脉红螺消化蛋白酶的纯化方法

本发明涉及一种蛋白酶的取样方法，尤其是指脉红螺消化蛋白酶的纯化方法。

背景技术：

自1905年10月1日，leven发表了《thecleavageproductsofproteoses》，至今，对蛋白酶的研究仅仅经过100多年，已有35万篇与蛋白酶相关的文献。蛋白酶参与dna遗传信息的传递、血管生成、创伤修复、干细胞动员、止血、凝血、炎症反应、免疫反应、细胞自噬、衰老、坏死和细胞凋亡等生物过程[3-4]。许多蛋白酶已经成为疾病预测及诊断的生物标志，在药物治疗方面为我们提供了新的方向。脉红螺是一种大型的肉食性软体动物，运动器官较强，感觉器官灵敏，主要以牡蛎、扇贝、中国蛤蜊、菲律宾蛤仔等双壳贝类为食，并能在短时间内将这些高蛋白消化吸收，因此脉红螺的消化液中含有活力很强的蛋白酶，然而脉红螺的消化腺体种类多，包括唾液腺、勒布林氏腺、肝脏，脉红螺不同摄食方式消化腺体的物质成分差异，在摄食的不同阶段消化蛋白酶的分泌量不同，因此取样方法得当，获得足够的蛋白酶粗酶液是后期蛋白酶分离纯化的物质基础。

技术实现要素：

为了有效获取脉红螺稚消化蛋白酶，避免取样不当造成的蛋白酶获取量少、活性不高的情况，本发明提供一种获得脉红螺高效消化蛋白酶粗酶液的最佳方法，为后期蛋白酶的进一步纯化提供保障。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种脉红螺消化蛋白酶的纯化方法，包括下列步骤：a、脉红螺成螺用单一品种的双壳贝类人工养殖不少于20天；b、脉红螺成螺禁食3-7日，禁食时间随水温调整，水温21-25℃禁食3日，18-20℃禁食4日，14-17℃禁食5日，10-13℃禁食6日，6-7℃禁食7日；c、投喂同品种双壳贝类，观察脉红螺捕食过程；d、脉红螺将足部延伸包裹住双壳贝类之时，将脉红螺取出快速砸碎螺壳；e、迅速解剖脉红螺软体部；f、将唾液腺取出并放入-20℃冷冻。

本发明的有益效果是，保证了脉红螺消化蛋白酶粗酶液的浓度，为蛋白酶的后期纯化提供足够的物质基础，有效避免了1)前期饵料种类繁多引起脉红螺消化腺粘液分泌多不利于蛋白酶的分离纯化；2)双壳贝类摄入前脉红螺消化腺不合成蛋白酶；3)双壳贝类摄入后脉红螺消化腺中的蛋白酶已分泌到食物中消化腺中蛋白酶含量很少的情况；4)脉红螺的勒布林氏腺、肝脏作为辅助消化腺体蛋白酶的分泌量少，混入唾液腺会增加粗酶液中杂蛋白的含量。同时在脉红螺唾液腺中蛋白酶含量最高的时候快速将其解剖冷冻，防止了蛋白酶的分泌或自我降解。

附图说明

图1是野生脉红螺活体照片。

图2是砸碎脉红螺螺壳后解剖脉红螺软体部取出唾液腺的照片。

图3是勒布林氏腺、唾液腺、肝脏粗酶液的酶活检测照片。

图4是脉红螺不同摄食阶段唾液腺蛋白酶的相对比活力图。

具体实施方式

实施例一：

由威海市双岛湾海域获得野生脉红螺50个，用贻贝喂养30天，水温14-15℃，饥饿5天，投喂贻贝，观察，当脉红螺用足包裹住贻贝后(如图1所示)，马上将脉红螺取出并砸碎螺壳，迅速解剖脉红螺软体部，将唾液腺取出并放入-20℃冷冻(见图2所示)。

