一种硫酸软骨素的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种动物软骨和气管中硫酸软骨素的提取方法。

背景技术：

硫酸软骨素（cs）是一种酸性粘多糖，其基本单位是d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-氨基半乳糖硫酸酯。硫酸软骨素一般含有50-70个双糖基本结构，分子量约为10-50kda。硫酸软骨素具有不同的生理活性，可广泛应用于医疗、药品、食品、化妆品等行业中。在临床上，硫酸软骨素由于其良好的抗炎性可用于治疗神经痛、关节炎、以及促进溃疡愈合等疾病，在食品工业中，可作为膳食补充剂。

目前，国内外对鱼、猪、牛、羊等动物软骨中硫酸软骨素的提取方法进行了大量的研究，但在以软骨及气管混合物为原料制备硫酸软骨素的研究较少。鸡鸭等家禽生长周期短，养殖量大，屠宰加工的副产品软骨的硫酸软骨素含量高。而猪气管作为屠宰后的副产物，也含有丰富的硫酸软骨素，但屠宰后常被作为废弃物处理，未能充分利用。

硫酸软骨素以蛋白聚糖的形式存在于软骨中，软骨膜和软骨基质中分别含有大量的ⅰ型胶原和ⅱ型胶原。因此，在硫酸软骨素的提取过程中主要去除的杂质是蛋白质，通过破坏糖与肽之间的糖苷键，从而使硫酸软骨素从糖蛋白中释放出来。现有工艺中常采用碱提取、酶解、超声辅助等提取硫酸软骨素，碱法提取主要是破坏多糖链与蛋白质之间的共价键，使蛋白多糖的糖-肽键断裂，从而将硫酸软骨素释放出来；碱的浓度对硫酸软骨素的产率和纯度影响很大，碱液浓度小，制备硫酸软骨素的生产周期长，制备的样品溶液较混浊。原因在于稀碱温和条件下软骨中的胶原蛋白、粘蛋白等不能完全水解，且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去，同时由于产品中小分子杂质如多肽等易随同硫酸软骨素沉淀，因而会影响产品产率和纯度。若碱液浓度过大，硫酸软骨素易降解为分子量较小的低聚糖，且颜色深。因此需加入酶协同提取，酶的作用是利用蛋白酶水解蛋白质的特异性，使胶原蛋白和粘蛋白等水解成氨基酸；加入蛋白酶降解时，由于反应条件温和，不会使硫酸软骨素发生降解，从而保证了硫酸软骨素的活性；同时可使溶液中及硫酸软骨素长链上的蛋白质进一步水解，生成可溶性小分子肽、氨基酸等物质。在生产硫酸软骨素过程中，因其主要以蛋白多糖形式存在，蛋白质作为硫酸软骨素中最主要的杂质之一，必须尽可能除去。一般情况下通过一次酶解，产品的含氮量很难达到要求，而采用复合酶可以加强水解，且所用酶类应选择作用肽键广泛的酶，有利于取得较好的酶解效果。通常酶解后得到的产物在加工过程中被当做废水排出，既污染环境也浪费了宝贵资源，因此需要对酶解后的小分子肽进行充分的回收利用，进行高值化利用，提高原料的综合利用价值。

动物软骨或气管化学成分复杂，含脂肪、糖原等多种大分子物质，干扰硫酸软骨素的分离和纯化，因此也需要通过胶原蛋白酶、脂肪酶等特异性的酶降解原料中的杂质，提高硫酸软骨素的纯度。

中国专利cn111253503a公开了一种超声辅助碱盐-酶解法在鳐鱼中提取硫酸软骨素的方法，超声时间180min，碱液浓度2.3%，酶解12h，最佳提取率可达到43.32%。虽提取率较高，但较难应用于大规模生产。专利cn110922503a公开了一种在猪牛鼻骨中提取

