DNA甲基化修饰的检测方法

dna甲基化修饰的检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种dna甲基化修饰的检测方法。


背景技术：

2.表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，通过dna甲基化和组蛋白修饰等调控基因表达的一门遗传学分支学科。它不仅对基因表达、调控、遗传有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中具有重要意义。dna甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生中起着重要作用，是目前研究热点之一。dna甲基化是在dna甲基转移酶催化作用下，利用s-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在cpg二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。在哺乳动物基因组的某些区域，cpg密度很高，形成所谓的cpg岛。它通常位于基因的启动子区或第一外显子区。dna甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。
3.传统的dna甲基化修饰的检测方法包括李海飞、李洪义在“dna甲基化的分析与状态检测”中汇总的sssi甲基转移酶法、氯乙醛反应法、免疫学法、限制酶pcr、甲基化特异性pcr(msp)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(mssnupe)、结合亚硫酸盐限制性分析法(cobra)、dhplc、methylight、微阵列法。传统的dna甲基化修饰的检测方法相对复杂。利用抗甲基化胞嘧啶的抗体对细胞甲基化进行免疫染色，可以对部分甲基化胞嘧啶实现可视化，但不能对未甲基化的cpg所在区域进行染色，无法获得未甲基化与甲基化的相对比例关系。因此，如何采用简单的方法实现dna甲基化修饰水平的检测是需要解决的技术问题。


技术实现要素：

4.基于上述技术问题，本发明的主要目的在于提供一种操作简单的dna甲基化修饰的检测方法。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种dna甲基化修饰的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
7.对待测样本的dna进行酶切；
8.酶切后的待测样本在可视化标签反应液中发生可视化标签反应，在酶切末端添加荧光标记；
9.对可视化的所述荧光标记的信号进行检测；
10.其中，
11.酶切采用甲基化限制性内切酶，所述甲基化限制性内切酶选自甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶中的一种或者多种；
12.所述可视化标签反应液包含：荧光标记的dntp和荧光标记的ddntp中的一种或者多种，以及，dna连接酶和dna聚合酶中的一种或者多种。
13.在其中一些实施例中，所述甲基化敏感性限制性内切酶选自acii、hpaii、hinp1i、
hpychiv和clai中的一种或者多种。
14.在其中一些实施例中，所述甲基化依赖性限制性内切酶选自abasi、fspei、lpnpi、和mspji中的一种或者多种。
15.在其中一些实施例中，所述dna聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。
16.在其中一些实施例中，荧光标记采用间接显色的显色剂。
17.在其中一些实施例中，所述间接显色的显色剂为生物素。
18.在其中一些实施例中，荧光标记采用直接显色的显色剂。
19.在其中一些实施例中，所述直接显色的显色剂为荧光素。
20.在其中一些实施例中，所述荧光素选自tmr red和fluorescein中的一种或者几种。
21.在其中一些实施例中，所述检测方法还包括：酶切之前，还对所述待测样本进行固定和透化。
22.在其中一些实施例中，固定采用的固定液为含多聚甲醛的pbs缓冲液。
23.在其中一些实施例中，透化采用的透化液为含triton x-100的柠檬酸钠溶液。
24.相对于传统技术，本发明具有以下技术效果：
25.本发明巧妙地将甲基化限制性内切酶和dna聚合酶/dna连接酶结合应用于dna甲基化修饰的检测中，先通过甲基化限制性内切酶在样本dna中引入切口，再利用dna聚合酶/dna连接酶在该切口处加入荧光标记的核苷酸，从而实现对样本dna的c位点是否甲基化分别进行不同颜色标记的可视化，然后便可以通过检测待测样本的不同荧光的相对强度和不同荧光颜色的空间分布，达到可视化地判断cpg位点整体非甲基化与甲基化修饰的相对水平。该检测方法，适用于细胞、组织切片、染色体标本等甲基化水平检测，相对于传统方法省去了从细胞、组织中提取dna的步骤，操作简单，易于掌握，安全性高，对设备要求低，检测周期短，另外由于可以分别对低甲基化与高甲基化进行不同颜色的染色，因而可以提供低甲基化与高甲基化进行一定的空间信息定位。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为实施例1中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
28.图2为实施例1中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
29.图3为实施例2中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
30.图4为实施例2中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
31.图5为实施例3中放大200倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性
内切酶clai和甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
32.图6为实施例3中放大400倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性内切酶clai和甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
33.图7为实施例4中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人外周血染色体结果图；
