乙型肝炎感染患者和携带者血浆中的一组分子标志物及其用途

1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及乙型肝炎感染患者和携带者血浆中的一组分子标志物及其用途。


背景技术：

2.乙型肝炎，又称乙型病毒性肝炎，是由乙型肝炎病毒(hbv)引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。乙型肝炎主要由乙型肝炎患者和hbv携带者为主要传染源，主要传播路径可包括母婴、血和血液制品、破损的皮肤黏膜及性接触传播，传播途径广泛，感染能力强，且hbv在外界抵抗力很强，能耐受一般浓度的消毒剂，具有较大的威胁性。
3.mirna是一类非编码的小rna分子，可通过转录抑制或诱导信使rna的降解负向调节基因表达。在相关技术中，mirna在血浆、血清、唾液、尿液、精液等体液中显示出较好的稳定性，可以作为各种疾病新颖、无创的监测指标。
4.因此，开发一种兼具准确度高、特异性强以及灵敏度优异的mirna分子标志物或组合，对于乙型肝炎病毒(hbv)的早期筛查、诊断和监测预后复发中具有极为重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种乙型肝炎病毒mirna分子标志物组合及其应用，该标志物组合为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合，能够有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者，敏感度高，特异性强，对于乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者的早期筛查、诊断和监测预后复发具有极为重要的意义。
6.本发明的第一方面，提供一组标志物组合，该标志物组合为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
7.发明人借助以上标志物，发现在健康对照人群以及乙型肝炎病毒感染者或携带者中，多个标志物的表达水平存在显著的表达差异。因此，本发明选用以上标志物作为乙型肝炎病毒感染的标志物。
8.本发明的第二方面，提供本发明的第一方面所述的标志物组合作为乙型病毒性肝炎感染诊断分子标志物的用途。
9.当然，根据本发明实施例中的信息，采用hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中任意4种的组合也在本发明所涉及的保护范围内。
10.本发明的第三方面，提供定量检测标志物表达量的试剂在制备诊断、辅助诊断或预后检测乙型肝炎感染情况的试剂盒中的应用。
11.根据本发明的第三方面，在本发明的一些实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的至少一种。
12.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的任意4种。
13.在本发明的一些更优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
14.根据本发明的第三方面，在本发明的一些实施方式中，诊断、辅助诊断或预后检测乙型肝炎感染情况的步骤包括：
15.1)确定受试者样品中的标志物表达量；
16.2)根据受试者样品和正常人样品的表达量差异，预测受试者体内是否携带乙型肝炎病毒。
17.其中，若受试者样品标志物表达量与正常人样品表达量有显著差异，说明受试者体内携带乙型肝炎病毒，若受试者样品标志物表达量与正常人样品表达量无显著差异，说明受试者未感染乙型肝炎病毒。
18.在本发明的一些优选实施方式中，所述受试者样品包括血浆、血清、唾液、尿液、精液等体液。
19.根据本发明的第三方面，在本发明的一些实施方式中，所述定量检测标志物表达量的试剂包括基因水平检测的试剂。
20.在本发明的一些优选实施方式中，所述试剂包括但不仅限于通过pcr定量检测样本中标志物的核酸片段的含量，或通过酶联免疫分析、放射免疫分析、western印迹法、蛋白芯片法等定量检测样本中标志物的蛋白质的表达量。
21.本发明的第四方面，提供一种诊断、辅助诊断或预后检测乙型肝炎感染情况的试剂盒，该试剂盒中含有定量检测标志物表达量的试剂。
22.本发明中的试剂盒能够定量检测hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合，从而有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者，敏感度高，特异性强，对于乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者的早期筛查、诊断和监测预后复发具有极为重要的意义。
23.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的任意4种。
24.在本发明的一些更优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
25.根据本发明的第四方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂中含有扩增本发明第一个方面所述的标志物组合的引物。
26.在本发明的一些优选实施方式中，所述引物的核苷酸序列优选如seq id no.1～12所示。
27.根据本发明的第四方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中还含有pcr扩增试剂、酶和缓冲液。
28.当然，本领域技术人员也可以根据实际使用情况，合理加入其他助剂，以实现检测的目的。
29.本发明的第五方面，提供一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，用于执行乙型病毒性肝炎预后预测方法。
30.根据本发明的第五方面，在本发明的一些实施方式中，所述乙型病毒性肝炎预后预测方法为：
31.1)确定受试者样品中的标志物表达量；
32.2)根据受试者样品和正常人样品的表达量差异，预测受试者体内是否携带乙型肝炎病毒。
33.本发明中的计算机可读存储介质通过执行执行乙型病毒性肝炎预后预测方法指令，能够定量检测hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合，从而有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者，敏感度高，特异性强，对于乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者的早期筛查、诊断和监测预后复发具有极为重要的意义。
34.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的任意4种。
35.在本发明的一些更优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
36.本发明的第六方面，提供一种评价乙型肝炎病毒感染情况的系统，包括检测装置和比对装置。
37.根据本发明的第六方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测装置用于确定受试者样品中的标志物表达量；所述比对装置用于根据受试者样品和正常人样品的表达量差异，预测受试者体内是否携带乙型肝炎病毒。
