact库来鉴定和表征新抗原特异性t细胞也显示在图26的小图6
‑
8中。将compact
‑
neoid文库与患者样品(6)一起温育，然后进行荧光激活细胞分选(facs)(7)。可以将设计用于表达工具neotcr的固定数量的t细胞添加到患者样品中，作为内部阳性对照，以
校准每个分析。双荧光标记(pe和apc)四聚体结合的新抗原特异性t细胞，以及内部阳性对照细胞和潜在的非特异性t细胞作为单个细胞分选到板中的单个孔中，用于随后的rt
‑
pcr分析，包括条形码和neo
‑
tcr测序(8)。
[0387]
条形码信噪比(s/n)分析
[0388]
真阳性新抗原特异性双标记t细胞可通过流式细胞术通过对结合到分离的t细胞的neoid条形码的序列分析而从鉴定的假阳性t细胞中解析出来。与非特异性结合的条形码相比，相同neoid条形码的多个拷贝的存在产生了高比例的特异性neoid条形码种类。这导致更高的信噪条形码比(s/n)。非特异性t细胞结合相对相等数量的不同四聚体种类，导致较低比例的不同neoid条形码。非特异性与特异性t细胞结合的示意图示于图27a(非特异性)和图27b(特异性)中。数字表示不同的neoid条形码。在图27a中，最主要的neoid的独特dna拷贝数除第二最主要的neoid的比率为1，表明被compact元件非特异性结合的细胞。在图27b中，最主要的neoid的独特dna拷贝数除以第二最主要的neoid的比率为5，表明该t细胞被主要的compact元件结合并且代表真正的阳性新抗原特异性cd8 t细胞。这可以通过使用从单个细胞克隆的neotcr工程化的t细胞的功能表征来进一步证实。
[0389]
s/n1和s/n2分析
[0390]
在一些实施方案中，一个tcr可以识别两种不同的新抗原。在这种情况下，即使t细胞是特异性的，s/n比也可能低于10。在这种情况下，可以使用两种不同的s/n计算，即s/n1和s/n2。s/n1是最高信号除以次高信号，而s/n2是来自一个突变的最高信号除以来自不同突变的最高信号。在s/n2分析中，来自不同突变的最高信号可能不是样品中的次高信号。
[0391]
在说明性实例中，可以在一个样品中鉴定8个不同的tcr。其中6个可能具有大于10的s/n1比，并且可以确认为特异性新抗原t细胞。对于其他2个t细胞，s/n1比可能低于10。但是，s/n2可能高于10。克隆这2个tcr表明它们可以识别共享相同突变的两个不同的新抗原，解释了低s/n1比的原因。在一些实施方案中，当存在源自相同突变的多个新抗原时，s/n2分析可用于从特定细胞中调用(call)非特异性。
[0392]
在一些实施方案中，更高的s/n比指示更高的tcr结合特异性。
[0393]
阈值
[0394]
在一些实施方案中，如果条形码信噪比s/n1或s/n2比高于阈值，则分离的t细胞被鉴定为所述抗原特异性t细胞。
[0395]
在一些实施方案中，阈值是至少或大于2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950或1000。在一些实施方案中，阈值是至少或大于2、5、10或20。在一些实施方案中，该比率对应于分离的抗原特异性t细胞的特异性。在一些实施方案中，s/n比为10或更大。
[0396]
标记
[0397]
如本文所用，“识别标记”或“识别标记”是指用于标记颗粒集合的分子或化合物。在一些实施方案中，识别标记是荧光团。在一些实施方案中，识别标记是金属、镧系元素、量子点、放射性同位素、纳米颗粒或染料。可以使用任何合适的荧光团，包括但不限于别藻蓝蛋白(apc)、藻红蛋白(pe)、荧光素(fitc)、罗丹明、德克萨斯红、dapi、c2、cy3、cy5、cy7、alexafluor荧光团、bodipy荧光团、dylight荧光团、fluoprobes荧光团或其任何组合。
[0398]
条形码
[0399]
如本文所用，“条形码”或“多个条形码”是指用于标签化和鉴定特定肽(包括但不限于抗原肽)的核苷酸序列。在某些实施方案中，条形码选自由3聚体、4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体和20聚体组成的组。在某些实施方案中，条形码是8聚体。
[0400]
在一些实施方案中，不同的颗粒对包含独特的抗原肽和与抗原肽的身份可操作地相关联的确定的条形码。
[0401]
在一些实施方案中，第一颗粒包含第一条形码并且所述第二颗粒包含不同于第二条形码的第二条形码，其中第一和第二条形码与抗原的身份相关联。
[0402]
在一些实施方案中，颗粒对包含第三颗粒，所述第三颗粒包含不同于第一和第二条形码的第三条形码，其中所述第一、第二和第三条形码与抗原的身份相关联。
[0403]
下面的表a中提供了示例性条形码和条形码结构。条形码也可以称为“neoid”。
[0404][0405]
在一些实施方案中，条形码信噪比基于至少一个条形码。在这样的实施方案中，每个配对颗粒包含相同的抗原、不同的标记和至少一个条形码，其中至少一个条形码与新抗原相关联。在一些实施方案中，配对颗粒具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个条形码。
[0406]
在一些情况下，具有荧光团标记的颗粒的聚集体可导致分离期间染色细胞的单个荧光团高平均荧光强度。这不是由于荧光颗粒的特异性结合，而是由于compact颗粒聚集体的非特异性结合，导致高的新抗原条形码s/n，因为可能有与t细胞非特异性结合的大量相同条形码。可以使用双条形码系统来解决这个问题。
[0407]
在一些实施方案中，compact文库元件的每个颗粒对包含至少两个条形码。双条形码将每个抗原的两个不同dna条形码分别与每个compact四聚体缀合。图28显示了一种抗原的单条形码和双条形码的比较图。在顶部图中，相同的新抗原与两种不同的颗粒、两种不同的荧光团和单个条形码相关联，标记为“1”。在底部图中，相同的抗原与两种不同的颗粒、两种不同的荧光团和两种不同的条形码相关联，标记为“1”和“2”。这导致对由四聚体聚集引起的具有高信噪比的假阳性的识别增加。分配给每个荧光颗粒和相同抗原的每个dna条形码的信噪比可以单独分析。
[0408]
在一些实施方案中，compact文库元件的每个颗粒对包含至少两个条形码。双条形编码将每个抗原肽的两个不同dna条形码分别与每个compact四聚体缀合。图28显示了一个抗原肽的单条形码和双条形码的比较图。在顶部图中，相同的抗原肽与两种不同的颗粒、两种不同的荧光团和单个条形码相关联，标记为“1”。在底部图中，相同的抗原肽与两种不同的颗粒、两种不同的荧光团和两种不同的条形码相关联，标记为“1”和“2”。这导致对由四聚体聚集引起的具有高信噪比的假阳性的识别增加。分配给每个荧光颗粒和相同抗原肽的每
个dna条形码的信噪比可以单独分析。
[0409]
细胞样品
[0410]
impact方法(即，impact分离技术)可用于从包含免疫细胞的任何合适的患者来源样品中分离免疫细胞，例如t细胞和b细胞，所述免疫细胞包括但不限于血液、血浆、外周血单核细胞(pbmc)样品、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞(til)样品、组织、实体瘤、血液癌和液体肿瘤，或其任何组合。例如，cd4+和cd8+t细胞都可以使用抗cd4和抗cd8荧光抗体从pbmc或tils中进行标记和分选，使用荧光激活细胞分选(facs)对cd4+和cd8+单阳性细胞的活细胞群进行分选,以便仅分离cd4+或cd8+细胞。在一些实施方案中，可以使用抗cd3荧光抗体随后使用facs来分离cd4和cd8均为阳性的t细胞。此外，impact方法还可用于b细胞的抗体发现。本领域技术人员能够针对所使用的compact蛋白的类型确定要分离的免疫细胞的类型。在一些实施方案中，样品是血液样品。在一些实施方案中，样品是pbmc样品。在一些实施方案中，样品是实体瘤样品。在一些实施方案中，样品是血液肿瘤样品。在一些实施方案中，样品是骨髓样品。在一些实施方案中，样品是包含肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤样品。t细胞可以是cd8+t细胞或cd4+t细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd8+t细胞。在一些实施方案中，t细胞是cd4+t细胞。在一些实施方案中，t细胞是人t细胞。在一些实施方案中，t细胞是人cd8+t细胞。
[0411]
t细胞分离
[0412]
在另一方面，本文提供了分离抗原特异性t细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供在氨基末端至羧基末端方向包含以下各项的多肽，(i)第一通用靶肽，(ii)抗原肽，(iii)不同于第一通用靶肽的第二通用靶肽，(iv)β2m肽，和(v)mhc肽，其中所述多肽与一个颗粒连接；(b)提供已知或怀疑包含一个或多个t细胞的样品；(c)使多肽与样品接触，其中所述接触包括提供足以使单个t细胞与附接于颗粒的多肽结合的条件，和(d)分离与颗粒相关联的单个t细胞。
[0413]
使用如本文所述的compact分离和鉴定患者来源的和抗原特异性t细胞可以包括将compact蛋白与患者来源的t细胞或含有患者来源的t细胞的样品一起温育。在一些实施方案中，包含至少两个compact的文库可以与患者来源的t细胞一起温育。t细胞可以使用标准方法从诸如血液、淋巴结或肿瘤的组织开始制备。
[0414]
compact或compact文库与t细胞悬液的温育允许颗粒结合的抗原肽完全和彻底地暴露于各种t细胞受体。该方法可包括细胞的摇动或旋转。在一些实施方案中，compact与颗粒相关联。
[0415]
在compact或compact文库(两者都结合到粒颗粒上)和t细胞温育之后，选择性分离或选择性收集结合的compact
‑
t细胞复合物。t细胞可能会与相同compact文库元件(即单个compact多肽和与颗粒相关联的compact多肽)的许多相同拷贝结合，并且可以基于这些相互作用进行分离。例如，如果compact或与颗粒相关联的compact包含荧光团，或附接到具有荧光团的颗粒，则荧光相关联的细胞分选(facs)，包括单细胞分选，可用于选择性分离t细胞。如果compact或与之相关联的颗粒附接在磁性颗粒上，则将磁体施加到悬浮液上可以分离与抗原配对t细胞复合的颗粒并去除未配对的t细胞。或者，如果与compact相关联的颗粒是聚苯乙烯颗粒，未配对的t细胞可以通过重力(例如离心)分离。在去除未配对的t细胞后，在一些实施方案中，将分离的结合颗粒洗涤至少一次以去除任何非特异性结合的t细
胞。
[0416]
compact结合的t细胞也可以通过facs分离到单独的收集容器中，例如多孔板。单独的收集容器可以是单细胞反应容器。例如，可以将用于下游处理和分析的组分添加到每个单细胞反应容器中。compact结合的t细胞可以通过facs分离到大容量收集容器中(例如，每个分离的t细胞都收集在相同的容器中)。
[0417]
也可以使用液滴生成微流体装置(即，“液滴生成器”)在液滴中单独分离compact结合的t细胞。用于封装单个细胞的液滴生成装置是本领域技术人员已知的，例如，如美国公开号2006/0079583、美国公开号2006/0079584、美国公开号2010/0021984、美国公开号2015/0376609、美国公开号2009/0235990和美国公开号2004/0180346中所述。
[0418]
在将结合compact的t细胞分离到单细胞反应容器中(例如，分离在单孔或液滴中)后，可以进一步处理结合compact的t细胞的核酸用于下游分析。具体地，表达的tcrα和tcrβmrna转录物可以首先通过逆转录转化为cdna，并且扩增的cdna用于本领域技术人员已知的下一代测序(ngs)方法，所述方法包括但不限于合成测序技术(例如，illumina或任何其他ngs测序机)。
[0419]
鉴定t细胞抗原特异性的方法
[0420]
在某些实施方案中，本公开的主题提供用于鉴定t细胞的抗原特异性的方法。在某些实施方案中，本文所述的t细胞分离方法提供了关于分离的t细胞的抗原特异性的信息。例如，但不限于，关于抗原特异性的信息可以通过分离的t细胞的核酸分析获得。在某些实施方案中，可以分析分离的t细胞的核酸以确定t细胞受体基因序列(例如，tcrα和tcrβ序列)的序列。在某些实施方案中，关于分离的t细胞的抗原特异性的信息可用于下游应用。下游应用的非限制性实例包括免疫组库分析、制造方法和接受免疫疗法的患者的临床随访。在某些实施方案中，关于分离的t细胞的抗原特异性的信息可用于制备用于制造可用于过继细胞转移疗法的细胞的试剂和组合物。
[0421]
在非限制性实施方案中，进行免疫组库的监测。在某些实施方案中，免疫组库的监测在治疗之前、期间或之后进行。在某些实施方案中，治疗是免疫疗法。免疫疗法的非限制性实例包括施用疫苗、溶瘤病毒、抗体、表达嵌合抗原受体的t细胞、表达重组t细胞受体的t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞。
[0422]
治疗方法
[0423]
在某些实施方案中，当前公开的主题提供治疗方法，包括但不限于在有需要的受试者中诱导和/或增加免疫应答。在本公开的某些实施方案中，本文公开的治疗方法涉及细胞的分离和/或施用。例如，但不作为限制，在某些实施方案中，本文所述方法中采用的细胞可以从受试者获得。在某些实施方案中，细胞是肿瘤细胞、非癌细胞、t细胞或其任何组合。在某些实施方案中，可以如本文所述从细胞中提取核酸。在某些实施方案中，细胞的核酸可以如本文概述的进行测序。在某些实施方案中，从受试者获得的信息，例如核酸序列信息，提供了关于抗原特异性t细胞的信息。在某些实施方案中，信息涉及抗原肽的身份(例如，氨基酸序列)。在某些实施方案中，抗原肽是肿瘤新抗原。在某些实施方案中，该信息涉及mhc序列的身份。
[0424]
在某些实施方案中，本文所述的方法涉及癌症的治疗。在某些实施方案中，癌症是实体癌。可通过本文所述方法治疗的肿瘤的非限制性实例包括例如癌、淋巴瘤、肉瘤、母细
