一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别是指一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法。


背景技术：

2.肿瘤是威胁人类健康的一种重要疾病，其中白血病是人体循环系统的肿瘤，近年来该疾病的发生呈显著增长态势，且呈现低龄化趋势。目前人们对白血病的治疗主要是化疗。虽然骨髓抑制被认为是治疗白血病和淋巴瘤的有效手段，但由于血液配型等异体抑制排斥作用的存在，严重限制了骨髓移植技术的广泛应用。化疗技术虽然能够显著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，但并不能彻底治愈疾病。大约50年前，人们最早从髓性白血病的发生和演变规律中提出了肿瘤干细胞概念，并认为这些肿瘤干细胞是正常干细胞和/或祖细胞通过突变形成的。正常造血干细胞能够持续分化成造血细胞，如红细胞、血小板、白细胞(包括t-淋巴细胞和b-淋巴细胞)、中性粒性细胞等。肿瘤干细胞也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血细胞系或未成熟的祖细胞。人们发现并验证肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展与恶化过程中的作用首先是从急性髓性白血病病人样品中分离出一种具有表面抗原cd96阳性的肿瘤细胞亚型2，这种肿瘤干细胞在肿瘤中的数目极少，但肿瘤的恶性程度很强，是肿瘤化疗耐药的重要原因之一，也是白血病化疗失败的重要根源。因此，寻找高效低毒、对肿瘤干细胞专一的肿瘤治疗方法和新的药物筛选模型是彻底治愈肿瘤疾患的主要技术瓶径。
3.从临床血液样品、骨髓或白血病细胞系中分离悬浮肿瘤干细胞仍然存在困难，主要原因是血液肿瘤干细胞数目极少。目前广泛采用的分离方法有两种：一种是通过标记肿瘤干细胞的特征表面抗原，采用流式细胞分选技术或免疫磁珠分选出富含肿瘤干细胞的组分。目前所使用的表面特征抗原主要有cd9、cd33、cd44、cd90、cd96、cd110、cd123等。由于采用单一表面抗原对肿瘤干细胞的区分能力具有局限性，用该法分选出的肿瘤干细胞数量少，分离过程中细胞受损伤以及干细胞的纯度不够高，是限制深入研究肿瘤干细胞的一个技术屏障。(2)研究肿瘤干细胞的另一种分选策略是通过细胞流式分选技术将血液肿瘤中的能排出荧光染料，如荧光染料hoechst33342的细胞称为侧群细胞。由于侧群细胞只是相对富集了肿瘤干细胞，通过研究肿瘤侧群细胞的性质并不能全面反映肿瘤干细胞的性质。