38.本发明中的系统，能够根据hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合的定量结果进行分析，从而有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者，敏感度高，特异性强，对于乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者的早期筛查、诊断和监测预后复发具有极为重要的意义。
39.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的至少一种。
40.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的任意4种。
41.在本发明的一些更优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
42.本发明的第七方面，提供一种药物筛选方法，将候选药物给药乙型病毒性肝炎模型动物，检测给药前后动物样品中标志物的表达量差异；其中，若给药后标志物表达量与给药前表达量有显著差异，则是候选药物为目标药物的指示。
43.本发明中的药物筛选方法，是基于动物模型给药前后，体内或采集样品内的hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合的定量结果进行对比，从而有效判定待测药物的有效性，敏感度高，特异性强，对于目标靶向药物的筛选具有极为重要的意义。
44.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、
hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的至少一种。
45.在本发明的一些优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中的任意4种。
46.在本发明的一些更优选实施方式中，所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合。
47.本发明的有益效果是：
48.1.本发明首次发现了hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合作为乙型肝炎病毒感染诊断标志物的可行性，并发现可以根据其含量有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者人，从而对于乙型肝炎病毒携带情况的早期筛查诊断和监测预后复发提供了有效参考。
49.2.本发明中的检测试剂、试剂盒、检测系统等均利用hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合作为标志物，从而有效区分乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者，敏感度高，特异性强，对于乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者的早期筛查、诊断和监测预后复发具有极为重要的意义。
附图说明
50.图1是本发明实施例中的血浆mirna基因表达谱芯片聚类图，红色表示上调，绿色表示下调。
51.图2是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p在健康人(对照组)、携带者(实验组1)和乙肝患者(实验组2)样本中的相对表达量。
52.图3是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p在乙肝患者和健康正常人样本中的roc曲线图。
53.图4是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p在携带者和健康正常人样本中的roc曲线图。
54.图5是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p单个标志物的roc曲线图(chb vs asc)。
55.图6是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p两两联合的roc曲线图(chb vs asc)。
56.图7是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中三个联合的roc曲线图(chb vs asc)。
57.图8是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p中四个联合的roc曲线图(chb vs asc)。
58.图9是hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p和hsa-mir-29a-3p的组合的roc曲线图(chb vs asc)。
59.图10是本发明实施例中的评估系统，其中，核酸分离装置100，测序装置110，比对装置120。
具体实施方式
60.实施例1
61.1)中国汉族人群乙型肝炎病毒(hbv)临床病例资料信息采集
62.经医院伦理委员会同意，随机选取2016年1月～2017年12月期间在南方医科大学深圳医院乙型肝炎病毒(hbv)患者、携带者和健康者分别是100例作为研究对象，均为汉族人群。同时感染人类免疫缺陷病毒或丙型肝炎病毒(hcv)、自身免疫性肝炎、药物性损伤或酒精中毒的参与者被排除在外。诊断为肝硬化或肝癌的患者也被排除在外。
63.2)血浆中提取rna以及rna质量检测
64.使用trizol法从中提取rna，并用rnasey mini kit(qiagen)纯化。使用nanodrop nd-1000测量纯化后的rna浓度，电泳检测rna完整性。
65.3)制备荧光标记探针与芯片杂交
66.rna标记和杂交根据exiqon提供的方法进行。
67.将通过质检的rna，用mircury
tm array power labeling kit(cat#208032-a,exiqon)对mirna进行标记。具体步骤如下：a.1微克的rna加水至2μl，再加入1μl的cip缓冲液and cip酶(exiqon)，混合后于37℃静置30min。b.再置于95℃下5min终止反应，然后加入3μl的labeling缓冲液、1.5μl的fluorescent label(hy3
tm
)、2.0μl的dmso以及2.0μl的labeling enzyme，在16℃下反应1h。c.最后置于65℃下15min终止反应。
68.标记完成后，将样品与mircury tm lnaarray(v.19.0)(exiqon)芯片杂交，根据exiqon的实验方法进行。
69.a.25μl的样品与25μl的杂交缓冲液混合，95℃下变性2min，然后置于冰上2min。b.与芯片在56℃下杂交16-20h，杂交系统为nimblegen systems，inc.，madison，wi，usa。c.杂交完成后，使用wash缓冲液kit(exiqon)清洗芯片。
70.然后使用axon genepix 4000b芯片扫描仪扫描芯片。
71.扫描得到的血浆mirna基因表达谱芯片聚类图如图1所示。
72.其中，红色部分代表mirna表达上调，绿色部分表示mirna表达下调，asc为乙肝携带者组，chb为乙肝患者组，hc为健康对照组。
73.4)图像采集和数据分析
74.5)筛选差异表达mirna
75.初步选取出具有高表达相对量以及低表达相对量的mirna，然后再采用荧光定量pcr动态观察，观察乙型肝炎患者、携带者与对照组健康人群具有显著表达差异的mirna，绘制敏感标志物的变化曲线。确定具有差异表达的mirna：hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p。