胞瘤和白血病。非限制性具体实例包括例如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、所有组织病理学类型的脑癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、胃肠道癌、间皮瘤、与病毒感染相关的癌症(例如但不限于人乳头瘤病毒(hpv)相关的肿瘤(例如宫颈癌、阴道癌、外阴癌、头颈癌、肛门癌、和阴茎癌))。
[0425]
在某些实施方案中，根据本文公开的方法产生包含候选抗原
‑
肽的compact小基因。在某些实施方案中，产生包含抗原肽的compact多肽。
[0426]
在某些实施方案中，根据本文公开的方法产生包含compact多肽的颗粒。在某些实施方案中，根据本文公开的方法产生至少一种包含compact多肽的颗粒集合。
[0427]
在本文公开的治疗方法的某些实施方案中，t细胞通过与颗粒结合而被分离。在某些实施方案中，以这种方式分离的t细胞是从受试者获得的。在某些实施方案中，t细胞是cd8
+
t细胞。
[0428]
在某些实施方案中，分选分离的t细胞并分析其基因组。在某些实施方案中，获得分离的t细胞的tcr序列。在某些实施方案中，将tcr基因序列或其部分插入同源重组模板中。在某些实施方案中，同源重组模板包括国际专利申请号pct/us2018/058230中描述的特征，其内容通过引用整体并入本文。
[0429]
在某些实施方案中，通过插入包含分离的t细胞的tcr基因序列或其部分的同源重组模板来修饰t细胞。
[0430]
在某些实施方案中，修饰的t细胞被过继转移给患者。过继细胞转移(act)是一种有效的免疫治疗形式，并涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者体内。用于过继转移的淋巴细胞可来源于血液或切除肿瘤的间质，尽管此类细胞的其他来源是本领域已知的。在某些实施方案中，act中使用的淋巴细胞可以单剂量施用。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在某些实施方案中，淋巴细胞可以多剂量施用。给药可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。只要需要，可以继续施用细胞毒性淋巴细胞。在某些实施方案中，本文所述的方法可用于确定受试者的免疫组库。在某些实施方案中，在治疗前、治疗期间和/或治疗后分析免疫组库。在某些实施方案中，治疗是癌症治疗。在某些实施方案中，癌症治疗是免疫疗法。在某些实施方案中，免疫疗法包括施用抗体。在某些实施方案中，免疫疗法包括t细胞的过继细胞转移。在某些实施方案中，t细胞包含重组tcr或嵌合抗原受体。在某些实施方案中，免疫组库提供信息以提供靶向疗法。
[0431]
修饰细胞的方法
[0432]
在某些实施方案中，当前公开的主题提供了用于修饰细胞的方法。例如，但不作为限制，可以使用本文所述的方法和组合物获得修饰的细胞。
[0433]
在某些实施方案中，当前公开的主题提供了一种通过将同源重组(hr)模板核酸序列引入和重组到细胞的内源基因座中来修饰细胞的方法。在某些实施方案中，用非病毒方法修饰细胞。在某些实施方案中，hr模板核酸序列是环状的。在某些实施方案中，hr模板核酸序列是线性的。在某些实施方案中，hr模板核酸序列包含第一和第二同源臂。在某些实施
方案中，同源臂可为约300个碱基至约2,000个碱基。例如，每个同源臂可以是1,000个碱基。在某些实施方案中，同源臂可以与细胞的第一和第二内源序列同源。在某些实施方案中，内源基因座是tcr基因座。例如，第一和第二内源序列在tcrα基因座或tcrβ基因座内。在某些实施方案中，hr模板包含tcr基因序列。在非限制性实施方案中，tcr基因序列是患者特异性tcr基因序列。在非限制性实施方案中，使用本文所述的方法鉴定和获得tcr基因序列。例如，鉴定t细胞抗原特异性的方法可用于从患者获得tcr基因的序列，并可将所述tcr序列掺入hr模板中。在某些实施方案中，hr模板包含tcrα基因序列和tcrβ基因序列。关于hr模板核酸的另外信息和修饰其细胞的方法可发现于国际专利申请号pct/us2018/058230中，其内容以引用方式并入本文。
[0434]
在某些实施方案中，可以使用非病毒基因编辑方法将包含目标基因的构建体插入内源基因座中。在某些实施方案中，这可以通过使用同源修复模板来实现，所述同源修复模板包含侧接左侧和右侧hr臂的目标基因的编码序列。在某些实施方案中，除了hr臂之外，目标基因夹在2a肽,位于2a肽上游以便从上游翻译的目标基因中去除2a标签的蛋白酶切割位点,和信号序列之间；其中一旦整合到基因组中，目标表达基因盒的基因就被转录为单信使rna。在某些实施方案中，在目标基因信使rna的翻译过程中，侧翼区域通过自切割2a肽与目标基因断开连接，并且蛋白酶切割位点被切割以便从翻译的目的基因去除上游的2a序列。在某些实施方案中，除了2a和蛋白酶切割位点之外，可以在每个2a肽之前插入甘氨酸
‑
丝氨酸
‑
甘氨酸(gsg)接头以进一步增强目标基因与表达盒中其他元件的分离。在某些实施方案中，使用p2a肽是因为它们由于其有效切割而优于其他2a肽。在某些实施方案中，使用两(2)个p2a肽和密码子分歧(codon divergence)以表达目标基因而不在来自p2a肽的目标基因的任一端引入来自剩余氨基酸的任何外源表位。
[0435]
在某些实施方案中并且如pct/us/2018/058230中所述，neotcr被整合到t细胞的tcrα基因座中。在某些实施方案中，使用含有侧接左侧和右侧hr臂的neotcr编码序列的同源修复模板。在某些实施方案中，内源性tcrβ基因座被破坏，导致仅表达由neotcr构建体编码的tcr序列。在某些实施方案中，使用循环hr模板应用一般策略。在某些实施方案中，使用线性模板应用一般策略。
[0436]
在某些实施方案中，靶tcrα基因座(cα)与质粒hr模板一起显示，并且所得编辑序列和下游mrna/蛋白质产物显示在图67a和67b中。在某些实施方案中，neotcr盒中的附加元件包括：2a＝p2a核糖体跳跃元件；f＝2a上游的弗林蛋白酶切割位点，其从上游tcrβ蛋白中去除2a标签；hgh＝人生长激素信号序列。neotcr表达基因盒的hr模板包括两个侧翼同源臂，以便用tcrα引导rna直接插入crispr cas9核酸酶rnp靶向的tcrα基因组基因座中。在某些实施方案中，同源臂(lha和rha)侧接neotcr表达基因盒的neoe特异性tcr序列。在某些实施方案中，蛋白酶切割位点是本领域技术人员已知的可以使用的任何合适的蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，可以基于期望的运输(trafficking)和用途来选择本领域技术人员已知的任何信号序列。
[0437]
在某些实施方案中，一旦整合到基因组中，neotcr表达基因盒就被转录为来自内源性tcrα启动子的单个信使rna，其仍包括来自该个体t细胞的内源性tcrα多肽的一部分。在某些实施方案中，在单个neotcr信使rna的核糖体多肽翻译期间，neotcr序列通过p2a肽处的自切割与内源性crispr破坏的tcrα多肽断开连接。在某些实施方案中，编码的neotcrα
和neotcrβ多肽也通过内源细胞人弗林蛋白酶和neotcr表达基因盒中包含的第二自切割p2a序列基序的切割而彼此断开连接(图67b)。在某些实施方案中，neotcrα和neotcrβ多肽分别通过信号前导序列(例如，源自人生长激素，hgh)靶向内质网，用于多聚体组装和将neotcr蛋白复合物运输至t细胞表面。在某些实施方案中，包含弗林蛋白酶切割位点有助于从上游tcrβ链中去除2a序列以减少tcrβ功能的潜在干扰。在某些实施方案中，在每个2a之前包含gly
‑
ser
‑
gly接头(未显示)进一步增强了三个多肽的分离。
[0438]
在某些实施方案中，三个重复的蛋白质序列在hr模板内密码子分歧以促进基因组稳定性。在某些实施方案中，在tcr基因盒内,两个p2a相对于彼此密码子分歧,以及两个hgh信号序列相对于彼此密码子分歧，以促进引入的新tcr盒序列在离体工程改造的t细胞的基因组内的稳定性。在某些实施方案中，重新引入的trac外显子1的5’端(图67a和67b，垂直条)通过去除两个同向重复的间插序列而降低了整个盒随时间丢失的可能性。
[0439]
当前公开的主题进一步提供包含通过本文公开的方法修饰的细胞的组合物。
[0440]
示例性实施方案
[0441]
a.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供一种方法，包括：(a)使样品与多个不同的颗粒集合接触，其中每个颗粒包含独特的抗原肽,可操作地相关联的条形码，和至少一个识别标记，其中样品包含t细胞，并且其中接触包括提供适合单个t细胞与至少一个颗粒集合的独特抗原肽结合的条件；(b)分离与颗粒结合的一个或多个t细胞；(c)鉴定与分离的t细胞结合的颗粒的条形码；和(d)确定每个条形码的比率。
[0442]
a1.前述a的方法，其中该比率是通过鉴定第一条形码的拷贝数和第二条形码的拷贝数并将第一条形码的拷贝数除以第二条形码的拷贝数来计算的。
[0443]
a2.前述a或a1的方法，其中对于每个不同的颗粒集合，所述独特的抗原肽是相同的。
[0444]
a3.前述a
‑
a2任一项的方法，其中每个不同的颗粒集合包含至少一个或多个条形码，其中每个条形码与所述抗原肽的身份相关联。
[0445]
a4.前述a
‑
a3任一项的方法，其中每个条形码的比率对应于所述分离的t细胞的抗原特异性。
[0446]
a5.前述a
‑
a4中任一项的方法，其中如果所述第一条形码的比率高于阈值，则所述分离的t细胞被鉴定为抗原特异性t细胞。
[0447]
a6.前述a5的方法，其中所述阈值是至少或大于2,3,4,5,6,7,8,9,10,2
‑
5,3
‑
6,4
‑
7,5
‑
8,5
‑
10,7
‑
10或大于10。
[0448]
a7.前述a
‑
a6中任一项的方法，其中鉴定所述条形码包括基于核苷酸的测定。
[0449]
a8.前述a7的方法，其中所述基于核苷酸的测定是pcr、rt
‑
pcr、测序或杂交测定。
[0450]
a9.前述a7或a8的方法，其中所述基于核苷酸的测定确定(a)每个条形码的序列和/或(b)每个条形码的拷贝数。
[0451]
a10.前述a
‑
a9任一项的方法，其进一步包括获得t细胞受体(tcr)cdr序列。
[0452]
a11.前述a
‑
a10任一项的方法，其进一步包括获得tcr基因序列。
[0453]
a12.前述a11的方法，其中所述tcr序列是tcrα或tcrβ链序列。
[0454]
a13.前述a
‑
a12任一项的方法，其用于鉴定t细胞的抗原特异性。
[0455]
a14.前述a13的方法，其中所述t细胞的抗原特异性包括抗原肽的序列和结合的t
细胞的tcr序列。
[0456]
a15.前述a
‑
a14中任一项的方法，其中所述至少一个识别标记在每个不同的颗粒集合中是相同的。
[0457]
a16.前述a
‑
a15中任一项的方法，其包括至少两个不同的识别标记。
[0458]
a17.前述a
‑
a16中任一项的方法，其中所述至少一个识别标记是荧光团。
[0459]
a18.前述a17的方法，其中所述荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
[0460]
a19.前述a18的方法，其中所述至少两个不同的识别标记是荧光团，其中所述荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
[0461]
a20.前述a
‑
a19中任一项的方法，其中所述抗原肽选自由以下各项组成的组：肿瘤抗原、新抗原、肿瘤新抗原、病毒抗原、细菌抗原、磷酸抗原(phospho
‑
antigen)和微生物抗原。
[0462]
a21.前述a20的方法，其中所述新抗原是从受试者的肿瘤测序数据中鉴定的。
[0463]
a22.前述a21的方法，其中计算机预测算法用于确定新抗原。
[0464]
a23.前述a22的方法，其中所述预测算法进一步包括mhc结合算法以预测新抗原和mhc肽之间的结合。
[0465]
a24.前述a
‑
a23中任一项的方法，其中所述样品选自血液样品、骨髓样品、组织样品、肿瘤样品或外周血单核细胞(pbmc)样品。
[0466]
a25.前述a
‑
a24中任一项的方法，其中所述t细胞是人t细胞。
[0467]
a26.前述a25的方法，其中所述t细胞是cd8+t细胞。
[0468]
a27.前述权利要求a
‑
a26中任一项的方法，其中所述方法包括不同颗粒集合的文库。
[0469]
a28.前述a27的方法，其中所述文库包括2至500个不同的颗粒集合。
[0470]
a29.前述a
‑
a28中任一项的方法，其中每个颗粒包含mhc肽。
[0471]
a30.前述a29的方法，其中所述mhc肽是人mhc肽。
[0472]
a31.前述a29的方法，其中所述mhc肽是i类hla肽。
[0473]
a32.前述a29的方法，其中所述hla肽包括hla
‑
a、hla
‑
b或hla
‑
c肽。
[0474]
a33.前述a32的方法，其中所述hla肽包含hla
‑
a*01:01,hla
‑
a*02:01,hla
‑
a*03:01,hla
‑
a*24:02,hla
‑
a*30:02,hla
‑
a*31:01,hla
‑
a*32:01,hla
‑
a*33:01,hla
‑
a*68:01,hla
‑
a*11:01,hla
‑
a*23:01,hla
‑
a*30:01,hla
‑
a*33:03,hla
‑
a*25:01,hla
‑
a*26:01,hla
‑
a*29:02,hla
‑
a*68:02,hla
‑
b*07:02,hla
‑
b*14:02,hla
‑
b*18:01,hla
‑
b*27:02,hla
