人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用的制作方法

本发明属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。
背景技术：
：腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链dna病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为a～g7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中包括c亚型人腺病毒，例如adhu1，adhu2，adhu5，adhu6等。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对hiv、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗adhu5的预存中和抗体，以adhu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本发明人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于adhu5载体。由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组dna。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。根据上述，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。在本发明人在先研究工作(未公开的专利申请cn201910777937.2)中，基于黑猩猩型腺病毒adc68基因组序列，删除其e1序列和e3序列，改造其e4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒adhu5基因组中相应的e4序列或其片段替换adc68基因组中e4序列或其片段。而本发明提出了进一步优化的腺病毒载体以及腺病毒。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒adc68基因组序列，完全删除其e1序列，改造其e3序列和e4序列，所述改造包括(但不限于)：(1)改造其e3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它e3的orf序列(例如，删除其orf1～orf8序列或orf2～orf8序列)；和，(2)改造其e4序列，以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6和/或orf6/7替换其e4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf4和/或orf3替换其e4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其e4序列中orf1、orf2和/或orf3。在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒adc68基因组为基础的序列，其中e1序列被完全删除，e3序列和e4序列被改造；所述改造包括：(1)e3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除(例如，其orf1～orf8序列被删除或orf2～orf8序列被删除)；和，(2)e4序列中，以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6和/或orf6/7替换其e4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf4和/或orf3替换其e4序列中orf4和/或orf3；较佳地其e4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。在一个优选例中，(2)中，所述c亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒adhu5，adhu1，adhu2，adhu6；较佳地为adhu5。在另一优选例中(2)中，e4序列改造包括选自：(a)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6；删除其e4序列中orf1、orf2和orf3(保留adc68来源的orf4)；(b)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4和orf3替换其e4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其e4序列中orf1、orf2、orf6/7；(c)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6的序列；(d)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4替换其e4序列中orf6、orf4；删除其e4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。在另一优选例中，所述改造包括选自：(i)删除其e3序列中orf2～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6，删除其e4序列中orf1、orf2和orf3(保留adc68来源的orf4)(adc68xy9-egfp)；(ii)删除其e3序列中orf2～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4和orf3替换其e4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其e4序列中orf1、orf2、orf6/7(adc68xy8-egfp)；(iii)删除其e3序列中orf2～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6的序列(adc68xy7-egfp)；(iv)删除其e3序列中orf1～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4和orf3替换其e4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其e4序列中orf1、orf2、orf6/7(adc68xy6-egfp)；(v)删除其e3序列中orf1～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6的序列(adc68xy5-egfp)；(vi)删除其e3序列中orf2～orf8；且以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4替换其e4序列中orf6、orf4；删除其e4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7(adc68xy10-egfp)。