76.其中，本实施例中的荧光定量pcr的具体步骤为：
77.(1)使用反转录试剂盒对乙型肝炎患者、携带者与对照组健康人群样品中获得的rna进行反转录。
78.反应体系如表1所示。
79.表1反转录体系
[0080][0081][0082]
反转录反应在pcr扩增仪上进行，反应程序为：16℃，30min；42℃，40min；85℃，5min。采用基于人探针(applied biosystems)的taq microrna分析方法，定量测定各样品中mirna的水平。可选择has-mir-93-5p taqmanvr mirna(applied biosystems)作为小rna表达的内源性控制分析。
[0083]
hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的mirna rt引物是如表2中r序列对应的rna序列。
[0084]
(2)将反转录得到的cdna作为模板，进行实时定量pcr，以定量其表达水平。
[0085]
具体步骤为：
[0086]
取步骤(1)中获得的所有的cdna，加入2
×
master mix 5μl，10μm的pcr特异引物f(表2中的gsp序列)，10μm的pcr特异引物r(表2中的r序列)，ddh2o补至8μl。在pcr仪中进行扩增。扩增程序为：95℃，10min；95℃，10s，60℃，60s，收集荧光信号，重复40个pcr循环。
[0087]
为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃，10s，60℃，60s，95℃，15s再次扩增，扩增完成后在从60℃升温95℃，收集信号，升温速度为0.075℃/秒。
[0088]
表2实时定量pcr引物序列
[0089][0090]
其中，gsp序列是对应mirna的特异引物序列，r序列是与rt引物相匹配的引物序列。
[0091]
hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的相对表达量如图2所示。
[0092]
在图2中，对照组为正常人，实验组1为携带者，实验组2为乙型肝炎患者。可以发现，对于hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的相对表达量，携带者和乙型肝炎患者相对于正常人均出现显著上调。其中，除hsa-let-7a-5p外，携带者的hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p相对表达量均低于乙型肝炎患者。
[0093]
此外，为了保证hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p对于乙型肝炎诊断的特异性。分别对比检测健康正常人与乙肝患者、携带者中的hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的roc曲线。
[0094]
结果如图3和4所示。
[0095]
由图3可以看出，对比健康正常人与乙肝患者的roc曲线，可以发现其auc均大于0.82，说明hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p对乙肝患者具有特异性。而从图4可以看出，对比健康正常人与携带者的roc曲线，可以发现其auc均大于0.83，说明hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p对携带者具有特异性。
[0096]
6)临床验证，动态监测。
[0097]
实施例2
[0098]
一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的试剂盒，该试剂盒中含有定量检测hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p表达量的试剂。
[0099]
实施例3
[0100]
一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的方法，包括以下步骤：
[0101]
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p；
[0102]
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
[0103]
实施例4
[0104]
一种计算机可读存储介质，存储有计算机可执行指令，用于执行前面所述乙型肝炎预后预测的方法：
[0105]
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物为hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的组合；
[0106]
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
[0107]
为了验证该计算机可读存储介质的实际检测效果以及hsa-let-7a-5p、hsa-mir-16-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7i-5p及hsa-mir-29a-3p的标志物组合的合理性。发明人随机抽取携带者以及乙型肝炎患者的血浆样品进行检测。其中，检测方法如本实施例所示。检测的标志物组合如表3所示。
[0108]
表3标志物组合信息
[0109]
组合编号hsa-let-7a-5phsa-mir-16-5phsa-let-7f-5phsa-let-7i-5phsa-mir-29a-3p1
○××××2×○×××3××○××4×××○×5××××○6○××○×7○○×××8×○××○9×××○○
10
××○○×
11
○××○○
12
○○○××
13
××○○○
14
○○○○×
15
○○○○○
[0110]
其中，
○
表示含有该mirna，而
×
则表示不含有该mirna。
[0111]
结果如图5～10所示。
[0112]
图5为1～5组中的单个mirna的roc曲线图，可以发现，实际上单个mirna对于乙肝患者(chb)或携带者(asc)的判定作用并不理想，其最高auc仅为0.724。图6为6～10组中两两组合后的标志物组合的roc曲线图，可以发现，除第6组中的auc可以达到0.816之外，其他各组均低于0.8，因此，也存在着判定效果不理想的问题。图7为11～13组中三个mirna组合后的标志物组合的roc曲线图，可以发现，除第11组外，其他各组auc均低于0.8，因此，也存在着判定效果不理想的问题。图8为14组中的四个mirna组合后的标志物组合的roc曲线图，其auc为0.819，具有一定的判定效果。而图9为五个mirna组合后的标志物组合的roc曲线图，其auc为0.845，具有较好的判定效果。
[0113]
因此，可以看出，五个mirna组合后的标志物组合对于乙型肝炎患者和携带者的判定效果最好。
[0114]
实施例5
[0115]
一种评价乙型肝炎的系统，包括检测装置和比对装置。图10是本发明用于评估系统的组成示意图。核酸分离装置100，用于从受试者分离核酸样本；检测装置110，用于确定受试者标志物的表达量；比对装置120，用于根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
[0116]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。