‑
b*39:01,hla
‑
b*40:01,hla
‑
b*44:02,hla
‑
b*46:01,hla
‑
b*50:01,hla
‑
b*57:01,hla
‑
b*58:01,hla
‑
b*08:01,hla
‑
b*15:01,hla
‑
b*15:03,hla
‑
b*35:01,hla
‑
b*40:02,hla
‑
b*42:01,hla
‑
b*44:03,hla
‑
b*51:01,hla
‑
b*53:01,hla
‑
b*13:02,hla
‑
b*15:07,hla
‑
b*27:05,hla
‑
b*35:03,hla
‑
b*37:01,hla
‑
b*38:01,hla
‑
b*41:02,hla
‑
b*44:05,hla
‑
b*49:01,hla
‑
b*52:01,hla
‑
b*55:01,hla
‑
c*02:02,hla
‑
c*03:04,hla
‑
c*05:01,hla
‑
c*07:01,hla
‑
c*01:02,hla
‑
c*04:01,hla
‑
c*06:02,hla
‑
c*07:02,hla
‑
c*16:01,hla
‑
c*03:03,hla
‑
c*07:04,hla
‑
c*08:01,hla
‑
c*08:02,hla
‑
c*12:02,hla
‑
c*12:03,hla
‑
c*14:02,hla
‑
c*15:02或hla
‑
c*17:01。
[0475]
a34.前述a
‑
a33中任一项的方法，其中每个颗粒包含hla肽和β2m肽。
[0476]
a35.前述a34的方法，其中所述β2m肽是人β2m肽。
[0477]
a36.前述a35的方法，其中所述β2m肽包含突变。
[0478]
a37.前述a36的方法，其中所述突变是s88c。
[0479]
a38.前述a
‑
a37中任一项的方法，其中每个颗粒包含多肽，该多肽在氨基到羧基末端方向上包含(i)抗原肽，(ii)β2m肽，和(iii)mhc肽。
[0480]
a39.前述a
‑
a38中任一项的方法，其中所述抗原肽的长度为7
‑
15个氨基酸，7
‑
10,8
‑
9,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸。
[0481]
a40.前述a38或a39的方法，其中所述多肽被生物素化。
[0482]
a41.前述a
‑
a40中任一项的方法，其中所述颗粒选自由以下各项组成的组：磁珠、琼脂糖珠、苯乙烯聚合物颗粒和葡聚糖聚合物颗粒。
[0483]
a42.前述a
‑
a41中任一项的方法，其中所述颗粒被链霉亲和素包被。
[0484]
a43.前述a
‑
a42中任一项的方法，其用于监测受试者中的免疫组库。
[0485]
a44.前述a43的方法，其进一步包括监测受试者中抗原特异性t细胞的变化。
[0486]
a45.前述a43或a44的方法，其包括对所述受试者施用免疫疗法。
[0487]
a46.前述a45的方法，其中所述免疫疗法是过继细胞转移或检查点抑制剂。
[0488]
a47.前述a
‑
a46中任一项的方法，其用于鉴定至少一个tcr序列。
[0489]
a48.前述a47的方法，其中所述至少一个tcr序列是tcrα序列、tcrβ序列或其组合。
[0490]
a49.前述a47或a48的方法，其进一步包括制造可溶性tcr多肽。
[0491]
b.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供包含至少两个颗粒集合的文库，每个颗粒集合包含抗原肽、与抗原肽的身份可操作地相关联的条形码和至少一个识别标记。
[0492]
b1.前述b的文库，其中所述至少一个识别标记在每个颗粒集合中是相同的。
[0493]
b2.前述b或b1的文库，其在每个不同的颗粒集合中包含至少两个不同的识别标记。
[0494]
b3.前述b
‑
b2中任一项的文库，其中所述至少一个识别标记是荧光团。
[0495]
b4.前述b3的文库，其中所述荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
[0496]
b5.前述b2的文库，其中所述至少两个不同的识别标记是荧光团，其中所述荧光团选自包括别藻蓝蛋白(apc)和藻红蛋白(pe)的组。
[0497]
c.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供一种颗粒，其包含至少一个多肽、条形码和识别标记，其中所述多肽包含抗原肽、β2m肽和mhc肽，并且其中所述条形码与所述抗原肽的身份可操作地相关联。
[0498]
c1.前述c的颗粒，其选自由以下各项组成的组：磁珠、琼脂糖珠、苯乙烯聚合物颗粒和葡聚糖(dextran)聚合物颗粒。
[0499]
c2.前述c或c1的颗粒，其中所述识别标记是荧光团。
[0500]
c3.前述c
‑
c2中任一项的颗粒，其被链霉亲和素包被。
[0501]
c4.前述c
‑
c3中任一项的颗粒，其中所述多肽被标记。
[0502]
d.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供了一种治疗受试者中癌症的方法，包括：(a)制备多个颗粒，每个颗粒包含多个标记的多肽，其中所述多肽包含抗原肽、β2m
序列、hla序列和可检测标记；(b)在适合t细胞与颗粒抗原特异性结合的条件下，使多个颗粒与来自受试者的多个t细胞接触；(c)分离与颗粒结合的t细胞并鉴定分离的t细胞的tcr基因序列；(d)制备包含同源臂和至少一个tcr基因序列的多核苷酸，其中tcr基因序列位于同源臂之间；(e)将多核苷酸重组到受试者t细胞的内源基因座中；(f)培养步骤的修饰的t细胞以产生t细胞群；和(g)将治疗有效数量的修饰的t细胞施用至受试者，从而治疗癌症。
[0503]
e.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供了一种修饰细胞的方法，包括：(a)将同源重组(hr)模板核酸序列引入细胞中，其中所述hr模板核酸序列包含(i)与细胞的第一和第二内源序列同源的第一和第二同源臂，(ii)通过根据a
‑
a49中任一项的方法获得的t细胞受体(tcr)基因序列，其中所述tcr基因序列位于第一和第二hr臂之间，以及(iii)位于tcr基因序列上游的第一2a编码序列和位于tcr基因序列下游的第二2a编码序列，其中所述第一和第二2a编码序列编码彼此密码子分歧的相同氨基酸序列；和(b)将hr模板核酸重组到细胞的内源基因座中，该基因座包含与hr模板核酸的第一和第二同源臂同源的第一和第二内源序列。
[0504]
f.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供了包含修饰的细胞的组合物，其中所述修饰的细胞包含整合到内源基因座中的外源核酸序列，所述外源核酸序列包含：(a)通过根据a
‑
a49中任一项的方法鉴定的tcr基因序列，和(b)位于所述tcr基因序列上游的第一2a编码序列和位于所述tcr基因序列下游的第二2a编码序列，其中所述第一和第二2a编码序列编码彼此密码子分歧的相同氨基酸序列。
实施例
[0505]
以下实施例仅是对当前公开的主题的说明，并且不应以任何方式视为限制。
[0506]
实施例1通过限制性消化克隆设计和克隆compact小基因
[0507]
用于限制性消化的compact小基因的结构：
[0508]
compact小基因的基本组分包括指导所编码蛋白质分泌的信号序列、通用靶序列例如限制性位点或引物结合位点、编码的抗原肽(或新抗原，neoe)、第二通用靶位点、β2m、mhc等位基因的胞外结构域和纯化簇，例如，通过亲和标签实现compact的酶促修饰(例如生物素化)和纯化。簇还可以包含蛋白酶切割位点和在图中和实施例中所示的组分之间的接头序列。小基因还可以编码可充当二硫化物阱的半胱氨酸突变。本文制备和公开的某些compact小基因编码充当二硫化物阱的半胱氨酸突变。为了通过稳定蛋白质来增加制造compact多肽的成功率，此类小基因被制成包括二硫化物阱。图1显示了compact小基因图示。mhc重链序列上游和下游的额外限制性位点可用于插入其他mhc等位基因以构建不同的mhc模板并构建mhc模板库(图2)。编码信号序列的dna、通用靶序列、β2m和mhc等位基因的胞外域是基本mhc模板。
[0509]
对于限制性消化克隆方法，每个compact dna构建体是基本mhc模板，其带有包含三个框架中的终止密码子的虚拟抗原序列插入物和一个用于破坏未切割或重新连接的模板的独特限制性位点(图3)，并且可以用作现成平台的一部分，用于快速组装与该mhc等位基因复合的抗原肽文库。mhc等位基因也可以被修饰或突变(例如，y84a或y84c)，例如，以改善折叠或增加抗原肽与mhc蛋白的结合。此外，β2m蛋白也可以发生突变(例如，s88c)，例如，以便使其与硫醇染料结合。
[0510]
在该实施例中，显示了具有以下结构的compact小基因：5’端的noti限制位点；来自人生长激素hgh的信号序列，如表1所示；抗原肽区域上游的限制性位点blp1和抗原肽区域下游的bamhi限制性位点，如表2所示；主要由甘氨酸和丝氨酸残基组成的编码的接头序列(即gly
‑
ser接头)；β2m序列；带有bspi限制性位点的第二编码的gly
‑
ser接头序列；mhc重链；具有bstbi限制性位点的第三编码的gly
‑
ser接头序列；以及带有avitag(或任何抗生物素蛋白/链霉亲和素)序列、tev切割位点和串联组氨酸标签的编码的纯化簇。
[0511][0512][0513][0514]
compact小基因的限制性消化克隆和组装
[0515]
本文描述了通过限制性消化插入编码的新抗原的三种不同方法。在第一种方法中，如图4所示，编码抗原肽(neoe)的引物跨越5’端的第一限制性位点(在本实施例中为blpi)和3’端的第二限制性位点(在本实施例中为bamhi)。该引物扩增出编码第二限制性位点的通用反向引物，产生约70bp的引物二聚体。
[0516]
在第二种方法中，编码抗原肽的引物跨越作为5’端的第二限制性位点，并且是抗原编码序列的反向互补序列。该引物在编码信号序列的模板dna的反向方向上引发。与跨越第一限制性位点序列的正向引物配对，如果使用跨越抗原位点上游更远的限制性位点的正向引物，该反应产生70bp的产物，或约140bp的产物。
[0517]
在第一种和第二种方法中，插入物通常在商业柱上清洗，用合适的限制性内切酶消化，在商业柱上再次清洗，然后与预消化的mhc模板连接到载体中。将连接反应转化到大肠杆菌中，并且从转化的大肠杆菌中制备的质粒用于哺乳动物生产细胞转染反应。
[0518]
实施例2通过引物退火设计和克隆compact小基因
[0519]
在mhc模板载体连接的第三个变型中，通过将两个反向互补的新抗原编码引物退火，绕过了pcr和限制性消化。这些引物设计为具有5’和3’末端，它们以互补序列开始和终止，所述互补序列模拟限制性消化产生的突出端(图5)。有义和反义引物与t4多核苷酸激酶和atp一起温育以磷酸化5’末端(图22a)。当这些引物彼此退火时，它们形成双链寡核苷酸序列，该序列具有突出端核苷酸，就像用限制酶消化过一样。
[0520]
将磷酸化的新抗原插入物(或者称为新表位)连接到载体中的预切mhc模板中。
compact小基因具有与实施例1中所述相同的结构。然后将连接产物用于线性compact扩增子的pcr扩增，使用bookend通用引物扩增完整的compact小基因并测序。使用这种方法制备了824个具有独特新抗原序列(或者称为新表位序列)的compact小基因，其中超过99％的生成的compact小基因具有正确的新抗原序列(或者称为新表位序列)(图22b)。克隆到compact多核苷酸中并表达为多肽的新抗原序列(或者称为新表位序列)基于从患者样品(例如，肿瘤样品或表达肿瘤抗原的其他患者样品)鉴定的肿瘤新抗原。基于已鉴定的新抗原，为每个已鉴定的新抗原制作了一系列预测的新抗原序列(备选地称为新表位序列)。
[0521]
接下来，用连接产物质粒转化大肠杆菌并铺板到含有氨苄青霉素的选择性琼脂板上。挑选单个菌落并过夜生长以进行质粒纯化并测序以进行完整的基因验证。测序验证后，质粒批次被存档并繁殖成更大的数量。
[0522]
或者，如果预切的mhc模板载体在其突出端保留5’磷酸酯，则不使用t4激酶。然后可以将退火的抗原插入物新抗原序列(也称为新表位插入物)与切割的mhc载体连接，并将连接产物转化到大肠杆菌中用于质粒生产。
[0523]
实施例3通过pcr组装设计和克隆comppact小基因
[0524]
用于pcr组装的comppact小基因的结构：
[0525]
也可以使用插入抗原例如新抗原的第四种方法(为了清楚起见，如用于本实施例的，均指图6中的neoe插入物和如实施例2中描述的新表位)。在该方法中，将抗原编码序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，抗原编码序列是指实施例2中描述的新表位序列)插入到mhc模板中，该模板通过聚合酶链反应侧接上游启动子和下游多聚腺苷酸化信号以形成2.5kb的小基因。pcr组装反应示意图如图6所示。
[0526]
在该实施例中，compact小基因显示为具有以下结构：5’端的启动子；具有第一通用靶标序列的信号序列；编码的抗原肽；具有主要由甘氨酸和丝氨酸残基组成的编码接头序列(即glyser接头)的第二通用靶序列；β2m序列；第二编码的gly
‑
ser接头序列；mhc重链等位基因；第三gly
‑
ser接头序列；纯化簇；和polya序列。在该示例性方法中，通用靶序列不相同，即，它们彼此不同。
[0527]
comppact小基因的pcr组装：
[0528]
