技术特征：
1.一次性检测多融合基因的五色fish探针系统，包含：标记第一荧光素的第一探针，其与alk基因断裂点5’端杂交；标记第二荧光素的第二探针，其与alk基因断裂点3’端杂交；标记第三荧光素的第三探针，其与alk基因断裂点5’端和3’端杂交；标记第一荧光素的第四探针，其与ros1基因断裂点5’端杂交；标记第二荧光素的第五探针，其与ros1基因断裂点3’端杂交；标记第三荧光素的第六探针，其与ret基因断裂点5’端杂交；标记第四荧光素的第七探针，其与ret基因断裂点3’端杂交；标记第五荧光素的第八探针，其与ret基因断裂点5’端和3’端杂交；标记第三荧光素的第九探针，其与met基因杂交；标记第四荧光素的第十探针，其与7号染色体着丝粒杂交；其中，第一荧光素、第二荧光素、第三荧光素、第四荧光素、第五荧光素为不同颜色的荧光素。2.如权利要求1所述的五色fish探针系统，其特征在于，第一荧光素为绿色荧光素，第二荧光素为橙色荧光素，第三荧光素为蓝色荧光素，第四荧光素为红色荧光素，第五荧光素为金色荧光素。3.如权利要求1或2所述的五色fish探针系统，其特征在于，第一探针位于chr2：29,563,514
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29,926,884；第二探针位于chr2：29,135,420
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29,365,842；第三探针位于chr2：28,933,548
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30,336,478；第四探针位于chr6：117,110,256
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117,598,544；第五探针位于chr6：117,658,624
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117,821,562；第六探针位于chr10：43,258,465
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43,526,541；第七探针位于chr10：43,625,984
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44,026,625；第八探针位于chr10：43,090,623
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44,352,264；第九探针位于chr7：116,054,223
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116,568,442；第十探针位于chr7：7p11.1
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q11.1。4.如权利要求1所述的五色fish探针系统，其特征在于，通过以下方式制得：所述的第一～第九探针通过以下步骤制得：利用携带有检测基因的bac菌种，获得所述检测基因的克隆后，提取所述检测基因的dna；根据设计的杂交位点，选定限制性内切酶对所述检测基因的dna进行两次酶切，得到所述检测基因的小片段dna探针；再采用缺口平移的方法将选定的荧光素标记连接到所述检测基因的小片段dna探针上，纯化得到所述检测基因的探针；所述检测基因为alk、ros1、ret或met基因；所述的第十探针通过以下步骤制得：以7号染色体着丝粒位于chr7：7p11.1
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q11.1的序列为模板，采用聚合酶链技术进行pcr扩增反应得到pcr产物；采用缺口平移的方法将选定的荧光素标记连接到所述pcr产物上，纯化后得到第十探针。5.如权利要求4所述的五色fish探针系统，其特征在于，携带有alk基因的bac菌种，编号为rp11
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701p18；携带有ros1基因的bac菌种，编号为rp11
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323o17；携带有ret基因的bac菌种，编号为rp11
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242a16；携带有met基因的bac菌种，编号为rp11
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114o6。
6.一次性检测多融合基因的五色fish试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～5中任一项所述的五色fish探针系统。7.利用如权利要求6所述的五色fish试剂盒一次性检测多融合基因的方法，包括以下步骤：(1)将待测样本固定在玻片上进行预处理切片；(2)将如权利要求1～5中任一项所述的五色fish探针系统加至待测样本切片的待杂交区域，共变性后，封片杂交；杂交完成后，洗涤玻片；对杂交区域细胞核进行复染，封片；(3)使用具有匹配滤光块的荧光显微镜对玻片杂交区域进行观察，并对结果进行判断，以确定所述待测样本中alk、ros1、ret和met基因是否存在异常。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，第一荧光素为绿色荧光素，第二荧光素为橙色荧光素，第三荧光素为蓝色荧光素，第四荧光素为红色荧光素，第五荧光素为金色荧光素。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，采取以下原则进行判断：先使用第一/第二荧光素双通道滤光片的荧光显微镜进行观察，当观察到的信号均为第一/第二荧光素信号融合，则表明alk/ros1基因均无分离；当观察到分离的第一荧光素和第二荧光素信号，则使用第三荧光素单通道滤光片的荧光显微镜进行观察，观察分离的第一荧光素和第二荧光素信号是否伴随第三荧光素信号：如果分离的第一荧光素和第二荧光素信号伴随第三荧光素信号，则代表alk基因分离；如果分离的第一荧光素和第二荧光素信号并无第三荧光素信号伴随，则代表ros1基因分离；如果同时既观察到分离的第一荧光素和第二荧光素信号伴随第三荧光素信号，又观察到分离的第一荧光素和第二荧光素信号无第三荧光素信号伴随，则代表alk基因和ros1基因均发生分离；使用第五荧光素/第四荧光素/第三荧光素单通道滤光片的荧光显微镜进行观察，当出现信号为2个第五荧光素/第四荧光素/第三荧光素融合，表示ret基因正常；当出现1个第五荧光素/第四荧光素/第三荧光素融合、1个第五荧光素/第三荧光素融合、1个第五荧光素/第四荧光素融合，表示ret基因分离；当出现的荧光信号组合为2个第四荧光素2个第三荧光素，表示met基因正常；当出现的荧光信号组合中第三荧光素信号数增多，表示met基因扩增。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采取以下原则对结果进行判断：先使用橙绿双通道滤光片的荧光显微镜进行观察，当观察到的信号均为橙绿信号融合，则表明alk/ros1基因均无分离；当观察到分离的橙、绿信号，则使用蓝色单通道滤光片的荧光显微镜进行观察，观察分离的橙、绿信号是否伴随蓝色信号：如果分离的橙、绿信号伴随蓝色信号，则代表alk基因分离；如果分离的橙、绿信号并无蓝色信号伴随，则代表ros1基因分离；如果同时既观察到分离的橙、绿信号伴随蓝色信号，又观察到分离的橙、绿信号无蓝色信号伴随，则代表alk基因和ros1基因均发生分离；使用金/红/蓝单通道滤光片的荧光显微镜进行观察，当出现信号为2个金/红/蓝融合，表示ret基因正常；当出现1个金/红/蓝融合、1个金/蓝融合、1个金/红融合，表示ret基因分离；当出现的荧光信号组合为2红2蓝，表示met基因正常；当出现的荧光信号组合中蓝色信号数增多，表示met基因扩增。
技术总结
本发明公开了一次性检测多基因的五色FISH探针系统及方法。本发明的探针系统设计巧妙，实现了在一张标本切片上单次FISH同时检测非小细胞肺癌的ALK、ROSl、RET、MET四个基因的状态，从而快速确定晚期NSCLC患者是否存在上述融合基因，节省了标本和试剂，大大缩短了检测的时间。本发明对ALK、ROSl、RET和MET四个基因的联合检测，提高了预后预测的灵敏度和准确性。根据本发明检测结果选择相对应的分子靶向药物，能够更可靠地指导肺癌临床治疗方案的制定，从而改善预后。从而改善预后。
技术研发人员：卢红阳 张谷 樊滢
受保护的技术使用者：浙江省肿瘤医院
技术研发日：2021.09.14
技术公布日：2021/11/21