一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医学-病原微生物宏基因组测序领域，尤其涉及一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用。
背景技术：
：近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下。病原学诊断是感染性疾病诊断中最重要的一环，对于提升中重症感染性疾病的诊疗质量至关重要。目前病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。随着基因组学技术的发展，核酸检测成为病原学诊断中的一个重要方向，其中宏基因组二代测序技术(mngs)越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面。mngs过程主要包括样本处理(包含保存、运输)、核酸提取、文库构建、上机测序及数据比对与判读。对于这些影响检验结果的关键过程，都需要有相应的质控点，包括样本保存是否合理、运输过程保持低温状态、核酸提取质量、文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及数据分析可靠性等。只要不符合其中的一个质控点，都有可能无法得出准确的检测报告，找不到真正的致病菌。目前新鲜组织样本进行病原体检测，其保存方法是将样品置于生理盐水中，最好在24h内送检；并且在运输过程中，使其温度保持在4℃条件下。生理盐水保存组织存在一定的问题：第一组织脱离生物体后rna易降解，对运输和保存的要求较高。在实践中，有时候运输距离较远，时间超过了24h，用常规的生理盐水方法保存和运输样品，使得样品中的核酸酶导致其中的病原体核酸容易降解，进而影响核酸提取质量及检测结果；第二临床样本中微生物的核酸含量远低于人核酸含量，通常不足人源核酸含量的5％。因此还需要进行适当的人源核酸去除来确保检测的敏感度。但生理盐水只能保持组织原有状态，不能长久维持其活性。宿主的细胞活率下降，会释放一定的人源核酸，进而会造成人源宿主核酸的污染，影响检测结果。因此，开发一种新鲜组织样本(用于病原体检测)保存液，使其免受rna酶降解，并减少人源宿主核酸的污染，是优化新鲜组织样本采集这一步骤的关键，也是为后续提供高质量核酸的关键。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种新鲜组织样本的保存液、制备方法及其应用，使新鲜组织样本免受rna酶降解，并减少人源宿主核酸的污染。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种新鲜组织样本的保存液，所述保存液由edta、tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述edta的最终浓度为50～100mg/l，tris的最终浓度为2.01～4.04g/l，草酸铵的最终浓度为120～200mg/l，柠檬酸钠的最终浓度为1.8～2.4g/l，甘油的最终浓度为300-400g/l，胎牛血清的最终浓度为130-180g/l，余量为depc水。进一步地，所述保存液由edta、tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述edta的最终浓度为65mg/l，tris的最终浓度为3.55g/l，草酸铵的最终浓度为160mg/l，柠檬酸钠的最终浓度为2.2g/l，甘油的最终浓度为350g/l，胎牛血清的最终浓度为175g/l，余量为depc水。进一步地，所述保存液的ph值为7.0～9.0，优选7.5～8.5。进一步地，所述保存液的适用样本为人组织活检标本，所述适用样本可用于dna检测或/和rna检测。一种新鲜组织样本的保存液的制备方法，包括如下步骤：s1、配置溶液：将edta、tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清分别溶于depc水中配置成溶液；s2、将s1中配置的溶液混合并搅拌均匀后调整ph至7.5～8.5后用depc水定容；s3、滤膜过滤s2中所得溶液，保存得到所述新鲜组织样本保存液。进一步地，所述s3中滤膜的孔径为0.2～0.3μm。一种新鲜组织样本的保存液的应用，包括如下步骤：a、设置实验组和对照组，实验组：取20mm3已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于4ml所述的保存液中；对照组1：取20mm3已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于空的无菌保存管中；对照组2：取20mm3已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于4ml的0.9％生理盐水中；b、提取s1中实验组、对照组1以及对照组2中的病毒rna；c、将s2中获得的rna进行逆转录反应；d、将s3中获得的逆转录rna进行琼脂糖凝胶电泳。