硫酸软骨素的工艺，软骨粉碎后加入碱液调节ph值为10-14，15-20℃浸泡25-35h，固液分离后，在提取液中加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、胰酶的复合酶反应5-10h，再进行分离纯化得到硫酸软骨素，纯度为93.5%~93.7%。该工艺采用了复合酶解法，但原料预处理耗时较长，而且需要保持浸泡时温度在15-20℃，耗能大。后期酶解分离的时间长，酶解效率不高。在专利cn109280095a中，将禽畜结缔组织水煮后，干燥粉碎，加入6倍体积的浓度为2~6%的碱液浸提，得碱提液，调节ph值至中性后再进行复合酶解（碱性蛋白酶、风味蛋白酶和脂肪酶），灭酶后再加入脂肪酶酶解得酶解液，经活性炭吸附和除蛋白得到硫酸软骨素，产率达12%以上，产品纯度达95.5%。该生产工艺采用碱提和复合酶二级酶解结合，得到的产品纯度高，但碱提过程需加入大量的碱液，而酶解过程又需加入酸调节适合ph，导致提取液中盐含量高，而且蛋白水解产物也未进行有效利用，增加废水处理难度，而吸附采用的活性炭也只能作为固废处理，造成资源浪费和环境污染。中国专利cn102533915b发明了一种酶解动物软骨制备硫酸软骨素和胶原蛋白多肽的方法，采用阴离子交换树脂回收胶原蛋白多肽，所得胶原蛋白多肽分子量集中在4000da以下，实现了软骨的高值化利用。但离子交换树脂在工业生产中需消耗大量的盐洗脱剂，并且使用后需再生，操作繁琐。中国专利cn111533826a提出了一种从猪骨中同时提取硫酸软骨素和骨胶原蛋白肽的方法，在115~120℃、130~135℃分别进行两次原料的抽提，每次60min，再进行酶解。采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行一次酶解2h，酶解液经树脂吸附3~5h、再洗脱除盐得到硫酸软骨素溶液；加入角蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶进行二次酶解2h，经陶瓷膜（1000da）过滤得到骨胶原蛋白肽。所得到的硫酸软骨素收率为17.8%-18.5%，纯度为99.8%以上，骨胶原蛋白肽收率在23.3-26.1%之间，分子量为150-600da。该方法能获得较高纯度的硫酸软骨素，但抽提温度较高，时间较长，在抽提过程中容易破坏硫酸软骨素结构，可能导致降解或产物颜色加深。树脂吸附虽然特异性强，但洗脱和再生过程，需要耗费大量的资源，工厂生产的可操作性不强，能耗较大，成本较高。生产过程中需进行多次过滤分离，耗时长，生产连续性不高。

对现有技术的分析，存在的问题及缺陷为：

(1)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中酶解专一性不高，酶解效率低。

(2)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中引入大量的酸碱试剂，增加了后续除盐负担，影响硫酸软骨素品质，影响企业生产的经济效益，并且造成环境污染。

(3)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中工艺繁琐，生产周期长，不适于工厂连续生产，可操作性不强。

技术实现要素：

本发明旨在充分利用屠宰加工中的废弃物，采用二级酶解法充分水解蛋白质：一级酶解通过添加胰酶和脂肪酶复合酶水解糖-肽键的同时，也减少脂肪等杂质的干扰，进行初步分离；再继续通过二级酶解的复合蛋白酶充分水解蛋白质，得到高品质的硫酸软骨素和胶原蛋白寡肽，所得胶原蛋白寡肽集中分布在1000da以下，该分子量范围的寡肽稳定性好，生物活性高。本发明工艺重在克服现有工艺中存在的酶解不完全，酶解时间长、过程参数不易控制、碱液浓度过高影响硫酸软骨素和胶原蛋白肽纯度的缺陷，结合超滤和纳滤分离技术纯化产品，减少环境污染和生产成本，提高了禽畜加工废弃物的综合利用价值，实现绿色环保经济的制备，适用于工业上大规模生产。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种动物软骨和/或气管中生产硫酸软骨素的方法，包括以下步骤：

(1)清洗：软骨/气管按照质量比为1:1-1:5投入，清洗。

(2)蒸煮：软骨及气管在蒸煮罐中加水浸没，升温至80-100℃进行水煮，保持1-3h，使软骨表面的肌肉组织剥离。

(3)降温：蒸煮后的料液降温至45-55℃。

(4)一级酶解：在步骤(3)所得料液中，加入少量氢氧化钠调节料液为弱碱性，按照原料质量的1.0%-4.0%的比例加入复合酶至反应罐中，保持搅拌，反应温度为45-55℃，反应2.0-5.0h。

(5)二级酶解：步骤(4)反应结束后，按照原料质量的0.20%-0.40%的比例加入复合酶，保持搅拌，酶解反应1.5-4.0h。二级酶解反应结束后升温至70-85℃，沉降灭活0.5-1.5h。

(6)过滤和超滤：将步骤(5)所得酶解液进行过滤，收集滤液，滤渣水洗1-2次，合并滤液，通过超滤膜过滤，超滤后分别收集浓缩液和透过液。

(7)醇沉：在步骤(6)所得浓缩液中加入3-5倍体积的95%乙醇，沉降0.5-1.0h后离心收集沉淀，经干燥得到硫酸软骨素成品，乙醇可回收使用。

(8)副产品胶原蛋白肽回收：将步骤(6)所得透过液经纳滤脱盐并浓缩后，干燥即得到胶原蛋白肽副产品。

步骤(4)所述弱碱性ph值为8.00-9.50，所述一级水解复合酶为胰酶和脂肪酶的复合物，所述胰酶为猪胰脏。

步骤(5)所述二级水解复合酶为胶原蛋白酶与中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或几种的混合物。优选为中性蛋白酶、胶原蛋白酶的混合物，其质量比为2:1-5:3。