在该方法中，合成了具有选定抗原序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，抗原序列是指新抗原序列)的两个引物(<60nt)。第一个引物在5’端具有新抗原序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，新抗原序列是指实施例2中描述的新表位序列)，随后在3’端具有第二通用靶序列段。第二个引物在5’端具有新抗原序列的反向互补序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，新抗原序列是指实施例2中描述的新表位序列)，并且在3’端具有第一通用序列的反向互补序列。这些引物与编码启动子区、信号序列和第一通用靶序列的dna片段以及编码第二通用靶序列、β2m序列、mhc等位基因、纯化簇和polya序列的另一dna片段混合。每个抗原肽引物与其互补序列退火，并进行pcr反应，将新抗原序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，新抗原序列是指实施例2中描述的新表位序列)扩增到启动子片段或mhc等位基因片段上。这两个新合成的片段现在每个都具有新抗原序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，新抗原序列是指实施例2中描述的新表位序列)。进一步的pcr反应，连同启动子序列的5’端和polya序列的3’端的引物，允许新抗原序列(为了清楚起见，如用于本实施例的，新抗原序列是指实施例2中描述的新表位序列)彼此退火并引发全长线性compact扩
增子的组装。
[0529]
然后将完全组装的线性compact多核苷酸清洗，用于直接转染到哺乳动物生产细胞中，绕过使用大肠杆菌和质粒生产的步骤。
[0530]
实施例4质粒中compact蛋白的表达和纯化
[0531]
蛋白质的表达
[0532]
neoantigen12(neo12)被连接到hla
‑
a2模板序列中并通过noti和bamhi限制性位点的限制性消化和连接插入到表达质粒(ppact0010)中，如先前在实施例1中所述。
[0533]
在第
‑
1天，用与expifectamine转染试剂温育的ppact0010转染30ml摇瓶体积中的expi293哺乳动物生产细胞。在第0天添加expifectamine转染试剂盒中包含的增强子。在第1天至第7天从细胞上清液中收集样品，并通过sds
‑
page和使用safestain(thermofisher)的总蛋白染色评估分泌的蛋白。分泌的compact蛋白水平一直增加到第3天，此时蛋白分泌趋于平稳(图7)。分泌的compact蛋白最初通过其表观分子量(＝53kda)进行鉴定，并通过使用nta
‑
hrp以检测his6亲和标签(seq id no:34)的蛋白质印迹进行确认。
[0534]
蛋白质的纯化
[0535]
在第7天收集的neo12 compact蛋白通过ni
‑
nta亲和层析经由his6亲和标签(seq id no:34)的结合进行纯化。通过sds
‑
page和safestain分析样品的总蛋白。亲和柱的流穿(ft)级分中缺少compact蛋白证实了his6标签(seq id no：34)在表达和纯化过程中没有被切割(图8)。每升培养体积的纯化产量>400mg。
[0536]
neo12 compact蛋白被生物素化(在下面的实施例5中讨论)并通过尺寸排阻层析进一步纯化。观察到单个主峰，表明蛋白质正确折叠和单体，几乎没有聚集(图9)。第二峰是atp，其被添加用于bira催化的生物素化反应。
[0537]
虽然在实施例4中使用了ni
‑
nta层析，但是任何ha
‑
亲和层析(包括但不限于本文所述的金属亲和层析)都可以用于纯化ha标签化的compact。
[0538]
生产体积的优化和平行生产
[0539]
compacts的生产从摇瓶中的30ml培养体积缩小到96深孔摇块中的0.7ml。expi293哺乳动物生产细胞用含有ppact0010质粒的质粒dna转染，并如前所述纯化分泌的neo12 compact蛋白。相比于之前描述的30ml纯化实验的产量>400mg/l，从0.7ml孔体积中收集了437mg/l的纯化neo12 compact蛋白质(图10)。0.7ml实验的蛋白质产量对应于>300微克的蛋白质，或比典型流式细胞术实验所需的蛋白质产量高约1000倍。
[0540]
接下来，评估多个compact构建体的平行表达。具有不同新抗原(新抗原10、15、64、65、66、67、80和83)的八种不同的compact构建体在30ml摇瓶中表达，作为中通量测定(图11)。如前所述，将每个compact构建体转染到细胞中，其中compact蛋白表达并分泌到细胞上清液中。将表达的蛋白质如前所述纯化、浓缩和标准化。如前所述测定粗上清液样品和浓缩蛋白质的总蛋白质。compact蛋白通过尺寸排阻层析纯化(图12)。对于每种蛋白质都观察到一个包含2
‑
20mg蛋白质的单峰，这也表明compact蛋白质是正确折叠的和单体的。
[0541]
实施例5来自线性扩增子的compact蛋白的表达和纯化
[0542]
在前面的实施例中，从转染到哺乳动物生产细胞中的质粒表达compact蛋白。作为替代方法，侧翼为启动子序列和polya序列的neo12comppact小基因(组装到具有hla
‑
a2模板序列的小基因中的新抗原12)的线性扩增子被转染到96深孔板中的0.7ml生产细胞中。作
为对照，ppact0010质粒也被转染到单独的生产细胞中。如前所述，表达、纯化和测定来自两个样品的蛋白质的总蛋白质。线性扩增子和质粒都产生了相似水平的表达蛋白(图13a)，这表明可以在不需要质粒中间体的情况下生产由compact小基因编码的蛋白质。已经产生了具有不同新表位序列的多个不同的compact小基因(图13b)，用于直接转染生产细胞。
[0543]
使用实施例2中描述的退火和磷酸化工作流程制备具有不同hla等位基因的另外的compact。使用bookend pcr和通用引物从表达载体中获得线性扩增子，并转染到expi293f细胞中用于compact蛋白生产(数据未显示)。
[0544]
实施例6compact蛋白的生物素化
[0545]
用分离的bira酶对compact进行体外生物素化
[0546]
compact纯化簇包括用于生物素化的bira识别序列(avitag)。纯化的compact蛋白未被生物素化(无bira处理)或用商业bira蛋白根据制造商的说明进行生物素化(bira处理)。过夜bira酶处理后，将样品与两种不同类型的磁性链霉亲和素珠(c1和t1)结合并温育，使生物素化蛋白质与链霉亲和素珠结合。通过sds
‑
page分离上清液(sn)和珠子(“沉淀”，p)。用safestain测定样品的总蛋白，并通过蛋白质印迹和nta
‑
hrp测定compact蛋白的存在(图14)。在未处理的样品中，compact蛋白主要发现于sn级分中，证实它是未生物素化的。在生物素化样品中，在c1和t1链霉亲和素珠的沉淀样品中都发现了compact蛋白，尽管生物素化蛋白与c1链霉亲和素珠之间的相互作用最为完全。在c1链霉亲和素珠耗尽的上清液中通过蛋白质印迹未检测到生物素化的compact蛋白，这表明约100％的compact蛋白被生物素化。
[0547]
在纯化之前，compact蛋白也可以在澄清的上清液中进行生物素化。如前所述，在生产细胞中表达了多个compact蛋白。收集细胞培养上清液并通过离心澄清。根据制造商的说明，用商业bira蛋白处理澄清的上清液，然后通过ni
‑
nta亲和层析纯化，并通过蛋白质印迹评估生物素化(图15)。使用此方法对所有测试的compact蛋白进行生物素化，表明在澄清的细胞上清液中对compact蛋白进行生物素化是有效的。虽然在实施例6中使用了ni
‑
nta层析，但是任何ha
‑
亲和层析(包括但不限于本文所述的金属亲和层析)都可以用于纯化ha标签化的compact。
[0548]
为了产生足够的bira用于compact蛋白的高通量生物素化，在大肠杆菌细胞中表达具有his6标签(seq id no:34)的bira蛋白。这种带有his6标签(seq id no:34)的bira通过ni
‑
nta亲和层析纯化(图16b)，并可用于生物素化compact蛋白。还通过ni
‑
nta亲和层析表达和纯化具有tev可切割his6标签(seq id no:34)的bira
‑
his6的第二版本(公开为seq id no:34的“his6”)(图16c)。这种bira
‑
tev
‑
his6蛋白(公开为seq id no:34的“his6”)可以通过ni
‑
nta纯化，通过tev切割去除his6标签(seq id no:34)，然后将无标签的bira用于生物素化的compact蛋白质。在对compact蛋白进行生物素化后，可以通过ni
‑
nta亲和层析纯化无标签的bira蛋白。此外，tev蛋白酶在大肠杆菌中异源表达，以与bira
‑
tev
‑
his6(公开为seq id no:34的“his6”)(图16a)一起用于生物素化的compact蛋白生产。虽然在实施例6中使用了ni
‑
nta层析，但是任何ha
‑
亲和层析(包括但不限于本文所述的金属亲和层析)都可以用于纯化ha标签化的compact。
[0549]
还评估了生物素化后compact蛋白上his6标签(seq id no:34)的切割，结果如图17所示。compact蛋白用bira处理或未处理以使其生物素化，如先前所述(图17的泳道1和
hplc系统的大小排阻层析柱(agilent sec bio 300)(sec
‑
hplc)根据制造商的说明进行纯化。结果显示在图25a
‑
c中。如通过sec
‑
hplc通过测量单体峰的曲线下面积除以整个层析图下的面积所评估的，将compact多肽纯化为单分散多肽(图25a和25b)。大多数compact多肽以高滴度表达(图25c)。所描述的每个hla等位基因的至少一种compact蛋白已通过hplc纯化和表征，表明compact平台是稳健的并且适用于许多等位基因。
[0558]
实施例10 impact t细胞分离方法
[0559]
材料和方法
[0560]
compact文库制备
[0561]
在实验之前制备具有三个compact文库元件和条形码的配对pe和apc四聚体颗粒。生物素化的comppact(1μm，内部生成)和dna条形码(1μm，idt)以3:1的摩尔比混合。加入pe
‑
链霉亲和素(3.33μm，life technologies)或apc
‑
链霉亲和素(6.26μm，life technologies)以1:4的比例与生物素反应。温育后，引入额外的生物素以占据游离链霉亲和素位点。
[0562]
cd8 t细胞染色
[0563]
细胞与40nm荧光compact四聚体一起温育用于新抗原特异性t细胞染色。随后加入fc受体封闭溶液以使非特异性抗体染色最小化。样品还与含有fitc cd4,cd14,cd19,cd20,cd40,percp
‑
cy5.5 cd8,bv711 cd45ra,bv786 cd95和bv510 ip26(biolegend)的抗体混合物一起温育，以鉴定t细胞的表型。
[0564]
单细胞分选
[0565]
使用facsaria iii(bd biosciences)将荧光标记的细胞分选成单个细胞。首先基于ip26和cd3染色对细胞针对t细胞表型进行分选，然后基于apc和pe染色针对双p
‑
hla结合进行分选。将compact阳性细胞分选到含有10mm tris和rnase抑制剂(promega)的裂解缓冲液的96孔板中。
[0566]
tcr克隆
[0567]
制备含有以下试剂的rt
‑
pcr主混液(master mix)：无核酸酶水(invitrogen)、5x缓冲液(qiagen)、10mm dntp(qiagen)、α多引物混合物、β多引物混合物、α反义引物、β反义引物、dna条形码有义引物、dna条形码反义引物(所有引物均通过idt订购)、onestep rt
‑
pcr酶(qiagen)和kod聚合酶(millipore)。然后将rt
‑
pcr主混液添加到每个孔中，以启动tcr和dna条形码序列的逆转录和聚合酶链式扩增。
[0568]
灵敏度和s/n测定
[0569]
将表达针对mart1抗原(f5)或新抗原neo12的tcr的cd8 t细胞与具有相应compact新抗原元件(mart1或neo12)的荧光compact颗粒一起温育。如上所述通过facs对细胞进行染色和分选(图29a
‑
c)。
[0570]
将表达针对新抗原neo12的tcr的cd8 t细胞以1比300,000的比例掺杂到对照pbmc样品中。掺杂的样品与33个四聚体文库一起温育，该文库包括neo12 compact和32个额外的新抗原compact元件。基于上述apc和pe双标记cd8 t细胞的门控策略对单个细胞进行分选(图30)。
[0571]
特异性和s/n测定
[0572]
将表达针对新抗原neo12的tcr的cd8 t细胞以1比300,000或1比30,000的比例掺
杂到对照pbmc样品中。pbmc单独用作阴性对照。掺杂的样品与包含neo12 compact和28个不相关对照compact元件的文库一起温育。基于上述apc和pe双标记cd8 t细胞的门控策略对单个细胞进行分选。确定了条形码和与给定细胞相关联的每个条形码的信噪比。
[0573]
结果
[0574]
灵敏度
[0575]
图29a提供了用于分离pact新抗原cd8 t细胞(上图)和四聚体阳性双标记t细胞(下图)的内源性tcr门控策略的示意图。将表达新抗原f5(图29b)或neo12(图29c)的t细胞进行标记和根据门控策略进行门控。相应的四聚体染色对f5和neo12 comppact新抗原t细胞产生了超过99％的精确度。该测定的重复导致基因编辑的f5和neo12 t细胞的四聚体染色超过99％(数据未显示)。因此，impact方法具有大于98％或99％的高染色和分选灵敏度。
[0576]