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明保存液是一种液态的、无毒的组织保存试剂，并且配制简单、使用方便、不需特殊设备；样本无须冷藏运输，加入保存液4℃保存即可；并可有效避免rna降解，同时维持组织活性，避免人源宿主核酸的污染。附图说明参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：图1为新鲜组织样本的保存液的制备流程图。图2为实施例1中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。图3为实施例1中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。图4为实施例2中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。图5为实施例2中样本保存七天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。图6为实施例3中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。图7为实施例3中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。具体实施方式容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。根据本发明的一实施方式结合图1示出一种新鲜组织样本的保存液，所述保存液由edta、tris、草酸铵、柠檬酸钠、甘油以及胎牛血清组成，其中，所述edta的最终浓度为30～150mg/l，优选50～100mg/l，tris的最终浓度为1.12～6.06g/l，优选2.01～4.04g/l，草酸铵的最终浓度为60～240mg/l，优选120～200mg/l，能够结合多种金属离子(如mg2+等)从而抑制核酸酶的活性，柠檬酸钠的最终浓度为1.3～2.6g/l，优选1.8～2.4g/l，甘油的最终浓度为200-500g/l，优选300～400g/l，防止因冻存等因素对细胞造成的损害，胎牛血清的最终浓度为100-200g/l，优选1.8～2.4g/l，胎牛血清能够提供蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，余量为depc水。上述保存液的ph值为7.0～9.0，最佳为7.5～8.5。所述保存液的适用样本为人组织活检标本。可用于dna检测或rna检测。配置所述新鲜组织样本(用于病原体检测)保存液，具体方法为：配置edta溶液，配置tris溶液，配置草酸铵溶液，配置柠檬酸钠溶液，配置甘油溶液，配置胎牛血清溶液；将上述各配置溶液按一定比例混合并搅拌均匀后用hcl调ph至7.5～8.5，再用depc水定容，使各组分达到上述要求浓度；用滤膜过滤，保存，得到所述新鲜组织样本(用于病原体检测)保存液。下面提供本发明的其中一种具体实施方式，所述新鲜组织样本的保存液配方如表1所示：表1：新鲜组织样本保存液(1l)edtatris草酸铵柠檬酸钠甘油胎牛血清实施例10.05g2.01g0.2g2.4g300g180g实施例20.065g3.55g0.16g2.2g350g175g实施例30.1g4.04g0.12g1.8g400g130g以上述表1中的所述新鲜组织样本保存液为例，具体说明本发明保存液的应用：第一步：设置实验组和对照组，实验组：取20mm3已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于4ml上述实施的保存液中；对照组1：将上述已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于空的无菌保存管中；对照组2：将上述已感染麻疹病毒的小白鼠组织置于4ml的0.9％生理盐水中。以上五组均4℃保存，放置1和7天后，分别提取病毒rna，之后进行凝胶电泳检测。第二步：病毒rna的提取(采用yeasen公司的trieasyplustotalrnakit进行提取)：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，根据处理组织的质量，按照50-100mg加入1ml的比例加入lbbufferm1后电动或者手动彻底匀浆。或者组织在液氮中研磨成细粉后，取适量组织细粉(约50-100mg)转入装有1mllbbufferm1的离心管中，剧烈吹打涡旋混匀。1.4℃下12000rpm，10min。取上清溶液。2.加入560μlbufferavl，震荡混匀15s(裂解)3.室温下(15-25℃)静置10min，瞬离。4.加入560μl无水乙醇，振荡15s，瞬离。5.取630μl溶液加入mini吸附柱中，6000g离心1min，弃滤液，将吸附柱放回收集管。