在另一更具体的优选例中，所述删除其e1序列为删除其基因组(黑猩猩型腺病毒adc68基因组)序列(序列位点的计算基于genbank登录号：ac_000011，后同)中第459-3402位序列；或(i)中，删除其e3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第32914-34077位替换其e4序列中第33518-34671位，删除其e4序列中第34943-36105位(adc68xy9-egfp)；(ii)删除其e3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第33193-34703位替换其e4序列中第33518-36105位的序列(adc68xy8-egfp)；(iii)删除其e3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第32914-34077位替换其e4序列中第33518-34671位的序列(adc68xy7-egfp)；(iv)删除其e3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第33193-34703替换其e4序列中第33518-36105位的序列(adc68xy6-egfp)；(v)删除其e3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第32914-34077位替换其e4序列中第33518-34671位的序列(adc68xy5-egfp)；(vi)删除其e3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒adhu5基因组e4序列中第33193-34342替换其e4序列中第33518-36105位(adc68xy10-egfp)。在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点，较佳地包括：i-ceui，pi-scei，swai，paci。在另一优选例中，所述重组腺病毒载体具有seqidno:1所示的核苷酸序列，但，其中e3序列(seqidno:1中第26593～27587位)被替换为seqidno:2或seqidno:3所示的核苷酸序列；或，其中e4序列(seqidno:1中第29274～31857位)被替换为seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6或seqidno:7所示的核苷酸序列；或，其中e1序列(seqidno:1中第2432～2871位)被删除。在本发明的另一方面，提供前面任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于插入外源基因、从而表达外源基因。在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面任一所述的重组腺病毒载体包装获得。在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(a)制备前面任一所述的重组腺病毒载体；(b)将(a)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白，具有诊断活性的蛋白，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，包括：前面任一所述的重组腺病毒载体；所述的重组腺病毒；和/或，病毒生产细胞。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、本发明腺病毒载体中，针对e1、e3和e4序列进行改造的改造示意图(adc68xy5～adc68xy10)。图2、本发明建立的腺病毒载体padc68xy5-egfp～padc68xy10-egfp的酶切鉴定电泳图。具体实施方式腺病毒的基因组比较大，以其进行载体改造较为困难，周期长。同时，以野生型腺病毒为材料，提取其基因组为模板，进行载体改造存在野生型腺病毒残留的风险。为此，本发明人经过深入的研究，揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体，称为adc68xy系列载体(具体如adc68xy5、adc68xy6、adc68xy7、adc68xy8、adc68xy9、adc68xy10)。一方面，本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强；另一方面，本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有很大的应用价值。术语如本发明所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。如本发明所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本发明所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。如本发明所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的dna片段的单链或者双链dna分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。如本发明所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本发明所用，“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本发明所用，“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本发明所用。如本发明所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。腺病毒载体腺病毒的基因组比较大，在先前的技术中，本发明人尝试了较多的改造策略，包括针对其基因组中e1和e3进行改造，删除全部或部分的基因，但是鉴于其e4区域的重要作用，现有技术中尚没有针对其e4进行系统性改造的先例。本发明人发现，可以针对e4进行全部或部分改造，以c亚型人腺病毒基因组中相应的区域进行替换、或有限地进行序列删减，可以获得复制能力、感染能力增强的病毒，甚至还可以实现外源基因插入容量的增大。在本发明人的未公开专利申请cn201910777937.2中，基于黑猩猩型腺病毒adc68基因组序列，部分删除其e1序列和e3序列，改造其e4序列；所述改造包括以c亚型人腺病毒基因组中相应的e4序列或其片段替换adc68基因组中e4序列或其片段；而本发明则提出了进一步优化的腺病毒载体以及腺病毒。为了提高安全性，用作疫苗载体的腺病毒通常为复制缺陷型，即删除了e1基因。因此，通常用整合了adhu5e1基因的hek293细胞包装和扩增非复制型腺病毒。