34.图8为实施例4中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人外周血染色体结果图；
35.图9为实施例5中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人外周血染色体结果图；
36.图10为实施例5中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人外周血染色体结果图；
37.图11为实施例6中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人胃癌切片结果图；
38.图12为实施例6中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人胃癌切片结果图。
具体实施方式
39.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
40.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
41.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
42.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
43.本文中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
44.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
45.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
46.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固相-液相混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
47.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成
分在添加该成分后的体系中的占比。
48.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
49.本发明提供一种dna甲基化修饰的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
50.对待测样本的dna进行酶切；
51.酶切后的待测样本在可视化标签反应液中发生可视化标签反应，在酶切末端添加荧光标记；
52.对可视化的所述荧光标记的信号进行检测；
53.其中，
54.酶切采用甲基化限制性内切酶，所述甲基化限制性内切酶选自甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶中的一种或者多种；
55.所述可视化标签反应液包含：荧光标记的dntp和荧光标记的ddntp中的一种或者多种，以及，dna连接酶和dna聚合酶中的一种或者多种。
56.本发明提供的检测方法，对待测样本的种类不做特别限定，可以是细胞样本，也可以是组织样本(例如组织切片)。
57.本发明提供的检测方法，巧妙地将甲基化限制性内切酶和dna聚合酶/dna连接酶结合应用于dna甲基化修饰的检测中，先通过甲基化限制性内切酶在样本dna中引入切口，再利用dna聚合酶/dna连接酶在该切口处加入荧光标记的核苷酸，从而实现对样本dna的c位点是否甲基化分别进行不同颜色标记的可视化，然后便可以通过检测待测样本的相对荧光红绿黄不同荧光的相对强度和不同荧光颜色的空间分布，达到可视化地判断cpg位点整体非甲基化与甲基化修饰的相对水平。该检测方法，适用于细胞、组织切片等甲基化水平检测，相对于传统方法省去了从细胞、组织中提取dna的步骤，操作简单，易于掌握，安全性高，对设备要求低，检测周期短。
58.本发明提供的检测方法，可以分别对低甲基化与高甲基化进行不同颜色的染色，因而可以提供低甲基化与高甲基化进行一定的空间信息定位。也可用于多个样本的比较，例如设置对照样本，比较待测样本和对照样本的甲基化水平的高低。在用于多个样本甲基化水平的研究时，对对照样本的种类不做特别限定，在本发明的技术构思的基础上，可以根据检测需求确定对照样本的种类。例如：将本发明的检测方法应用于dna甲基化修饰水平对肿瘤细胞特性的技术研究，那么对照样本可以选用肿瘤细胞对应的正常细胞、该肿瘤细胞对应的其他生长阶段细胞、不同于该肿瘤细胞的其他种类的肿瘤细胞。
59.在其中一个示例中，所述甲基化敏感性限制性内切酶选自acii、hpaii、hinp1i、hpychiv和clai中的一种或者多种。
60.在其中一个示例中，所述甲基化依赖性限制性内切酶选自abasi、fspei、lpnpi和mspji中的一种或者多种。
61.在其中一个示例中，所述dna聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。
62.在其中一个示例中，所述甲基化限制性内切酶为甲基化敏感性限制性内切酶，所述甲基化敏感性限制性内切酶为clai，所述dna聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。
63.在其中一个示例中，所述甲基化限制性内切酶为甲基化依赖性限制性内切酶，所述甲基化依赖性限制性内切酶为abasi，所述dna聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。
64.在其中一个示例中，荧光标记采用间接显色的显色剂。
65.在其中一个示例中，所述间接显色的显色剂为生物素。
66.在其中一个示例中，荧光标记采用直接显色的显色剂。
67.在其中一个示例中，所述直接显色的显色剂为荧光素。本发明选用的荧光素包括不限于如下种类中的一种或者多种：tmr red、fluorescein。
68.在其中一个示例中，所述检测方法还包括：酶切之前，对所述待测样本和所述对照样本进行固定和透化。
69.在其中一个示例中，固定采用的固定液为含多聚甲醛的pbs缓冲液。
70.在其中一个示例中，透化采用透化液为含triton x-100的柠檬酸钠溶液。
71.本发明的提供的上述检测方法，所述甲基化限制性内切酶在选用甲基化敏感性限制性内切酶或者甲基化依赖性限制性内切酶均能实现dna甲基化修饰的检测，当然，同时选用甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶也是可行的。