技术实现要素：

4.本发明提出一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，其方法步骤如下：
7.(4)在血液肿瘤细胞的胚胎干细胞培养基中加入delta-like4、jagged1和fgf2成分因子作为培养基主要组分；
8.(5)向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制gsk信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制
剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞形成集落；
9.(6)所述胚胎干细胞培养基的组成原料按体积比包括30-100％的dmem基础培养基、0-70％的胚胎干细胞培养基hescgro、0-2μg/ml的dii4、0-1μg/ml的fgf2、0-2μg/ml的jag1、0-1μg/ml的scf、0-1μg/ml的lif、0-1μg/ml的tgf-β、0-1μg/ml的tpo、0-300nm的chir99021、0-1μm的pd173074、0-1μm的pd184352和0-1μm的pd0325901。
10.作为优选，所述抑制gsk信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂为chir99021、pd173074、pd184352或pd0325901。
11.本发明的有益效果为：
12.通过在血液肿瘤干细胞的集落培养中，向胚胎干细胞培养基中加入delta-like4，jagged1和fgf2成分因子为培养基主要组分，并向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制gsk信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞可以形成集落，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为人急性t-淋巴母细胞瘤hut-102在含有本发明阐述的半固体琼脂培养基中接种培养过夜后形成hut-102干/祖细胞(hut-102s)集落的照片，细胞的放大倍数为100倍；
15.图2为人急性t-淋巴母细胞瘤hut-102和其干/祖细胞hut-102s悬浮培养传代的细胞形态，其中hut-102的培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基，hut-102s为本发明公开的干细胞培养基。细胞的放大倍数为100倍；
16.图3为人早幼粒白血病k562细胞在半固体干细胞培养基中的克隆生长，细胞的放大倍数为100倍；
17.图4为人急性t-淋巴母细胞瘤hut-102和其干/祖细胞hut-102s的相关干细胞抗原的表达。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1
20.t-淋巴瘤的肿瘤干/祖细胞集落培养、扩增
21.人t-淋巴细胞瘤株hut-102购自美国细胞库atcc(tib-162)，细胞培养使用含10％胎牛血清(paa，fcs500)的dmem培养基(北京钮因华信科技有限公司，dm10140021)，在coring公司生产的t-25细胞培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％co2。细胞每两天传代一次。血液肿瘤细胞的集落培养在corning公司的35mm培养皿中进行。培养皿的下层铺一层含
1％琼脂糖的dmem半固体培养基。另取新的血液肿瘤干细胞培养基配成0.3％的琼脂糖培养基1毫升，并在其中接种1000个hut-102细胞，混匀后轻轻铺在1％琼脂糖的上面。细胞在37℃，5％co2细胞培养箱中培养。第五日在显微镜下观察，可以看到有细胞集落的形成(见图1)。该方法较目前广泛使用的造血干细胞集落培养方法更有效更快速。目前通常使用的方法培养血液细胞祖细胞通常需要2周以上。
22.上述新的血液肿瘤干细胞培养基配方如下：30％的dmem基础培养基、70％的胚胎干细胞培养基hescgro、2μg/ml的dii4、1μg/ml的fgf2、2μg/ml的jag1、1μg/ml的scf、1μg/ml的lif、1μg/ml的tgf-β、1μg/ml的tpo、300nm的chir99021、1μm的pd173074、1μm的pd184352和1μm的pd0325901。
23.人胚胎干细胞无血清培养基hescgro embryonic stem cell medium(上海前尘生物科技有限公司)。
24.将hut-102单集落挑出到细胞培养瓶中，在血液肿瘤干细胞培养基中(37℃，5％co2)悬浮培养。肿瘤干细胞可以大量扩增。图2显示与野生型hut-102相比，干细胞形状规则，呈圆形，细胞比野生型稍大。
25.实施例2
26.早幼粒白血病k562细胞株的细胞干/祖细胞集落培养、扩增
27.人早幼粒白血病k562细胞株购自美国细胞库atcc，细胞培养使用含10％胎牛血清(paa，fcs500)的dmem培养基(北京钮因华信科技有限公司，dm10140021)，在coring公司生产的t-25细胞培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％co2。细胞每3天传代一次。血液肿瘤细胞的集落培养在corning公司的35mm培养皿中进行。培养皿的下层铺一层含1％琼脂糖的dmem半固体培养基。另取新的血液肿瘤干细胞培养基配成0.3％的琼脂糖培养基1毫升，并在其中接种1000个k562细胞，混匀后轻轻铺在1％琼脂糖的上面。细胞在37℃，5％co2细胞培养箱中培养。第五日在显微镜下观察，可以看到有细胞集落的形成(见图3)。将上述克隆挑出，转移到本发明公开的干细胞培养基中扩增培养，获得具有干细胞特性的早幼粒白血病细胞亚群。本发明为研究k562干细胞的行为特征提供了研究素材的保证，因为用传统的分离方法很难获得大量的k562干细胞。
28.上述新的血液肿瘤干细胞培养基配方如下：20％的dmem基础培养基、80％的胚胎干细胞培养基hescgro、1μg/ml的dii4、0.5μg/ml的fgf2、1μg/ml的jag1、0.5μg/ml的scf、0.5μg/ml的lif、0.5μg/ml的tgf-β、0.5μg/ml的tpo、150nm的chir99021、0.5μm的pd173074、0.5μm的pd184352和0.5μm的pd0325901。
29.实施例3
30.淋巴瘤干细胞的分子表面标志物的细胞流式分选
31.在表征、分选血液肿瘤干细胞时，特征的表面抗原标志物是被广泛使用的一种方法，其中表面抗原cd34和cd44是使用比较广泛的两个标志物3。t-淋巴细胞瘤hut-102是造血干细胞分化过程中基因突变缺陷形成的血液肿瘤细胞，hut-102s干细胞应该具备造血干细胞的一些特征。图4给出了用荧光标记的单克隆抗体通过细胞流式分选仪检测hut-102s和hut-102细胞中在cd34和cd44表达阳性的细胞比例。所使用的单克隆抗体为bd bioscience公司的产品(cd34cat：550618；cd44cat：555478)，进行细胞分选的流式细胞分选仪为bd公司facscalibur。从图中可以看到在hut-1-2s中cd34表面抗原阳性的细胞占
74.2％，cd44表面抗原阳性的细胞占90.8％，而在hut-102野生型肿瘤细胞中cd34表面抗原阳性的细胞仅占2.24％，cd44表面抗原阳性的细胞仅占4.84％。cd34和cd44同时高表达是已经鉴定的慢粒性白血病cml中肿瘤干细胞的表面特征，但在已经鉴定的急性淋巴母细胞瘤的祖细胞中仅有cd34的阳性表达，而无cd44的阳性表达。造血干细胞特征表面抗原cd34和cd44表达的显著增强进一步验证了本发明所提供的方法和培养基筛选出的细胞比野生型血液肿瘤细胞更具有干细胞的特征，是hut-102血液肿瘤细胞的一种新干细胞亚型，也是t-all白血病的一种新的肿瘤干细胞。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。