e4orf6是一个多功能蛋白，参与病毒复制的多个过程，对于腺病毒的复制极为重要。orf6可与e1b55-kda结合，形成orf6-e1b复合物，该复合物在转录后阶段促进主要晚期病毒mrna的输出，从而加强晚期病毒基因的表达，同时抑制宿主蛋白的合成。在腺病毒感染的细胞中，orf6-e1b复合物还参与抑制e1a诱导的p53激活，从而使p53降解，抑制宿主细胞凋亡。而且，orf6可间接提高病毒dna合成效率。orf3与orf6功能相似，可部分或完全补偿彼此的缺失。尽管adhu5e1b55k和e4orf6蛋白之间的相互作用相对保守，但adc68的e4orf6蛋白与adhu5的e4orf6蛋白同源性较低，与adhu5e1b55k的结合可能不稳定或效率降低，导致非复制型黑猩猩腺病毒产量降低。为避免出现以上问题，提高重组腺病毒adc68的产量，本发明的具体实施例中，将adc68的e4序列全部或部分替换成adhu5的e4序列，设计成多个分别带有不同e4序列的重组adc68载体。adhu5属于c型人腺病毒，与c型腺病毒家族中的其他血清型腺病毒(如adhu1，adhu2，adhu6)e4orf6蛋白相似度极高(>98％)，可以预见，本发明中adc68e4的改造，除采用adhu5基因组相对应的序列作替换，亦可采用c型人腺病毒家族中的其他血清型腺病毒基因组的对应序列进行替换。在本发明的具体实施例中，本发明人采用合成生物学技术，全基因组合成e1、e3区部分删除，e1区带有绿色荧光标记的新型重组腺病adc68xy1，经线性化后在hek293细胞中成功包装，并扩增出遗传稳定的重组腺病毒adc68xy1。在adc68xy1基础上，本发明人对e1、e3、e4区域的序列进行改造：将e1区域、e3区域进行进一步删除，e4区域部分替换为adhu5来源的序列，分别得到了adc68xy5、adc68xy6、adc68xy7、adc68xy8、adc68xy9、adc68xy10。在以往研究的基础上，本发明的技术方案实现了进一步扩大外源基因的装载量的目标。基于本发明人的新方案，本发明提供了一种重组腺病毒载体(质粒)，该重组腺病毒载体包括：以黑猩猩型腺病毒adc68基因组为基础的序列，其中e1序列被删除，e3序列和e4序列被改造；所述改造包括：(1)e3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除)；和(2)e4序列中，以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6和/或orf6/7替换其e4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf4和/或orf3替换其e4序列中orf4和/或orf3；较佳地其e4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。作为本发明的优选方式，e4序列改造包括选自：(a)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6；删除其e4序列中orf1、orf2和orf3(保留adc68来源的orf4)；(b)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4和orf3替换其e4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其e4序列中orf1、orf2、orf6/7；(c)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6/7和orf6替换其e4序列中orf6/7和orf6的序列；(d)以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6、orf4替换其e4序列中orf6、orf4；删除其e4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。作为本发明的优选方式，还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列和/或酶切位点。应理解，报告基因、酶切位点等元件的设计有时候是为了在进行研究时提供方便观测或检测的途径，而当将本发明的重组腺病毒载体或重组腺病毒应用于临床药学领域时，其并非是必要的；或者，可以在所述报告基因的位置上以能表达具有药学活性的目的蛋白的基因替代。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如cmv)上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。本发明所述的表达载体中，可以插入外源基因的表达盒，从而表达人们感兴趣的目的蛋白。本发明的腺病毒表达载体可以作为一个表达载体平台，适用于表达多种目的蛋白，所述的目的蛋白没有特别的限制。作为一些可选的实施方式，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。所述的目的蛋白可以是单条，也可以是两条或多条，只要其编码基因的长度在所述腺病毒可容纳的包装容量内。本发明所述的表达载体中，外源基因表达盒插入位置不唯一，较佳地包括(但不限于)：e1区域，e3区域，e4区域蛋白。本发明的表达载体中的各元件是可操作性连接的，从而有利于病毒的包装或目的蛋白的有效表达。作为本发明的优选方式，采用基于合成生物学的技术构建本发明的新型腺病毒载体。与传统生物学的研究方向相反，合成生物学是从最基本的要素开始一步步建立零部件，在此过程中设计、修改遗传物质，最终获得理想的新生物体。但是，应理解，除了合成生物学的技术，在获得了本发明的技术方案后，其它构建本发明的腺病毒载体的方法也应被包含在本发明中。本发明不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体adc68xy，改造后的载体较传统的adc68载体更适宜在病毒包装细胞中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本。而且，本发明改造后的载体外源基因装载量也大大提高了，进一步增加了腺病毒载体的适用性。本发明为新型腺病毒载体的构建提供了一种快速有效的方法，有利于拓展腺病毒载体的应用，该腺病毒载体可容纳的外源基因的长度更为灵活，为应用腺病毒载体来表达更多种类的蛋白提供了基础。本发明的载体可应用于各种基础研究和临床应用，譬如作为各种各样的基因的表达载体，也可应用于疫苗研发、基因治疗等。本发明建立了以合成生物学制备重组腺病毒载体的新策略，这种策略无需获得野生型腺病毒，避免复杂的克隆过程，直接合成重组腺病毒的分子克隆，省时省力。这一策略解决了构建重组腺病毒载体的技术瓶颈，为重组腺病毒载体的发展和推广应用提供了坚实的理论和技术支撑。腺病毒获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如hek293细胞等。作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(tcid50)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，在较短的病毒拯救时间内就可产生高滴度的病毒。