(若溶液没有完全透过膜，可再次以更高的速度离心，直至溶液全部透过，注意膜不可破)6.向柱中加入500μlbufferaw1，6000g离心1min，弃滤液，将吸附柱放回收集管。7.向柱中加入500μlbufferaw2，20000g离3min，弃滤液。8.将吸附柱转入新的2ml离心管，20000g离心1min。9.将吸附柱转入新的1.5ml离心管，吸取30μlbufferave直接加在mini膜上，盖上离心管盖，室温静置1min，20000g离心1min，弃吸附柱。-80℃保存。上述提取rna的方法不是使用本发明所述新鲜组织样本(用于病原体检测)保存液时提取rna的唯一方法，磁珠纯化法、传统的氯仿抽提法、trizol法等也可配合使用。第三步：将通过上述提取方法获得的rna进行逆转录反应，采用yeasen公司的iii1ststrandcdnasynthesiskit试剂进行逆转录反应。1.打开1号pcr仪，设置反应条件：热盖温度105℃；42℃，2min；4℃-。2.按照下表2，于冰上配制反应体系：表2去除gdna反应体系组分组分体积gdnawipeoutbuffer，7×2ultemplaterna12ul反应体积14ul3.瞬时离心后将体系吹打混匀后依次放入到1号pcr仪，并盖上热盖启动pcr仪。4.反应完成后，产物瞬时离心并置于冰上备用。(1)第一链cdna的合成1)打开2号pcr仪，设置反应条件:热盖温度105℃；25℃,10min；42℃，15min；70℃，15min；4℃-。2)按照下表3，于冰上配制反应体系:表3第一链cdna合成体系组分组分体积4.2产物14ulquantiscriptreversetranscriptase1ulquantiscriptrtbuffer,5x4ulrtprimermix1ul反应体积20ul3)瞬时离心后将体系吹打混匀后依次放入到2号pcr仪，并盖上热盖，启动pcr仪。4)反应完成后,产物瞬时离心并置于冰上备用。(2)第二链cdna的合成1)打开1号pcr仪，设置反应条件:热盖温度105℃；16℃,30min；72℃,15min；4℃-.2)按照下表4,于冰上配制反应体系:表4第一链cdna合成体系组分3)瞬时离心后将体系吹打混匀后依次放入到1号pcr仪，并盖上热盖，启动pcr仪。4)反应完成后,产物瞬时离心并置于-20℃。第四步：琼脂糖凝胶电泳1.1.1g琼脂糖加入100ml1xtae电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。冷却到60℃左右，加入100ul的核酸染料，并摇匀。2.在制胶板上，插入梳子，将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入，室温冷却凝固。3.将凝胶置入电泳槽中，加1xtae电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。4.用移液器吸取上述核酸产物样品4ul于封口膜上，再加入2ul的6×载样缓冲液，混匀后，加入到点样孔。5.打开电源开关，调节电压至3-5v/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。6.将跑好的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的dna条带。本实验所用到的材料均为yeasen公司产品，如下琼脂糖：agarose琼脂糖核酸染料：sybrgreeni(10,000×indmso)核酸凝胶染料6×凝胶载样缓冲液：6×dnaloadingbuffer6×dnadnamarker：full-scalednaladder1xtae电泳缓冲液配置如下：材料：100mmedta，2mtris-醋酸.方法：1)称取下列试剂于1l烧杯中：tris242g，na2edta.2h2o37.2g2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌溶解。3)加入57.1ml的醋酸，充分搅拌。4)加去离子水将溶液定容至1l。(50xtae电泳缓冲液)5)取4中溶液20ml加离子水定容至1l得到1xtae电泳缓冲液。6)结果分析：图2、图4以及图6分别为实施例1、实施例2以及实施例3中样本保存一天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。可知，在保存一天后，对照组1、对照组2、实验组中核酸依然保存完整，并没有产生降解情况。图3、图5以及图7分别为实施例1、实施例2以及实施例3中样本保存七天时的琼脂糖凝胶电泳结果图，从左到右依次为对照组1、对照组2、实验组。可知，在保存七天后，对照组1和对照组2中的核酸发生降解现象，实验组中核酸无降解现象。本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。当前第1页12