为了测试impact四聚体方法的灵敏度，进行了细胞掺杂实验。将表达新抗原neo12的t细胞以1比300,000的比例(每300,000个pbmc1个neo12 t细胞)掺杂到对照pbmc样品中。使用从neo12 compact和32个不相关对照compact制备的四聚体进行impact四聚体分析。如上所述从cd8 t细胞门控中分选出对33个compact四聚体呈阳性的细胞。针对相关的tcr和neoid序列对细胞进行测序。测序后，使用信噪比(s/n)来确定四聚体结合的特异性。本实施例的s/n计算是最主要的neoid的dna拷贝数除以第二最主要的neoid的dna拷贝数。在本实施例中，大于10的s/n被认为是compact与t细胞的特异性结合。每个细胞的ip26染色的索引流动(indexed flow)结果表明了给定的细胞是基因编辑的还是幼稚的。
[0577]
表4总结了从该实验中分选的细胞。通过流式细胞术分析了1686,717个总细胞，并从阳性门中分选了11个细胞。
[0578][0579]
11个阳性细胞中的5个具有高于10的s/n(平均s/n＝83.1)，而其他6个具有低于10的s/n(平均＝1.1)。根据neo12掺杂细胞的比率(1:3000,000)和处理的细胞数(1,686,717)，分析的样品中应该有大约5
‑
6个neo12细胞。测序结果表明，使用该方法分离得到5个neo12细胞。因此，impact四聚体方法足够灵敏，可以以1/300,000的低频率分离抗原特异性细胞。图30显示了1:300,000掺杂样品的门控facs细胞。tcr
‑
表示neo12阳性t细胞，而tcr+表示非特异性结合的t细胞。特异性neo12细胞的平均s/n比为83，而非特异性细胞的平均s/n比为1.1。
[0580]
特异性
[0581]
接下来，评估impact分离方法的新抗原特异性。使用包含添加到pbmc样品中的neo12 compact和28个不相关对照compact的第二文库重复neo12掺杂测定。pbmc单独用作阴性对照。分离双阳性细胞，对条形码进行测序，并确定与给定细胞相关联的每个条形码的s/n比。图31显示了neo12抗原掺杂的pbmc样品和未掺杂的pbmc样品的pe和acp facs门控数据。总结条形码s/n测序结果的表格显示于每个测试下方。在特异性测试中，s/n平均值为
mix)：无核酸酶水(invitrogen)、5x缓冲液(qiagen)、10mm dntp(qiagen)、α多引物混合物、β多引物混合物、α反义引物、β反义引物、dna条形码有义引物、dna条形码反义引物(所有引物均通过idt订购)、onestep rt
‑
pcr酶(qiagen)和kod聚合酶(millipore)。然后将rt
‑
pcr主混液添加到每个孔中，以启动tcr和dna条形码序列的逆转录和聚合酶链式扩增。进行了另外两轮pcr以进一步扩增tcr和dna条形码序列，并附加用于下一代测序(ngs)的接头序列。
[0593]
下一代测序
[0594]
使用推荐的试剂在miniseq(illumina)上进行下一代测序。文库制备按照illumina推荐的方案进行。将靶种类和phix等量混合以提供多样性。
[0595]
结果
[0596]
首先，使用具有hla a02:01等位基因类型的26元件compact文库分析iiia期黑素瘤患者样品(pact032)。在样品中的3.9x106个pbmc中，231个对apc和pe呈双重阳性。分析细胞的neoid条形码并确定所有双阳性细胞的信噪比。图33a显示了双阳性t细胞的facs点图。neoid测序后，一个t细胞显示出对一个突变的特异性，信噪比(s/n1)大于10。该新抗原tcr被克隆并针对预测的新抗原进行筛选。其余双阳性细胞的信噪比均为1，并且对与结合的compact相关联的新抗原没有特异性。二级筛选(图33b)证实了通过影响分析分离的新抗原tcr的特异性。下面的表5提供了特异性和非特异性t细胞的信噪比的总结。
[0597]
表5
[0598]
tcr克隆型计数s/n(umi)tcr+2301pact32
‑
tcr75113
[0599]
实施例12 s/n1和s/n2分析以便鉴定tcr
[0600]
接下来，使用具有hla a02:01，a24:02，b18:01和c07:01类型的138元件compact文库分析iii期黑色素瘤患者样品(pact077)。在样品中的5.1x106pbmc中，250个对apc和pe呈双重阳性。分析细胞的neoid条形码并确定所有双阳性细胞的信噪比。图34a显示了双阳性t细胞的facs点图。图34d显示了在外周血中鉴定的新抗原特异性t细胞。星号表示由肿瘤测序在肿瘤浸润淋巴细胞(til)中发现了相同的tcr克隆型。neoid测序后，25个t细胞显示出对一个突变的特异性，信噪比(s/n1)大于10(图34c)。图34b显示所有候选细胞都来自经历过抗原的cd95+细胞。新抗原tcr被克隆并针对预测的新抗原进行筛选。图34e显示了能够识别同源抗原的neotcr基因编辑的淋巴细胞的百分比。其余双阳性细胞的信噪比均为1，并且对与结合的compact相关联的新抗原没有特异性。下面的表6总结了针对所选新抗原的t细胞的信噪比。
[0601]
表6
[0602]
seq id no:新抗原平均s/n203eyipgttfl25204iyniivttl43205ktsvalhli19206hlslellgvd21207deyipgttf32
[0603]
有趣的是，对来自pact077的tcr的分析鉴定了8个不同的tcr。其中6个具有大于10的s/n1比，并被证实为特异性新抗原t细胞。对于其他2个t细胞，s/n1比低于10，但s/n2比高于10(图34c)。两个tcr(tcr143和tcr164)的克隆表明它们可以识别共享相同突变的两个不同的新抗原，进一步解释了低s/n1的原因(图35a)。这些结果表明，当存在多个源自相同突变的新抗原时，s/n2比可用于区分非特异性细胞和特异性细胞。
[0604]
二级筛选(图35b)证实了通过impact分析分离的新抗原tcr(即，tcr135,tcr136,tcr139,tcr142,tcr144和tcr145)的特异性。
[0605]
图36显示分离的tcr在突变之间变化，具有不同克隆性水平、截断性和原位新抗原表达水平。
[0606]
实施例13使用双neoid条形码分离新抗原t细胞
[0607]
材料和方法
[0608]
四聚体制备
[0609]
如上所述制备配对的荧光四聚体颗粒，不同之处在于每个颗粒对具有与新抗原相关联的不同的独特neoid条形码(参见图28的双条形码配对颗粒的图)。
[0610]
cd8选择和细胞染色
[0611]
解冻冷冻保存的患者pbmc并使用cd8+t细胞分离试剂盒(miltenyi)根据制造商推荐的方案选择cd8 t细胞。如前所述，分离的cd8t细胞用于随后的染色。
[0612]
单细胞分选和tcr克隆
[0613]
如前所述，使用facsaria iii(bd biosciences)将荧光标记的细胞分选成单个细胞。
[0614]
下一代测序
[0615]
如前所述，使用推荐的试剂在miniseq(illumina)上进行下一代测序。
[0616]
结果
[0617]
pact049(4阶段crc,幼稚的)pbmc是使用impact方法和双条形码进行筛选的。产生了六元件双条形码compact文库(hla
‑
b57:01,a01:01和c06:02)并用于询问新抗原tcr。分选了352个单细胞。测序分析后，针对一种hla
‑
b57:01新抗原rcspeqlkkaw(seq id no:208)鉴定了三个新抗原tcr候选物(图37a)。这三个候选物根据四聚体mfi(平均荧光强度)进行分选，并且都被认为是经历过抗原的cd95+(图33b)。在克隆pact049新抗原t细胞后，这些tcr是用相关预测的新抗原通过dextramer染色确认的(图37c和图37d)。
[0618]
实施例14从患者样品中额外分离新抗原t细胞
[0619]
另外的患者样品与compact文库一起温育并根据上述impact方法分离。使用impact信噪比方法和单或双条形码方法分析患者样品。图38a中提供了从每个样品和癌症类型鉴定的新抗原数量和hla类型的图，并且图38b中列出了hla类型。在五种癌症类型和来自外周的13种hla类型中鉴定了32种新抗原特异性tcr。在结直肠癌(11)、黑色素瘤(7)、膀胱癌(3)、子宫内膜腺癌(1)和头颈癌(1)样品中鉴定了新抗原。两个患者样品(pact056和095)未产生任何新抗原特异性tcr。四个患者样品(pact032,052,053和078)具有一种新抗原特异性tcr。在以下七个样品中的每一个中都分离出多个新抗原特异性tcr：pact035,036,037,049,077,131和133。多个新抗原特异性tcr能够为患者选择最佳tcr。两个样品(pact077和078)具有外周tcr，这些tcr也通过til的深度测序在原位发现。这些结果表明，
接受药物治疗的患者的新抗原特异性tcr鉴定成功率为100％，未接受治疗的患者的新抗原特异性tcr鉴定成功率大于80％。
[0620]
结果表明，impact技术能够以高精度和特异性从患者样品中成功地分离抗原配对的、新抗原特异性的tcr。由于impact技术靶向新抗原并且抗原呈递途径具有通用性，因此impact平台技术可应用于不同的癌症类型，从而能够开发个性化的neotcr
‑
t细胞疗法以根除实体瘤。
[0621]
实施例15 t细胞分离方法的再现性
[0622]
接下来，使用compact元件文库来分析健康供体的pbmc。如前所述制备了具有针对巨细胞病毒(cmv)、eb病毒(ebv)和流感的新抗原的15个配对荧光compact(hla a02:01)。将compact文库与pbmc一起温育，并分选和分离双阳性t细胞。如前所述，对neoid条形码进行测序，并对tcr进行克隆和测序。该实验一式三份进行。
[0623]
图39a显示了在三个重复的每一个中具有针对cmv和ebv的新抗原的分离的t细胞的抗原特异性百分比。图39b显示了从每个实验中分离的tcrα链的数量。表7提供了已鉴定的tcrα链的总结。确定了14个独特的tcrα链，并且14个中有10个在所有三个实验中共享。该再现性实验显示，在独立实验中，impact方法可以始终如一地从同一样品中以相似的水平分离抗原特异性t细胞，这表明通过将细胞与具有不同荧光团的配对compact四聚体一起温育来分离双阳性t细胞的方法在多种设置中具有高度可再现性。
[0624]
表7
[0625][0626]
实施例16使用compact四聚体、dextramer和三聚体的t细胞分离比较
[0627]
评估了在双重染色方法中compact文库元件的四聚体、dextramer和三聚体的分离效率。将具有四个拷贝的各compact元件的链霉亲和素核心的四聚体(四聚体)，具有三个拷贝的各compact元件和核酸条形码的链霉亲和素核心的三聚体(三聚体+dna)，和具有多拷贝compact元件的葡聚糖多聚体(带有和不带有核酸条形码)的dextramer(dextramer和
dextramer+dna)与经过基因编辑以过表达f5(mart1)或neo12新抗原的t细胞一起温育。基于上述实施例10中描述的门控策略分离t细胞并且量化通过每种染色方法分离的双染色t细胞的百分比。如图40a(f5 t细胞)和图40b(neo12抗原特异性t细胞)所示，大于98％的基因编辑细胞被相应的compact元件染色。数据表明，对于具有共同tcr(f5 mart
‑
1)和新抗原tcr(neo12)的t细胞，四聚体、dextramer、含dna的三聚体和含dna的dextramer，实现了相似的染色效率。
[0628]
实施例17信噪分析的比较
[0629]
将pact neo12 t细胞、pact m1w t细胞和病毒供体pbmc与具有核酸条形码的三聚体compact颗粒(trimer+dna)和具有核酸条码的具有多个拷贝compact元件的dextramer(dextramer+dna)一起温育。通过facs将细胞分选为单个细胞。每个样品的tcr alpha/beta和neoid条形码都被克隆和测序。所有tcr均被确认对neo12、cmv或m1w是正确的。如前所述对每个细胞进行s/n分析。对于每个样品，每种方法(三聚体，t；或dextramer，d)的s/n比显示在图41a中。图41b中提供了每种方法的s/n比的平均值。值得注意的是，neoid条形码dna信噪比的分析表明，与用dextramer+dna分离的细胞相比，用trimer+dna颗粒分离的细胞具有更高的信噪比。数据表明trimer+dna颗粒与dextramer+dna相比具有更好的s/n比。
[0630]
实施例18从癌症免疫疗法后的患者样品中分离和表征新抗原t细胞
[0631]
将患有pmmr结肠直肠癌(通常认为对抗pd1抗体疗法无反应)或子宫内膜腺癌的受试者用ab122(抗pd
‑
1抗体)治疗。将治疗前的血液样品与compact文库一起温育，并根据上述impact方法进行分离，以鉴定新抗原特异性t细胞的基线组库。然后在不同时间点收集pbmc，并通过impact信噪比方法进行分析，以监测突变靶向t细胞组库的治疗演变。监测ab122治疗期间新抗原特异性t细胞组库的变化，以实现免疫表型与临床结果的相关性。
[0632]
结果
[0633]
图42a
‑
c的上图显示了在治疗结肠直肠癌pact157(图42a)和pact132(图42b)；或子宫内膜癌pact131(图42c)患者期间外周血中新抗原特异性t细胞的纵向演变。
[0634]
图42a
‑
c的下图显示了每个样品的新抗原克隆性和预测的新抗原
‑
hla结合亲和力。顶部的点表示克隆突变，而底部的点表示亚克隆突变。
[0635]
图42a
‑
c还显示了通过impact方法在每个受试者中鉴定的每个tcr的基因、hla类型和新抗原序列。
[0636]
在治疗期间对患者的纵向监测能够分析靶向新抗原的t细胞并鉴定与治疗益处相关的驱动突变。此外，监测响应免疫疗法的新抗原特异性t细胞组库的变化可以为下一步的治疗提供信息。
[0637]
实施例19来自pact131的新抗原特异性t细胞的表型和功能表征
[0638]