步骤(6)所述超滤膜截留分子量优选为3000-5000da，操作压力优选为4-8bar。

步骤(7)(8)所述干燥方式为喷雾干燥、鼓风干燥，真空干燥，冷冻干燥的一种，优选真空干燥和喷雾干燥，真空干燥温度优选为55-70℃。

步骤(8)所述纳滤膜截留分子量优选为100-500da，操作压力优选为8-12bar。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明利用畜禽的软骨气管混合物为提取原料，增加了硫酸软骨素的来源，提高了加工废弃物的附加值。

(2)本发明一级酶解调节料液ph值为弱碱性，并延长了酶解时间，该ph条件不仅利于酶解，也有利于弱碱性条件下糖肽键的断裂而不破坏硫酸软骨素，增加了水解效果，更好地除去杂质。

(3)本发明一级酶解复合酶为胰酶和脂肪酶的复合物，胰酶本身为多种酶（胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶等）的复合物，又加入脂肪酶增强了对原料中糖原、脂肪、蛋白质的水解效果，提高了酶解效率，进行初步分离，减少了后续分离的干扰。并采用猪胰脏代替工业胰蛋白酶进行酶解，简单易获取，减少了化学杂质的混入，实现了资源的高值化利用。

(4)本发明一级酶解反应结束后的ph和温度条件适合进行二级酶解反应，无需反复调节反应罐温度或加入酸碱调节料液ph，避免了硫酸软骨素在提取过程中的结构破坏，极大程度地保留了其生物活性，简化了操作步骤。减少酸碱的加入既提高了硫酸软骨素和副产品多肽的品质，也降低了生产成本和污水处理成本。

(5)本发明根据原料化学成分复杂的特性，选择了胶原蛋白酶和中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或几种进行复合，所用酶类作用肽键广泛，有利于取得较好的酶解效果。

(6)本发明在提取过程中，采用连续二级酶解法，生产过程中无需反复过滤分离、调节温度和ph，缩短了反应时间，简化了提取工艺，有利于连续生产，适用于工业化大规模生产。

(7)本发明在提取过程中，根据物料特性，选择了特异性复合酶进行分步二级酶解，提高了酶解效率，有效降低了后续分离过程中的膜污染，提高了分离效率，节省了分离成本。

(8)本发明采用超滤技术对硫酸软骨素料液进行分离纯化，有利于分离料液中的小分子杂质以及盐分，有效提高了硫酸软骨素的纯度。

(9)本发明将超滤后的透过液通过纳滤工艺进行回收利用，获得了低盐高纯度且洁白无异味的胶原蛋白寡肽，所得寡肽分子量集中分布在1000da，产品稳定，生物活性高，可利用程度高。该纳滤设备简单易操作，有效回收副产物，实现了资源的高值化利用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的硫酸软骨素提取物高效液相色谱检测图。

图2是本发明实施例提供的蛋白肽分子量分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：

称取软骨500g，气管500g，以饮用水清洗2遍。投入蒸煮罐中，加蒸馏水浸没，升温至100℃，煮2h。降温冷却至45℃后，加入少量氢氧化钠调节料液ph为8.50。

在蒸煮料液中加入猪胰脏35g，脂肪酶5g，并辅以搅拌桨缓慢搅拌，温度保持在45-50℃，反应4h。

在上述料液中，按照原料质量0.20%的比例加入包含了中性蛋白酶和胶原蛋白酶的混合酶（混合酶中两者质量比例为2:1），温度维持在45℃，反应2.5h。（一级酶解结束后ph稳定，适合进行二级酶解反应，无需额外加入酸碱调节ph）酶解结束后，料液升温至80℃，静置1.0h后进行过滤，收集滤液，对滤渣用1-2倍体积的纯水清洗，合并滤液和水洗液。

对上述料液进行超滤膜过滤，超滤工艺条件为：操作压力4bar，截留分子量为5000da，温度为室温（25℃）。经超滤膜过滤后，分别收集膜透过液和浓缩液。

在超滤浓缩液中加入质量分数为95%的乙醇，使得料液中乙醇浓度达到75%，静置沉淀1.0h后离心，收集沉淀，经55℃真空干燥4.0h得到硫酸软骨素成品。乙醇进入回收罐中，回收利用。

将所述超滤透过液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤工艺条件为：操作压力8bar，截留分子量100da，温度为室温（25℃）。所得纳滤浓缩液经双效蒸发浓缩器浓缩后，再进行喷雾干燥，得到副产品胶原蛋白肽。