根据实施例的结果，在病毒拯救5天后即可得到重组腺病毒，扩增感染至30盘150dishhek293细胞可达到1012～1013vp/ml量级的病毒滴度，1013vp量级的病毒产量，显著优于改造前的腺病毒载体。本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效转染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低，其表达效率高且长久。本发明的腺病毒载体表达重组工艺简单、价格低廉、疗效持久。本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，外源基因装载量高。根据实施例的结果，外源基因装载量可在8.0～9.5kb。组合物、试剂盒或药盒本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的腺病毒表达有意义的目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤肿瘤细胞活性的蛋白)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽。通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒/药盒，其中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。材料和方法细胞hek293细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养液为含有10％胎牛血清的dmem。限制性内切酶、感受态细胞、基因组序列所有限制性内切酶购自newenglandbiolabs；stbl2菌种购自上海唯地生物技术有限公司。腺病毒adc68序列参照genbank公布序列，即genbank登录号：ac_000011。腺病毒人血清型5型(adhu5)的e4序列参照genbank登录号：ac_000008.1。实施例1、adc68xy系列腺病毒载体分子克隆的设计首先，本发明人将adc68基因组序列中的部分e1和e3的部分序列删除。e1删除大小为2552bp(删除区域为(459bp-3010bp)，从而可获得复制缺陷型腺病毒载体。e3删除大小为3721bp(删除区域为27615bp-31335bp)。e1/e3删除可使外源基因插入的容量达7.5kb左右。本发明人在e1删除区域加入酶切位点i-ceui/pi-scei(便于在此区域插入外源基因)，e3删除区域加入酶切位点swai(以便在此区域也可插入外源基因)，在adc68基因组的itr两侧分别加上paci酶切位点(便于将重组腺病毒质粒用paci线性化)。为了便于观察该新型重组腺病毒的包装，本发明人在e1删除区的i-ceui和pi-scei酶切位点之间插入cmv-egfp序列，获得padc68xy1-egfp(seqidno:1)使获得的重组腺病毒(adc68xy1-egfp)带有绿色荧光标记。在adc68xy1基础上，本发明人对其进行改造，将e1区域、e3区域进行进一步删除，e4区部分替换为adhu5来源，得到系列重组腺病毒载体adc68xy5-10。各载体具体改造方案见表1(表中adc68序列位点的计算基于genbank登录号：ac_000011的序列；adhu5序列位点的计算基于genbank登录号：ac_000008.1的序列)。表1本发明腺病毒载体中，针对e1、e3和e4序列进行改造的改造示意图(adc68xy5～adc68xy10)见图1。根据表1，adc68xy5、adc68xy6的e3序列如seqidno:2；adc68xy7、adc68xy8、adc68xy9、adc68xy10的e3序列如seqidno:3。根据表1，adc68xy5、adc68xy7的e4序列如seqidno:4；adc68xy6、adc68xy8的e4序列如seqidno:5；adc68xy9的e4序列如seqidno:6；adc68xy10的e4序列如seqidno:7。实施例2、padc68xy系列腺病毒载体的分子克隆及鉴定基于以上设计的重组腺病毒padc68xy1-egfp分子克隆序列，人工合成该分子克隆。在获得的腺病毒载体padc68xy1-egfp基础上，本发明人用按实施例1表1所描述以及图1所示的设计方案，利用等温重组分子克隆方法，对adc68的e1、e3和e4序列进行改造，分别获得padc68xy5-egfp、padc68xy6-egfp、padc68xy7-egfp、padc68xy8-egfp、padc68xy9-egfp、padc68xy10-egfp腺病毒病毒载体。将获得的系列腺病毒质粒padc68xy-egfp用多种酶(mfei、apai、xhoi)酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过dna条带证明系列腺病毒质粒padc68xy-egfp分子克隆是完整、正确的。酶切鉴定电泳图见图2。实施例3、adc68xy系列腺病毒包装和扩增将以上获得的重组腺病毒质粒padc68xy1-egfp、padc68xy5-egfp、padc68xy6-egfp、padc68xy7-egfp、padc68xy8-egfp、padc68xy9-egfp、padc68xy10-egfp各取2ug，用paci酶切线性化。根据lipofectamine2000转染试剂盒的使用说明，将酶切后的腺病毒质粒dna转染密度约70％的hek293细胞(6孔板)。转染前，换成无血清培养基，加入dna/脂质体复合物，转染5小时后，换含10％fbs、1％双抗的dmem培养基。在荧光显微镜下隔日观察egfp荧光强度及细胞病变，直至hek293细胞出现大量噬斑时收集细胞，在室温与-80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，3500rpm/min离心10min，收集上清置于-80℃超低温冰箱保种。转染后，随着时间的推移，绿色荧光表达发生变化：荧光逐渐富集并形成簇状，最终形成噬斑，说明在hek293细胞中黑猩猩来源的复制缺陷型腺病毒adc68xy1-egfp、adc68xy5-egfp、adc68xy6-egfp、adc68xy7-egfp、padc68xy8-egfp、adc68xy9-egfp、adc68xy10-egfp都成功包装并复制出具有感染性的病毒颗粒。但是，不同改造的腺病毒拯救所需时间(由重组腺病毒质粒转染到细胞中，得到重组腺病毒的时间)，外源基因装载量和病毒产量存在明显差异，具体情况见表2。表2腺病毒拯救时间病毒滴度病毒产量装载量adc68xy1-egfp10天6.0×1012vp/ml1.44×1013vp7.5kbadc68xy5-egfp8天5.3×1012vp/ml1.96×1013vp8.0kbadc68xy6-egfp8天4.6×1012vp/ml1.43×1013vp9.0kbadc68xy7-egfp5天2.1×1013vp/ml6.72×1013vp8.0kbadc68xy8-egfp5天1.4×1013vp/ml3.36×1013vp9.0kbadc68xy9-egfp5天1.6×1013vp/ml4.80×1013vp9.5kbadc68xy10-egfp14天4.2×1012vp/ml1.01×1013vp9.5kb结果显示，e4区域替换为adhu5来源的序列后，可极为显著地提高腺病毒产量。