将通过impact分离技术方法从患者样品pact131分离的t细胞针对细胞表面标志物cd45ra、cd95、cd39和cd103通过流式细胞术进行表征。在第1、15和57天从患者分离的t细胞的流式细胞术结果如图43所示。黑点表示新抗原特异性t细胞。cd45ra+cd95+t细胞经历抗原，而cd39+cd103+阳性表明t细胞已通过肿瘤区室运输。
[0639]
接下来，将针对从患者样品捕获的相同pik3ca新抗原靶标的三个tcr克隆(tcr200、tcr202和tcr205)进行表征。编辑t细胞以表达选定的tcr。图44a中显示了活的、cd8+和cd4+t细胞的百分比。新抗原特异性t细胞的激活是通过将编辑的t细胞与增加量的
hla同源肽一起温育并测量ifnγil2和tnfα的分泌来确定的。每个tcr克隆的细胞因子释放如图44b所示。所有t细胞都被同源新抗原激活。未检测到针对非同源新抗原的细胞因子释放(数据未显示)。
[0640]
实施例20使用impact方法验证从黑色素瘤患者样品中分离的neotcr
[0641]
材料和方法
[0642]
compact文库制备
[0643]
使用肿瘤活检和患者正常pbmc的全外显子组测序和肿瘤活检的rna
‑
seq转录组测序来鉴定患者pact135中的体细胞非同义突变。该患者患有iv期转移性黑色素瘤，并且正在进行纳武单抗的抗pd1抗体治疗。鉴定了2566个编码突变。从肿瘤突变负荷预测了632个新表位，并在hla
‑
a*03:01、a*24:02和c*12:03中产生了243个compact(新表位
‑
hla复合物)文库，如实施例10和11中所述。基于患者正常的pbmc全外显子组测序，通过optitype程序预测hla分型。文库涵盖了6个hla中的3个。
[0644]
t细胞分离
[0645]
在抗pd
‑
1抗体治疗之前或期间的不同时间点从受试者pact135收集pbmc和til样品。在治疗开始后的第14天、第43天和第84天收集pbmc样品。在抗pd1治疗开始前的第
‑
37天和治疗开始后的第82天收集til样品。将t细胞与compact文库一起温育，并使用实施例10和11中所述的impact方法分离新抗原特异性t细胞。
[0646]
分离出对5种新抗原
‑
hla特异的14个tcr；一个neotcr识别pum1，一个neotcr识别ttp2，两个neotcr识别il8
‑
hla
‑
a*24:01，以及10个neotcr识别il8
‑
hla
‑
a*03:01。表达neotcr的t细胞在含有il2、il7、il15或其组合的培养基中扩增14天。在扩增结束时，t细胞保留了“更年轻”的t细胞表型，产生了展示出t记忆干细胞和t中枢记忆细胞表型的neotcr
‑
p1 t细胞。
[0647]
neotcr基因编辑
[0648]
如2019年5月9日公布的国际专利申请号wo2019089610(在此通过引入全部并入本文)中所述，使用基于crispr的非病毒方法将健康供体来源的cd4和cd8 t细胞工程化以表达每个鉴定的新抗原特异性tcr。
[0649]
neotcr表达
[0650]
使用荧光团
‑
compact三聚体葡聚糖复合物分析基因编辑的cd4和cd8 t细胞中neotcr的表达。生物素化的compact蛋白与链霉亲和素dextramer结合，并与neotcr cd4和cd8 t细胞一起温育。通过更详细描述于bethune,et al.(biotechniques 62:123
‑
130mar.2017)和bethune,et al.(elife 5:2016)中的方法，确定了compact
‑
dextramer与相应的表达neotcr的t细胞的结合，每一文献都以引用的方式并入本文中。通过使用荧光标记的链霉亲和素(life technologies,carlsbad,ca)制备dextramer。
[0651]
匹配的自体黑色素瘤细胞系生产
[0652]
匹配的自体黑素瘤细胞系是从患者的活检中建立的(m489)。作为阴性对照，从不同患者的活检中建立了来自错配黑色素瘤的第二细胞系(m202)。使用匹配和错配的自体黑色素瘤细胞系评估表达neotcr的t细胞的功能性(激活标志物的表达、细胞因子分泌、抗原特异性靶细胞杀伤和t细胞增殖)。
[0653]
t细胞激活
[0654]
将表达neotcr的t细胞与或不与ifnγ一起温育，并与m489匹配的黑素瘤肿瘤细胞系和新抗原匹配的compact
‑
dextramer共培养。作为阴性对照，有或没有ifnγ温育的neotcr t细胞也与m202错配的黑色素瘤肿瘤细胞系和新抗原匹配的compact
‑
dextramer共培养。用抗cd3抗体okt3刺激t细胞用作阳性对照。通过facs评估了compact
‑
dextramer结合后neotcr的内化。
[0655]
还在与匹配和错配的黑素瘤细胞系共培养的cd4和cd8 neotcr t细胞中测定了激活标志物4
‑
1bb和ox
‑
40的表达。激活标志物的表达是通过facs确定的。抗ox
‑
40抗体(克隆ber
‑
act35,cat#350012)和抗4
‑
1bb抗体(克隆4b4
‑
1,cat#309810)购自biolegend。
[0656]
t细胞细胞毒性测定
[0657]
使用incucyte成像系统(essen biosciences)通过免疫荧光监测t细胞诱导的肿瘤细胞随时间的杀伤。14个表达neotcr的t细胞中的每一个都与患者匹配的m489肿瘤细胞共培养。neotcr t细胞也与作为阴性对照的m202错配细胞系共培养。m489和m202肿瘤细胞使用nuclight red lentivirus(essen biosciences)进行标记。
[0658]
将m489或m202肿瘤细胞以25,000个细胞/孔接种在96孔板中，并在培养箱中温育过夜。第二天以下列浓度加入neotcr t细胞：25,000个t细胞/孔(1:1t细胞:肿瘤细胞比)或100,000个t细胞/孔(5:1t细胞:肿瘤细胞比)。然后通过使用具有10x物镜的incucyte成像系统以2小时的间隔收集延时图像持续12天来监测共培养制剂。
[0659]
细胞因子分泌测定
[0660]
使用细胞因子珠测定(cba bead
‑
based immunoassay,bd biosciences)评估共培养的t细胞和黑素瘤细胞系的上清液中的细胞因子产生。cba是一种流式细胞术多重基于珠的免疫测定应用，其通过使用抗体包被的珠有效捕获分析物，允许同时定量多种蛋白质。共培养t细胞和靶细胞24或48小时后，收集上清液并分析ifnγ、il
‑
2和tnfα的分泌。
[0661]
结果
[0662]
pact135中的neotcr随时间的鉴定
[0663]
impact分析导致分离出对5种新抗原
‑
hla特异的14个tcr：一个neotcr识别pum1，一个neotcr识别ttp2，两个neotcr识别il8
‑
hla
‑
a24:02，和十个neotcr识别il8
‑
hla
‑
a03:01。从患者pact135分离的新抗原肽序列、α和βtcr cdr3序列以及hla等位基因显示在下表8中。
[0664]
[0665][0666]
图45提供了在抗pd
‑
1抗体治疗过程中收集的每个样品中每个cd8 t细胞的新抗原特异性t细胞的数量的总结。每个方框表一个t细胞，每个十字形代表十个t细胞。每列方框或十字形代表独特的neotcr克隆型。
[0667]
tcr219,tcr220,tcr223,tcr224,tcr225,tcr228,tcr229,tcr232,tcr240和tcr241识别il8
‑
ktyfkpfhpk新抗原(seq id no:256)。
[0668]
tcr221和tcr227识别il8
‑
yfkpfhpkf新抗原(seq id no:227)。
[0669]
tcr218识别tpp2
‑
cfsevsakf新抗原(seq id no:223)。
[0670]
tcr222识别pum1
‑
ammdyffqr新抗原(seq id no:226)。
[0671]
neotcr表达
[0672]
图46显示了在cd4和cd8 t细胞二者中14个neo tcr的t细胞基因编辑效率强。对于13个neotcr t细胞，cd4和cd8 t细胞结合同源的compact
‑
dextramer复合物。然而，只有表达针对pum1的neotcr(tcr222)的cd8 t细胞与同源的compact
‑
dextramer结合，并且在cd4 neotcr t细胞中未观察到compact
‑
dextramer结合。
[0673]
t细胞激活
[0674]
在有和没有ifnγ预温育的情况下,在与neotcr t细胞同源compact
‑
dextramer和黑色素瘤匹配细胞系m489共培养时,neo tcr被内化(图47)。compact
‑
dextramer阳性t细胞百分比的降低表明neotcr的内化，它是t细胞激活的替代标志物。仅用rpmi培养基培养的细胞不会内化与neotcr结合的dextramer复合物，而用抗cd3抗体okt3培养的t细胞则内化与neotcr结合的dextramer复合物。neo12抗原也用作每个样品的阴性对照。
[0675]
源自患者pact135的neotcr t细胞在与m489细胞系一起温育后(在有和没有ifnγ预温育)也表达激活标志物4
‑
1bb(图48)和ox40(图49)。在tcr222 cd4 t细胞中未观察到4
‑
1bb或ox40的表达，因为neotcr不结合同源新抗原。
[0676]
当用ifnγ预处理肿瘤细胞以激活免疫蛋白酶体并增强hla表达时，il8
‑
hla
‑
a03 tcr中的4
‑
1bb表达增加(图48)。当用ifnγ预处理肿瘤细胞以激活免疫蛋白酶体并增强hla表达时，il8
‑
hla
‑
a03 tcr中的ox40表达增加(图49)。
[0677]
t细胞细胞毒性测定
[0678]
如细胞毒性测定所确定的，表达所鉴定的neotcr的所有14个t细胞制剂都显示出针对匹配的自体黑素瘤细胞系m489的特异性细胞毒性。图50提供了相比于模拟物处理或与rpmi培养基或neo12 tcr t细胞温育后的肿瘤细胞汇合百分比,与从pact135鉴定的所有
neotcr t细胞共培养后的肿瘤细胞汇合百分比的图。图51a和51b提供了与每个neotcr t细胞共培养后肿瘤细胞汇合百分比的单独图。
[0679]
表达neotcr的t细胞在测试的t细胞:肿瘤细胞比率(1:1和5:1(数据未显示))下均表现出对匹配肿瘤细胞的强烈杀伤。未观察到针对错配肿瘤细胞系m202的细胞毒活性(数据未显示)。相比于在与1:1比例的neotcr t细胞温育的每个样品中在温育后96小时的细胞核汇合度小于20％，对照样品具有42％的细胞核汇合度(对于每个neotcr t细胞样品p<0.000001；图50和图51a
‑
b)。重要的是，在肿瘤细胞数量减少的同时，t细胞数量增加，表明neotcr t细胞响应于患者匹配的肿瘤细胞内源表达的同源抗原而增殖(数据未显示)。与同源肿瘤细胞共培养两天后，neotcr t细胞被激活，表现为簇的形成。t细胞增殖，到第5天，它们覆盖了整个孔的表面，并且没有检测到肿瘤细胞。
[0680]
即使在pbmc或til样品中频率较低的neotcr，例如仅在一种t细胞中表达的neotcr，也对患者匹配的肿瘤细胞系具有很强的活性，证明了impact技术的高准确度和灵敏度。
[0681]
t细胞细胞因子分泌
[0682]
评估表达neotcr的t细胞的抗原特异性细胞因子生成。neotcr t细胞在患者匹配的黑色素瘤细胞系m489存在下共培养后分泌ifnγ、il
‑
2和tnfα细胞因子。当neotcr t细胞与不匹配的黑色素瘤细胞系m202共培养时，没有测量到细胞因子的分泌。图52显示了在m489存在下共培养后tcr228 t细胞分泌ifnγ、il2和tnfα。图53显示了在m489存在下共培养后tcr221 t细胞分泌ifnγ、il2和tnfα以及tcr227 t细胞分泌ifnγ。图54显示了在m489存在下共培养后tcr222 t细胞分泌ifnγ和tnfα。在48小时未检测到il2。图55显示了在单独存在m489的情况下共培养后(黑条)和用ifnγ预处理m489细胞一小时后(灰色条)，tcr219,tcr223,tcr224,tcr225,tcr229,tcr240和tcr241 t细胞分泌ifnγ。tcr220、tcr228和tcr232 t细胞在与ifnγ预处理的m489细胞共培养后分泌ifnγ。在48小时未检测到il2或tnfα。
[0683]
实施例21使用impact方法验证从结肠直肠患者样品中分离的neotcr
[0684]
材料和方法
[0685]
compact文库制备
[0686]
预测了144个新表位用于治疗患有结直肠癌的初治患者。如实施例10和11所述，在hla
‑
a*03:01、a*02:01和b*07:03中产生了61个compact(新表位
‑
hla复合物)文库。
[0687]
t细胞分离
[0688]
将从受试者(pact035)收集的pbmc与compact文库一起温育。使用实施例10和11中所述的impact方法分离新抗原特异性t细胞。鉴定了针对cox6c蛋白的七种neotcr克隆型。
[0689]
neotcr基因编辑
[0690]
如2019年5月9日公布的国际专利申请号wo2019089610(在此通过引入全部并入本文)中所述，使用基于crispr的非病毒方法将健康供体来源的cd4和cd8 t细胞工程化以表达七种cox6c新抗原特异性tcr。
[0691]
cox6c r20q稳定表达细胞系
[0692]
使用pact精确基因组工程专业知识来产生稳定的肿瘤细胞系，该细胞系在内源性调控元件的控制下表达cox6c r20q新抗原。表达高水平细胞表面hla
‑
a02的结肠癌细胞系
sw620用于表达新抗原。sw620细胞用grna/cas9和hdr模板进行核转染，以制备cox6c r20q敲入细胞系。将编辑的细胞进行单次分选和增殖。对cox6c基因座进行了测序。测序分析显示约80％的单细胞被高度编辑。选择了在内源基因座中表达cox6c r20q的四种细胞系：表达野生型cox6c基因的sw620细胞、cox6c