将相同摄食期收集到的唾液腺、勒布林氏腺、肝脏各10个腺体分别混合用纯水洗净，剪碎，于研钵中研磨，加入适量预冷的0.02mph7.0磷酸缓冲液，转移至玻璃匀浆器中用高速匀浆机进行匀浆，至溶液均匀。匀浆液转移至离心管中，5000r/min离心15min。弃沉淀，留上清液即为粗酶液。准确称取7.0g酪蛋白琼脂，加热溶解于200ml蒸馏水中，取30ml均匀倒于平板中，冷却凝固后打孔，取30μl勒布林氏腺、唾液腺、肝脏的粗酶液加入，在室温下反应8h，倒入0.4mol/l的三氯乙酸，观察水解圈的大小。以ph7.0的磷酸缓冲液作为阴性对照，0.5mg/ml的胰蛋白酶作为阳性对照。勒布林氏腺、唾液腺、肝脏粗酶液的酶活检测结果如图3所示。

实施例二：

取威海圣航水产科技有限公司暂养脉红螺50个，用牡蛎喂养23天，水温22-23℃，饥饿3天后，投喂牡蛎，观察，分别取开始移近牡蛎(捕食中)、用足包裹住牡蛎(摄食前)、真正用吻刮食牡蛎软体部(摄食中)及吃完牡蛎丢弃牡蛎壳(摄食后)的脉红螺，砸碎螺壳，迅速解剖脉红螺软体部，将唾液腺取出并放入-20℃冷冻。将收集到的不同摄食时期的唾液腺各10个分别混合用纯水洗净，剪碎，于研钵中研磨，加入适量预冷的0.02mph7.0磷酸缓冲液，转移至玻璃匀浆器中用高速匀浆机进行匀浆，至溶液均匀。匀浆液转移至离心管中，5000r/min离心15min。弃沉淀，留上清液即为粗酶液。取浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的酪氨酸溶液各1ml，分别加入5ml0.4mol/l的na2co3溶液。置于40℃恒温水浴中保温20min，用分光光度计测吸光度值a680nm。以酪氨酸含量为横坐标，a680nm为纵坐标绘制标准曲线。将粗酶液与酪蛋白溶液于40℃水浴中预热15min，取1ml1％的酪蛋白溶液加入已保温好的1ml酶液中，混匀，于40℃水浴中反应40min。准确计时，反应完毕后每管中立刻加入2ml0.4mol/l的三氯乙酸，混匀，以终止反应。静置10min，5000r/min离心10min,取1ml上清液于试管中。加入5ml0.4mol/l的na2co3溶液与1ml福林酚工作液。混匀后于40℃水浴中保温20min，结束后测680nm处od值。按照福林酚法测定蛋白酶活力。

对照组：先将2ml0.4mol/l的三氯乙酸加入预先保温好的1ml酶液中，反应40min后再加1ml1％的酪蛋白溶液，摇匀后离心，取上清液作对照。

酶活力单位：规定在40℃、ph7.0的条件下，水解酪蛋白每分钟产1ug酪氨酸作为一个酶活力单位，用u表示。

则1ml样品中含有的酶活力单位为：(a样-a对)×k×v×n÷t。

其中，a样是样品的吸光度值；a对是对照的吸光度值；k是标准曲线上吸光度是1时酪氨酸含量；t是反应时间，本实验中t＝10min；v是反应样品总体积，本实验中v＝4ml；n是酶液的稀释倍数，每次根据样品情况进行相应的稀释。

则比活力为1ml样品中含有的酶活力单位数除以1ml样品的蛋白含量，用u/mg表示。

酶液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝g-250法(bradford法)。

考马斯亮蓝试剂配制方法：称取100mg考马斯亮蓝g-250，用50ml95％的乙醇溶解，再加100ml85％的磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml，最后用滤纸过滤。

取100μl适当稀释后的各时期唾液腺体研磨液,加5ml考马斯亮蓝g-250试剂，混合均匀后，用分光光度计测定样品于595nm处的吸光度值。空白对照用100μl水代替样品。以1mg/ml的牛血清清蛋白作标准蛋白质溶液来制作标准曲线。

脉红螺不同摄食阶段唾液腺蛋白酶的相对比活力如图4所示。

可见脉红螺捕食过程中唾液腺蛋白酶的相对比活性最低，摄食结束后次之，摄食前即脉红螺用足包裹住双壳贝类时唾液腺蛋白酶的相对比活性最高。