e3区域orf1、orf9的保留，有助于提高腺病毒产量。并且，本发明人意外地发现，e4区域部分删除(orf1-2或orf1-3)仍可拯救出腺病毒，并可进一步提高外源基因的装载量，但orf6或orf6/7必须保留；其中，orf6/7或orf6的存在有利于获得相对更高的病毒产量。除了表达“egfr”作为外源基因，本发明人也进行了多种多样的其它类型的基因的表达，一些代表性的外源基因及其表达情况如表3。表3“+++”，表达量很高；“++”，表达量高；“+”，表达量中等。结论根据上述实施例，本发明人通过对腺病毒adc68基因组序列进行分析、设计，并利用生物合成技术，整体合成重组腺病毒载体adc68xy1，由于在设计时已经加上绿色荧光蛋白，经转染、病毒包装、扩增、纯化，本发明人直接获得重组腺病毒adc68xy1-egfp。经酶切鉴定分析，本发明人获得了正确的重组腺病毒载体adc68xy。在此基础上，本发明人通过常规的分子克隆，对adc68xy1做e1、e3区进一步删除，e4作进一步替换和删除，获得重组腺病毒adc68xy5-egfp、adc68xy6-egfp、adc68xy7-egfp、padc68xy8-egfp、adc68xy9-egfp、adc68xy10-egfp，并获得相应的重组腺病毒。本发明人不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体adc68xy，改造后的载体较传统的adc68载体更适宜在包装细胞hek293中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本；而且，改造后的载体外源基因装载量也大大提高了，进一步增加了腺病毒载体的适用性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>苏州相奕生物技术有限公司<120>人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用<130>204575<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35038<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(35038)<223>padc68xy1-egfp<400>1gtcgagggatgagcgaccgttaggggcggggcgagtgacgttttgatgacgtggttgcga60ggaggagccagtttgcaagttctcgtgggaaaagtgacgtcaaacgaggtgtggtttgaa120cacggaaatactcaattttcccgcgctctctgacaggaaatgaggtgtttctgggcggat180gcaagtgaaaacgggccattttcgcgcgaaaactgaatgaggaagtgaaaatctgagtaa240tttcgcgtttatggcagggaggagtatttgccgagggccgagtagactttgaccgattac300gtgggggtttcgattaccgtgtttttcacctaaatttccgcgtacggtgtcaaagtccgg360tgtttttacgtacgatatcatttccccgaaagtgccacctgaccgtaactataacggtcc420taaggtagcgaaagctcagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgct480ctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagt540agtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaaga600atctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgtt660gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcc720catatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccca780acgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaataggga840ctttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatc900aagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcct960ggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtat1020tagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagc1080ggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgtttt1140ggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaa1200tgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagag1260aacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctg1320gctagcgtttaaacgggcccgcccgggcttataagccaccatggtgagcaagggcgagga1380gctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaa1440gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagtt1500catctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgaccta1560cggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtc1620cgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaacta1680caagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaa1740gggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaa1800cagccaca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