‑
r20q突变杂合的sw620细胞和cox6c
‑
r20q突变纯合的两种sw620细胞系(显示了一个)。
[0693]
hla
‑
a02在工程化的sw620细胞系中的表达通过流式细胞术使用bb7.2抗hla*a2抗体得到证实。组成型表达hla
‑
a*02和hla
‑
c*02的k562细胞系分别用作阳性和阴性对照。sw620细胞用gfp构建体进行核转染以确认转染效率。
[0694]
t细胞激活
[0695]
在与cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞共培养的cd4和cd8tcr089 neotcr t细胞中也确定了激活标志物nur77的表达。作为阴性对照，tcr089 neotcr t细胞也与野生型sw620细胞共培养，或单独培养。使用抗nur77 mab(ebiosciences)对细胞进行nur77染色，并通过流式细胞术评估nur77的表达。
[0696]
t细胞细胞毒性测定，incucyte
[0697]
还使用incucyte成像系统(essen biosciences)通过免疫荧光确定了neotcr t细胞诱导的肿瘤细胞随时间的杀伤。在该测定中使用表达七种鉴定的cox6c neotcr克隆型中的每一种的t细胞。使用nuclight red慢病毒(essen)将cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞或野生型sw620细胞标记为红色。用红色标记肿瘤细胞可以将它们与共培养中的t细胞区分开来，并监测随时间的肿瘤细胞杀伤。将40,000个肿瘤细胞/孔接种在96孔板中并在培养箱中放置过夜。第二天，将neotcr t细胞以1:1的t细胞:肿瘤细胞比例加入。每种neotcr t细胞都被添加到单独的肿瘤细胞样品中。rnp(仅用核糖核蛋白(rnp)复合物电穿孔的t细胞)、neo12 tcr t细胞和单独的培养基用作阴性对照。通过使用具有10x物镜的incucyte成像系统以2小时的间隔收集延时图像持续5天来监测共培养样品。
[0698]
t细胞细胞毒性测定，流式细胞术
[0699]
评估tcr089 neotcr t细胞的抗原特异性t细胞介导的杀伤。将100,000个tcr089 neotcr t细胞与cox6c
‑
r20q突变纯合(+/+)的sw620细胞或野生型sw620以不同的t细胞:肿瘤细胞比例共培养。
[0700]
在共培养t细胞和靶细胞24小时后，使用活/死细胞染色试剂盒(live/dead near ir viability stain for flow,cat#nc0584313,thermofisher)在4℃黑暗中将细胞染色20分钟。在细胞膜受损的细胞中，染料与细胞内部和细胞表面的游离胺反应，产生强烈的荧光染色。在活细胞中，染料的反应性仅限于细胞表面胺，导致荧光强度较低。活细胞和死细胞之间的强度差异通常大于50倍，便于区分。温育后，将细胞洗涤，用ebioscience ic固定缓冲液(thermofisher，目录号00
‑
8222
‑
49)固定并通过流式细胞术进行分析。
[0701]
细胞因子分泌测定
[0702]
将tcr089 neotcr t细胞与cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞或cox6c
‑
r20q突变杂合的sw620细胞以5:1的t细胞:肿瘤细胞比例共培养。作为阳性对照，将表达tcr089的t细胞与sw620 wt共培养，用1μm脉冲处理1小时。作为阴性对照，将表达tcr089的t细胞与sw620野生型细胞共培养。24小时后收集上清液，并使用细胞因子珠测定(cba，来自bd biosciences的bead
‑
based immunoassay)评估细胞因子的产生。cba是一种流式细胞术多
重基于珠的免疫测定应用，其通过使用抗体包被的珠有效捕获分析物，允许同时定量多种蛋白质。
[0703]
结果
[0704]
pact035中neotcr的鉴定
[0705]
使用impact t细胞分离方法在患者样品中鉴定了针对cox6c蛋白的七种neotcr克隆型(图56，由箭头指示)。当被工程化到cd4 t细胞中时，七种中的两种结合新抗原
‑
hla复合物，并且因此是不依赖于cd8的neotcr。cox6c是线粒体酶细胞色素c氧化酶的亚基，它在基本上所有组织中均以中等水平表达。新抗原靶肽是残基18
‑
20，带有r20q突变。结合r20q cox6c肽(残基18
‑
26)的neotcr被称为tcr089,tcr091,tcr092,tcr094,tcr097,tcr098和tcr099。从患者pact035分离的新抗原肽序列、α和βtcr cdr3序列以及hla等位基因显示在下表9中。
[0706][0707]
sw620细胞系的转染
[0708]
图57a显示kv1858细胞系中没有hla*a2表达(表达hla*c2，但不表达hla*a2)。图57b显示了kv1832细胞系中的hla*a2表达(表达hla*a2)。图57c显示了sw620细胞系中的hla*a2表达(表达hla*a2)。图57d显示了核转染的sw620细胞中的gfp定量。同种型对照抗体用作阴性对照。
[0709]
t细胞激活
[0710]
nur77是一种立即早期基因，其表达被tcr信号传导迅速上调。nur77的表达被抗原
‑
tcr信号传导迅速上调。在与cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞共培养的tcr089 neotcr t细胞中检测到nur77表达(图58)。当tcr089 neotcr t细胞单独或与表达wt cox6c蛋白的sw620细胞共培养时，未观察到nur77诱导。
[0711]
t细胞细胞毒性测定，incucyte
[0712]
还测量了每个cox6c neotcr t细胞的靶细胞杀伤。所有表达neotcr的t细胞均表现出对sw620纯合肿瘤细胞的强杀伤(图59a)。未观察到针对表达野生型cox6c蛋白的sw620细胞的细胞毒活性(图59b)。t细胞诱导的杀伤量是剂量依赖性的，并且随着t细胞:肿瘤细胞比率的增加而增加。
[0713]
在使用tcr089 neotcr t细胞的杀伤测定期间收集的incucyte图像还显示，在肿瘤细胞数量减少的同时，t细胞数量增加(数据未显示)。这表明tcr089 t细胞响应于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞内源表达的同源抗原而增殖。
[0714]
tcr089 t细胞细胞毒性测定，流式细胞术
[0715]
tcr089杀死了对于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞，但不杀死野生型sw620细胞。未观察到针对表达野生型cox6c蛋白的sw620细胞的细胞毒活性(图60)。t细胞诱导的杀伤量是剂量依赖性的，并且随着tcr089 t细胞:肿瘤细胞比率的增加而增加。
[0716]
细胞因子分泌测定
[0717]
在与对于cox6c
‑
r20q突变纯合的sw620细胞共培养后，在tcr089 t细胞样品中测量到强ifnγ分泌(图61)。当tcr089 t细胞与cox6c
‑
r20q突变杂合的sw620细胞共培养时，测量了一半的ifnγ量。在没有肿瘤细胞的情况下，对于单独的tcr089 t细胞，或当t细胞与野生型sw620细胞共培养时，检测到类似的ifnγ。
[0718]
实施例22用neotcr t细胞治疗癌症患者的方法
[0719]
患有癌症或另一种增殖性疾病的患者可能需要介入疗法以减缓或停止细胞增殖并杀死可能或确实对患者造成伤害(例如引起疼痛、不适或疾病)的现有细胞。具体而言，本文公开的neotcr t细胞可用于治疗癌症。
[0720]
如图62所示，neo
‑
e特异性tcr从用pd
‑
1疗法治疗的患者中分离。从活检和肿瘤细胞系中收集rna和dna，并对活检和细胞进行rnaseq和wes(全外显子组测序)。还从患者的pbmc中收集dna，用于wes以用作对照。一旦使用rnaseq和wes鉴定出肿瘤抗原，就会使用算法来选择新表位候选物，以使用comppact多肽(其中表达预测的新表位)和impact分离技术进行筛选。条形码化的compact颗粒文库被组装并与患者样品结合。compact颗粒能够关联并捕获新表位特异性t细胞。
[0721]
实施例23impact分离技术实例
[0722]
基于患者特异性neoe的计算预测，制备了数百种捕获试剂，所述试剂由加载有相应预测neoe的患者hla i类亚型组成(peng等人，aacr 2019)；然后分离neoe特异性t细胞并对tcrα和β进行测序。通过使用非病毒精确基因组工程改造产生表达neotcr的原代人类t细胞，对分离的neotcr进行功能研究以便替代内源性tcr(jacoby等人，aacr 2019，sennino等人，aacr 2019)。
[0723]
在两名接受抗pd
‑
1疗法的患有转移性黑色素瘤患者中分析了t细胞应答。在不同时间点从外周血单核细胞(pbmc)和肿瘤浸润淋巴细胞(til)中分离出neoe特异性t细胞。患者pt476具有持久的应答；肿瘤突变负荷(tmb)为2556；产生了跨越3个hla类型：hla
‑
a03:01,a24:01和c12:03的243个neoe
‑
hla复合物。这导致分离出特异于5个neoe
‑
hla的17个tcr。特异于neoe的t细胞在til中存在于基线处，并在治疗过程中在til和pbmc中扩增。患者pt461在抗pd
‑
1后具有快速的疾病进展；tmb为61；产生了覆盖hla
‑
a02:01,a03:01,b07:02,c05:01和c07:02的78个neoe
‑
hla复合物，导致2个tcr对1个neoe
‑
hla的分离。
[0724]
为了进一步表征t细胞应答，对t细胞进行基因编辑以表达从患者pt476中分离的14种不同的tcr，特异于突变的il8、puml和tpp2基因中的neoe。所有14种t细胞制剂都对从患者pt476活检中建立的匹配自体黑色素瘤细胞系显示出特异性细胞毒性(与错配的对照tcr共培养中的黑色素瘤细胞系生长相比，50
‑
75％的肿瘤生长抑制，96小时测定使用p:t 1:1，每次比较p<0.000001)，并且对不匹配的对照人黑色素瘤细胞系没有细胞毒性作用。与匹配的自体黑色素瘤细胞系共培养后，neoe tcr t细胞上调4
‑
1bb和ox
‑
40，分泌ifnγ、il
‑
2和tnfα，并诱导t细胞增殖和脱颗粒。当t细胞与不匹配的靶标共培养时，没有观察到应答。
[0725]
这些结果表明，抗pd
‑
1疗法诱导针对有限数量的neoe的聚焦neoe特异性t细胞应答，并且非病毒精确基因组工程可以成功地将t细胞重定向至表达neoe的肿瘤，其可用作个性化act治疗的方法。
[0726]
类似地，除了抗pd
‑
1疗法之外，还可以使用其他检查点疗法和另外的组合；例如，可以使用抗pd
‑
l1或抗ctla4疗法。
[0727]
如实施例20中部分描述的，在抗pd
‑
1治疗后的多个时间点收集活检和pbmc(图45：pt476响应者，和图63：pt461无响应者)。til和细胞系是从患者的活检中建立的。impact分离技术用于分离neoe特异性t细胞并监测它们随时间的演变。使用来自基线细胞系的全外显子组测序(wes)和rnaseq预测源自非同义突变的neoe，并根据预测的hla结合亲和力、突变的截短性和表达水平进行排序。对于排名靠前的neoe的hla
‑
neoe捕获试剂用于分离neoe特异性t细胞。图45显示pt476：产生了跨越3个hla类型(hla
‑
a03:01,a24:01和c12:03)的243个neoe
‑
hla复合物，并分离了特异于5种neoe
‑
hla的17种tcr。图63显示患者pt461：产生了覆盖hla
‑
a02:01,a03:01,b07:02,c05:01和c07:02的78个neoe
‑
hla
‑
复合物，导致2个tcr对1个neoe
‑
hla的分离。
[0728]
实施例24 impact分离技术方法实例
[0729]
如实施例22中所述，可以从患者样品中分离neoe特异性t细胞。在本实施例中，impact分离技术导致鉴定了14个候选neotcr
‑
t，其中包括：12个il
‑
8(hla
‑
a24:02和hla
‑
a03:01)neotcr
‑
t候选物，1个pum1(hla
‑
a3:01)neotcr
‑
t候选物和1个tpp2(hla
‑
a24:02)neotcr
‑
t候选物。
[0730]
如图62所示，impact分离技术的方法包括三个工作流：基因编辑、共培养测定和基于细胞的测定。
[0731]
基因编辑：来自健康供体的cd8和cd4 t细胞经过精确基因组工程化以表达neotcr。简而言之，neoe特异性tcr序列被克隆到同源重组(hr)dna模板中。这些hr模板与位点特异性核酸酶一起用于工程化原代人t细胞。单步(非病毒)精确基因组工程导致内源性tcr无缝替换为患者的neoe特异性tcr(天然序列)，其表达受内源性调控。
[0732]
共培养测定：将neotcr
‑
p1 t细胞与源自同一患者基线活检的黑色素瘤细胞系(m489)或错配的黑色素瘤肿瘤细胞系以1:1或5:1的最终产品对靶标(p:t)比例共培养。使用incucyte系统在6天内评估靶细胞杀伤。在48小时通过流式细胞术评估增殖标志物ki67的表达。在24小时通过流式细胞术评估激活标志物的表达。使用bd细胞因子珠阵列(cba)人th1/th2细胞因子试剂盒ii在48小时测量细胞上清液中的细胞因子分泌。
[0733]
共培养测定：肽
‑
hla：进行识别/刺激、靶细胞杀伤、增殖、激活标志物和细胞因子分泌测定。
[0734]
实施例25：工程化的neotcr
‑
t细胞杀死自体肿瘤细胞
[0735]
如图64所示，neotcr
‑