硫酸软骨素得率按照下式计算，硫酸软骨素含量按照色谱法测定（图2）。

得率=（硫酸软骨素产品质量/称取原料质量（湿重））*100%

经检测，硫酸软骨素产品产率为28.8%。硫酸软骨素含量为99.3%。胶原蛋白肽产率为10.5%，灰分含量为1.4%。

与传统工艺相比，本实施例中采用的工艺简单，不需反复调节反应温度和ph。连续二级酶解法能有效提高酶解效率，减少脂肪等杂质的干扰，专一性强，有利于充分水解蛋白，提高硫酸软骨素的收率和纯度。一级酶解以猪胰脏作为化学酶制剂的替代物，合理利用资源，降低了生产成本。

实施例2：

称取软骨250g，气管750g，以饮用水清洗2遍。投入蒸煮罐中，加蒸馏水浸没，升温至100℃，煮2h。降温冷却至50℃后，加入少量氢氧化钠调节料液ph为9.00。

在蒸煮料液中加入猪胰脏30g，脂肪酶10g，并辅以搅拌桨低速搅拌，温度保持在50℃，反应2.0h。

在上述料液中，按照原料质量0.40%的比例加入包含了胶原蛋白酶以及风味蛋白酶的混合酶（混合酶中两者质量比例为5:3），温度维持在50℃，反应2.0h。（一级酶解结束后ph稳定，适合进行二级酶解反应，无需额外添加酸碱调节ph）酶解结束后，料液升温至80℃，静置1.0h后进行过滤，收集滤液，对滤渣用1-2倍体积的纯水清洗，合并滤液和水洗液。

对上述料液进行超滤膜过滤，超滤工艺条件为：操作压力8bar，截留分子量为3000da，温度为室温（25℃）。经超滤膜过滤后，分别收集膜透过液和浓缩液。

在超滤浓缩液中加入质量分数为95%的乙醇，使得料液中乙醇浓度达到75%，静置沉淀1.0h后离心，收集沉淀，经65℃真空干燥4h得到硫酸软骨素成品。乙醇进入回收罐中，回收利用。

将所述超滤透过液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤工艺条件为：操作压力12bar，截留分子量100da，温度为室温（25℃）。所得纳滤浓缩液经双效蒸发浓缩器浓缩后，再进行喷雾干燥，得到副产品胶原蛋白肽。

硫酸软骨素得率按照下式计算，硫酸软骨素含量按照色谱法测定。

产率=（硫酸软骨素产品质量/称取原料质量（湿重））*100%

经检测，硫酸软骨素产品产率为29.7%。硫酸软骨素含量为99.4%。胶原蛋白肽产率为8.5%，灰分含量为1.4%。

与传统工艺相比，本实施例中采用的工艺简单，不需反复调节反应温度和ph，二级酶解能有效减少原料中杂质的干扰，有利于充分水解蛋白，提高硫酸软骨素的收率和纯度。一级酶解以猪胰脏为作为化学酶制剂的替代物，合理利用资源，降低了生产成本。

对比例

本实施例采用单一酶解制备硫酸软骨素。具体实施方法为：称取软骨500g，气管500g，以饮用水清洗2遍。投入蒸煮罐中，加蒸馏水浸没，升温至100℃，水煮4h。降温冷却至45-50℃后，加入氢氧化钠调节料液ph为8.00-9.00，并维持该温度。按照原料质量的3.0%加入猪胰脏30g，并辅以搅拌桨缓慢搅拌，温度保持在45-50℃，反应1.5h。再加入氢氧化钠调节料液ph值为10.0-11.0，按原料0.30%的比例加入碱性蛋白酶3g。温度维持45-50℃，料液ph值维持在10.0-11.0，反应2.0h。酶解结束后，料液升温至80℃，静置1.0h后进行过滤，收集滤液，对滤渣用1-2倍体积的纯水清洗，合并滤液和水洗液。对上述料液进行超滤膜过滤，超滤工艺条件为：操作压力5bar，截留分子量为5000da，温度为室温（25℃）。经超滤膜过滤后，分别收集膜透过液和浓缩液。在超滤浓缩液中加入质量分数为95%的乙醇，使得料液中乙醇浓度达到75%，静置沉淀1.0h后离心，收集沉淀，经55℃真空干燥4h得到硫酸软骨素成品。乙醇进入回收罐中，回收利用。将所述超滤透过液通过纳滤膜进行浓缩，纳滤工艺条件为：操作压力10bar，截留分子量100da，温度为室温（25℃）。所得纳滤浓缩液经双效蒸发浓缩器浓缩后，再进行喷雾干燥，得到副产品胶原蛋白肽。

经检测，本实施例得到的硫酸软骨素产品产率为18.2%。硫酸软骨素含量为85.6%。胶原蛋白肽产率为5.5%，灰分含量为6.9%。

表明本专利所述连续二级酶解法所得硫酸软骨素提取率更高，纯度更高，并且可获得低灰分高品质的胶原蛋白肽副产品，可操作性强，有利于工业上大规模生产。