72.在其中一个示例中，基于本发明提供的整体技术构思，同时选用甲基化敏感性限制性内切酶和甲基化依赖性限制性内切酶的条件下，在基于其中一种甲基化限制性内切酶进行酶切并在切口处引入荧光标记之后，再采用另一种甲基化限制性内切酶对上一轮酶切、荧光标记的产物进行第二轮的酶切和荧光染色以实现在本轮酶切切口引入荧光标记，当然，在两轮酶切对应产生的切口引入的荧光标记是不同的。在采用两种甲基化限制性内切酶进行酶切并进行不同荧光染色时，能通过荧光检测设备检测到不同比例甲基化片段和未甲基化片段的显色形态和定量情况，还有两种颜色混合形成的中间色的显色形态和定量情况，由于不同状态细胞的dna甲基化水平差异很大，通过比对显色的变化情况能对细胞的甲基化状态进行一定的定性与定量快速分析，在生物医学等多个领域具有实用价值。
73.下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
74.下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
75.实施例1.单独使用甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人结肠癌细胞hct-116
76.实验步骤：
77.1.用新鲜制备的4％多聚甲醛固定液(含4％多聚甲醛的pbs缓冲液，ph 7.4)在15至25℃下固定、风干细胞样品1小时。
78.2.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
79.3.在冰上(2至8℃)于透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
80.4.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
81.5.采用150u/ml clai酶溶液孵育经固定和透化的hct-116细胞30分钟。
82.6.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
83.7.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl红色荧光探针荧光素tmr red标记的dutp溶液)，每孔加50μl盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育固定和透化的hct-116细胞60分钟。
84.8.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
85.9.细胞在250μl pbs缓冲液中，通过共聚焦显微镜进行分析。对于荧光显微镜评
估，使用520-560nm(最大540nm；绿色)范围内的激发波长和570-620nm(最大580nm，红色)范围内的检测。图1.放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
86.图2.放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人结肠癌细胞hct-116结果图。
87.实施例2.单独使用甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116
88.实验步骤：
89.1.用新鲜制备的4％多聚甲醛固定液(4％多聚甲醛的pbs缓冲液，ph7.4)在15至25℃下固定风干细胞样品1小时。
90.2.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
91.3.在冰上(2至8℃)于透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
92.4.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
93.5.采用150u/ml abasi酶溶液孵育经固定和透化的hct-116细胞30分钟。
94.6.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
95.7.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl绿色荧光探针荧光素fluorescein标记的dutp溶液)，每孔加50μl/孔盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育经固定和透化的hct-116细胞60分钟。
96.8.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
97.9.细胞在250μl pbs缓冲液中，通过共聚焦显微镜进行分析。对于荧光显微镜评估，使用450-500nm(如488nm)范围内的激发波长和515-565nm(绿色)范围内的检测。
98.图3.放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
99.图4.放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图。
100.实施例3.先后分别使用甲基化敏感性限制性内切酶clai和甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116
101.实验步骤：
102.1.用新鲜制备的4％多聚甲醛固定液(4％多聚甲醛的pbs缓冲液，ph7.4)在15至25℃下固定、风干细胞样品1小时。
103.2.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
104.3.在冰上(2至8℃)在透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
105.4.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
106.5.采用150u/ml clai酶溶液孵育经固定和透化的hct-116细胞30分钟。
107.6.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
108.7.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl红色荧光探针荧光素tmr red标记的dutp溶液)。每孔加50μl，盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育经固定和透化的hct-116细胞60分钟。