t细胞杀死自体黑色素瘤肿瘤细胞。使用肿瘤细胞死亡和t细胞增殖的延时显微术，将neotcr
‑
t细胞与以稳定方式表达红色荧光蛋白(核rfp)的自体黑色素瘤细胞系共培养。更具体地说，neotcr被制作成靶向黑色素瘤细胞系上的il
‑8‑
hla
‑
a*03:01新抗原，并且将这些neotcr与il
‑8‑
hla
‑
a*03:01新抗原黑色素瘤细胞系一起培养(图64中顶部的三个图像)，并将其与阴性对照(图64中底部的三个图像)进行比较。此处显示的图像是在时间0(左图)、2天(中图)和5天(右图)收集的。因此，neotcr对肿瘤新抗原具有特异性，并且能够有效杀死自体肿瘤细胞。
[0736]
neotcr
‑
t细胞杀死自体肿瘤细胞的能力也可见于图65a。将neotcr
‑
t细胞与自体(黑条)或错配的黑色素瘤肿瘤细胞(白条)共培养，并且在48小时后，通过流式细胞术评估表达ki67(增殖标志物)的cd8 neotcr t细胞的百分比。*与错配的黑色素瘤肿瘤细胞相比，p<0.05(使用holm
‑
sidak方法用于多重比较校正的t检验)。表达neotcr neo12的t细胞用作阴性对照。
[0737]
类似地，neotcr
‑
t细胞显示出在与自体肿瘤细胞共培养时表达激活标志物。这可以在图65b中看到。将neotcr
‑
t细胞与自体(黑条)或错配的肿瘤细胞系(白条)共培养，并且在24小时后通过流式细胞术评估表达激活标志物4
‑
1bb的cd8 neotcr t细胞的百分比(顶部)或表达激活标志物ox40的cd4 neotcr t细胞的百分比(底部条形图)。*与错配的黑色素瘤肿瘤细胞相比，p<0.05(使用holm
‑
sidak方法用于多重比较校正的t检验)。表达neotcr neo12的t细胞用作阴性对照。为了测量cd4 neotcr t细胞中ox
‑
40的上调，在与t细胞共培养之前，用ifnγ预处理黑色素瘤细胞24小时。
[0738]
最后，显示neotcr
‑
t细胞在与自体肿瘤细胞共培养时分泌干扰素
‑
γ。这可以在图65c中看到。将neotcr
‑
t细胞与自体黑色素瘤肿瘤细胞共培养，并且在48小时后通过流式细胞术(cba)评估ifnγ的分泌。模拟t细胞用作阴性对照。*p<0.05(使用holm
‑
sidak方法用于多重比较校正的t检验)。
[0739]
这共同表明，表达使用impact分离技术分离的tcr的新生成的neotcr
‑
t细胞在与自体肿瘤细胞共培养时上调了激活和增殖的标志物。更重要的是，所有neotcr
‑
t细胞都特异性地杀死患者来源的自体黑色素瘤细胞。
[0740]
实施例26用neotcr
‑
t细胞给药在小鼠体内和在工程化细胞系中在体外根除肿瘤
[0741]
将表达新抗原的肿瘤植入15只nod scid gamma(nsg)小鼠的侧腹。当肿瘤大小达到95mm3时，将小鼠分为两组：对照组(7只小鼠)，其接受pbs；和治疗组(8只小鼠)，其给药neotcr t细胞(5*106总t细胞/小鼠；基因编辑效率50％)。如图66a所示，在输注neotcr
‑
t细胞后(参见图中箭头)，肿瘤大小减小，并且到第19天肿瘤完全根除。图66b显示了在neotcr t细胞输注后第4天和neotcr
‑
t细胞输注后第35天小鼠血液中存在的人cd8 t细胞数/ml。尽管nsg小鼠缺乏人细胞因子，但肿瘤根除后循环中仍存在neotcr
‑
t细胞，这表明neotcr
‑
t细胞不仅杀死靶细胞，还可以增殖并持续存在。
[0742]
实施例27特异于主干肿瘤突变的neotcr
‑
t细胞的设计
[0743]
原发肿瘤和转移瘤中肿瘤进展的亚克隆突变性质在肿瘤学领域产生了一个问题，因为肿瘤药物是“个性化”的，即它们被设计成靶向具有特定突变的蛋白质、化学物质或细胞(例如，许多小分子药物被设计为靶向基于点突变的肿瘤)。由于肿瘤在原发肿瘤的后期
阶段和转移阶段经常发生突变(突变在癌症生长和疾病持续过程中积累)，因此在首次检测和治疗肿瘤时可以很好地缩小或减缓肿瘤进展的药物可能会随着时间失去效力。
[0744]
这里公开了设计和制造对主干肿瘤突变特异的neotcr
‑
t细胞的能力。使用算法和生物信息学方法，确定了患者体内所有癌细胞表达的肿瘤专有主干突变。
[0745]
实施例28 neotcr
‑
t细胞解决全球人群中的所有hla类型
[0746]
人群中有13,000个hla。每个人有一组6个hla。因此，不到1％的任何neoe
‑
hla肿瘤靶标在患者(对60,000名患者进行分析后生成的数据(hartmaier等人(2017)genome medicine)和20,000名患者(schumacher&schrieber(2015)science)之间相同。进行的分析表明，pbmc询问的hla等位基因目录为：>99％具有至少1个hla等位基因覆盖，>90％具有4到6个等位基因覆盖，以及>60％的美国潜在试验受试者预计具有所有6个等位基因覆盖。
[0747]
实施例29 neotcr疗法可用于具有低突变负荷、中等突变负荷和高突变负荷的肿瘤
[0748]
因为impact分离技术极其灵敏，所以有可能在所有程度的突变负荷下检测肿瘤上的新抗原。例如，neotcr
‑
t细胞可用于治疗具有低肿瘤突变负荷的肿瘤如前列腺癌和乳腺癌，具有中等肿瘤突变负荷的肿瘤如卵巢癌和结直肠癌，以及具有高肿瘤突变负荷的肿瘤如膀胱癌和黑色素瘤癌。
[0749]
因此，本文所述的impact分离技术可用于设计、工程化和制造用于低、中和高肿瘤突变负荷肿瘤的neotcr。在某些方面，impact分离技术方法可用于检测低、中和高肿瘤突变负荷肿瘤上的新抗原。在某些方面，impact分离技术方法已被用于检测低、中和高肿瘤突变负荷肿瘤上的新抗原。在某些方面，impact分离技术方法可用于制备包含neotcr的组合物，以治疗患有此类肿瘤的患者中的低、中和高肿瘤突变负荷肿瘤。在某些方面，impact分离技术方法可用于制备neotcr群体，以治疗患有此类肿瘤的患者中的低、中和高肿瘤突变负荷肿瘤。
[0750]
实施例30用neotcr
‑
t细胞疗法治疗患者的方法
[0751]
用neotcr
‑
t细胞疗法治疗患者的初始步骤是筛选患者。一旦进行筛查和活检，患者就可以登记并进行白细胞去除术。在如本文所述的neotcr t细胞(患者特异性)的制造期间，包括compact文库创建、impact分离技术筛选和t细胞编辑以表达neotcr，患者可以任选地参加桥接疗法(例如，一种标准的护理疗法，包括针对特定癌症适应症的一线、二线、三线和后期线疗法)。此类桥接疗法可在0和60天之间(平均在21和42天之间)开处方和施用。在这种可选的桥接疗法之后，可以给患者开条件化学疗法。这种条件化学疗法可以在施用neotcr t细胞疗法前5、4和3天进行。在施用当天，患者将接受neotcr的输注。此后，将评估肿瘤。
[0752]
实施例31使用neotcr t细胞治疗非癌症疾病和病症的组合物和方法
[0753]
非限制性地，可以用neotcr t细胞疗法治疗除癌症之外的疾病。具体而言，可以用neotcr t细胞疗法治疗导致患病细胞群产生疾病/病症特异性新抗原的任何疾病或病症。此类细胞包括被病毒、真菌或细菌感染的细胞，这些细胞由于感染而呈递可被neotcr t细胞检测的感染特异性新抗原。与炎症或自身免疫疾病相关的细胞也可能呈递疾病特异性的新抗原，从中可以产生neotcr t细胞。例如，如果患者患有过敏症或炎症性疾病，可以制备针对炎症细胞上呈递的炎症细胞因子配体特异性的新抗原的neotcr。
[0754]
实施例32使用neotcr t细胞进行成像的方法
[0755]
一旦对患者肿瘤样品采用了compact和impact分离技术方法，则neotcr t细胞可用于治疗疾病，如本文所述，并且还可用于成像、检测和/或监测肿瘤负荷、进展、缓解和根除。这可以通过用可检测的标记物(例如，可以成像的任何标记物，例如具有染料或具有锆标记物；参见例如美国专利号8,771,966，其全文通过引用并入本文中)标记neotcr t细胞来完成。
[0756]
例如，neotcr t细胞可以被遗传修饰以表达染料或荧光蛋白。这种标记的neotcr t细胞可用于确定neotcr t细胞疗法在根除肿瘤方面的功效；其中如果标记的neotcr t细胞可以被成像增殖和扩增，则可以推断neotcr t细胞疗法是有效的，因为细胞在遇到靶抗原时分化为t效应细胞。
[0757]
例如，neotcr t细胞可以用诸如锆89的试剂标记。这种标记的neotcr t细胞可用于基于neotcr t细胞与肿瘤细胞(如果存在)之间的相互作用或缺乏相互作用来确定neotcr t细胞疗法(之前、期间或之后)任何肿瘤的存在。
[0758]
非限制性地，除了肿瘤细胞之外的细胞也可以被成像，其呈递允许制造neotcr t细胞的新抗原。此类细胞包括但不限于实施例30中描述的那些。例如，如果通过使用本文描述的方法设计和施用neotcr t细胞疗法来治疗炎性疾病，使得发现了炎症细胞特异性新表位(例如，引起炎症的炎性细胞因子配体上的新表位)并由此设计和制造了neotcr t细胞，则可以用显像剂标记相同的neotcr t细胞，以便以后确定配体呈递细胞是否仍然存在或neotcr是否有效根除或充分减少此类细胞群以改善患者的疾病状态。
[0759]
实施例33确定neotcr
‑
t细胞疗法的功效的方法和调整neotcr
‑
t细胞疗法剂量的方法
[0760]
在给患者给药neotcr
‑
t细胞疗法后，可以使用本领域已知的成像方法监测功效。例如，患者可以用本文所述的neotcr
‑
t细胞疗法输注，然后施用肿瘤示踪剂，该肿瘤示踪剂可以在此类示踪剂施用后1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15天成像。在某些实施方案中，示踪剂可以在与neotcr
‑
t细胞疗法相同的一周、在neotcr
‑
t细胞疗法之后的一周、在neotcr
‑
t细胞疗法之后两周、在neotcr
‑
t细胞疗法之后三周，或neotcr
‑
t细胞之后一个月或更多个月施用。
[0761]
在某些实施方案中，如果肿瘤在neotcr
‑
t细胞疗法后没有进展但没有缩小(如使用成像所观察到的)，则可以给予额外的neotcr
‑
t细胞疗法施用。在某些实施方案中，如果肿瘤在neotcr
‑
t细胞疗法之后没有缩小并且任选地尺寸增加(如使用成像所观察到的)，则可以给予额外的neotcr
‑
t细胞疗法施用。
[0762]
在某些实施方案中，在neotcr
‑
t细胞疗法之后每3
‑
6个月使用示踪剂和成像来监测疾病状态。在某些实施方案中，在neotcr
‑
t细胞疗法之后每6
‑
12个月使用示踪剂和成像来监测疾病状态。
[0763]
实施例34使用neotcr t细胞治疗患者的方法
[0764]
如实施例1
‑
9中所述，合成新表位候选物并将其克隆到compact多核苷酸中。简而言之，将编码候选抗原肽的多核苷酸序列插入到图1
‑
5中描述的mhc模板中。用包含候选抗原肽序列的compact多核苷酸接种和转染哺乳动物细胞。转染的细胞在细胞培养基中表达和分泌compact多肽。收集来自细胞的条件培养基，并通过大小排阻层析法纯化compact多
肽。然后将纯化的compact多肽与多聚体颗粒(例如，四聚体、dextramer、ntamer)组装在一起，该多聚体颗粒包含多个拷贝的compact多肽、dna条形码和荧光团(例如，apc或pe)。这种方法的优势之一是同时高通量生产和筛选多个新表位候选物。此外，该过程可以自动化。将两种不同类型的颗粒(第一种具有apc，第二种具有pe作为荧光团)组合，以获得能够识别患者特异性抗原肽的颗粒集合。
[0765]
为了鉴定neotcr t细胞及其tcr的序列，将来自患者的新鲜分离的或冷冻保存的t细胞用多聚体颗粒以及用于表型表征的一组抗体进行染色。活的和条形码化的t细胞被分选成单个细胞，并通过下一代测序提取和分析它们的dna和rna。如实施例11
‑
13中所述，分析从compact阳性t细胞获得的测序数据以鉴定和验证预测的抗原肽、neotcr t细胞和验证的新表位tcr候选物及其序列。
[0766]
将鉴定的新表位tcr序列克隆到同源定向重组(hdr)模板中，用于t细胞中的基因组编辑。模板的序列和结构的更多细节可以在国际专利申请号pct/us2018/058230中找到，其内容通过引用并入本文。来自患者的t细胞，无论是新鲜采集的还是先前冷冻保存的，都被工程化，用于通过使用非病毒方法破坏tcr基因和整合hdr模板。包含用于tcr
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α和tcr
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β基因序列的内源性基因座的grna的crispr/cas9方法可用于破坏内源性tcr基因座。hdr模板将与内源性破坏的tcr基因序列之一重组，以引入已鉴定的新表位tcr。因此，工程化的t细胞缺乏内源性tcr的表达并表达新表位tcr。这些neotcr t细胞随后被过继转移到患者体内，并特异性靶向表达新抗原的肿瘤细胞。
[0767]
与其他过继细胞转移方法相比，该过程具有显著优势，包括但不限于：i)它是灵活的，因为它允许个性化靶向患者特异性hla背景下呈递的肿瘤专有突变；ii)它提供了一种临床工具来攻击表达未在细胞表面表达的新抗原的癌细胞；iii)无论患者的种族或癌症类型如何，它都有效；和iv)它可以自动化多个步骤，并且制造占地面积小。
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虽然已经参照优选实施方案和各种替代实施方案具体地示出和描述了本发明，但是相关领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在形式和细节上进行各种改变。
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在本说明书正文中引用的所有参考文献、公布的专利和专利申请通过引用整体并入本文，用于所有目的。