109.8.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
110.9.采用150u/ml abasi酶溶液孵育经固定和透化的hct-116细胞30分钟。
111.10.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤细胞两次。
112.11.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl绿色荧光探针荧光素fluorescein标记的dutp溶液)。每孔加50μl，盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育经固定和透化的hct-116细胞60分钟。
113.12.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
114.13.用50μl/孔的dapi染色液染细胞核10分钟(方便共聚焦显微镜拍摄红绿两种荧光时进行细胞定位)。
115.11.细胞在250μl pbs缓冲液中，通过共聚焦显微镜进行分析分别进行红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光的检测。
116.图5.放大200倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性内切酶clai和甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图；
117.图6.放大400倍共聚焦显微镜拍摄先后分别使用甲基化敏感性限制性内切酶clai和甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人结肠癌细胞hct-116结果图。
118.实施例4.单独使用甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人外周血染色体实验步骤：
119.1.取人外周血淋巴细胞，加入植物血凝素(pha)刺激其转化为淋巴母细胞，接种后37℃恒温培养箱中72小时。
120.2.加入10μg/ml秋水仙素2-8滴(1mg秋水仙素加入100ml 0.85％生理盐水)，37℃恒温培养箱中1.5小时。
121.3.去上清液加0.075m kcl溶液低渗后，放入37℃恒温培养箱中30分钟。
122.4.加入1ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)混匀进行预固定，离心(2000转，10分钟)，弃上清；加入6-8ml固定液混匀进行固定，离心弃上清；重复2次，留0.5ml细胞悬液。
123.5.冰玻片快速滴片，置75℃烤片3小时，室温下放置冷却。
124.6.胰酶显带15-55s，生理盐水漂洗，吉姆萨染色5分钟。
125.7.用新鲜制备的人外周血染色体玻片标本(4％多聚甲醛的pbs，ph 7.4)在15至25℃下固定风干样品1小时。
126.8.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
127.9.在冰上(2至8℃)在透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
128.10.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
129.11.采用150u/ml clai酶溶液孵育固定和透化的染色体标本。
130.12.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
131.13.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl红色荧光探针荧光素tmr red标记的dutp溶液)，每片用50μl，盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育固定和透化的染色体标本60分钟。
132.14.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
133.15.通过共聚焦显微镜进行分析。对于共聚焦显微镜评估，使用520-560nm(最大
540nm；绿色)范围内的激发波长和570-620nm(最大580nm，红色)范围内的检测。
134.图7.放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人外周血染色体结果图。
135.图8.放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人外周血染色体结果图。
136.实施例5.单独使用甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人外周血染色体实验步骤：
137.1.取人外周血淋巴细胞，加入植物血凝素(pha)刺激其转化为淋巴母细胞，接种后37℃恒温培养箱中72小时。
138.2.加入10μg/ml秋水仙素2-8滴(1mg秋水仙素加入100ml 0.85％生理盐水)，37℃恒温培养箱中1.5小时。
139.3.去上清液加0.075m kcl溶液低渗后，放入37℃恒温培养箱中30分钟。
140.4.加入1ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)混匀进行预固定，离心(2000转，10分钟)，弃上清；加入6-8ml固定液混匀进行固定，离心弃上清；重复2次，留0.5ml细胞悬液。
141.5.冰玻片快速滴片，置75℃烤片3小时，室温下放置冷却。
142.6.胰酶显带15-55s，生理盐水漂洗，吉姆萨染色5分钟。
143.7.用新鲜制备的人外周血染色体玻片标本(4％多聚甲醛的pbs，ph 7.4)在15至25℃下固定风干样品1小时。
144.8.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
145.9.在冰上(2至8℃)在透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
146.10.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
147.11.采用150u/ml abasi酶溶液孵育固定和透化的染色体标本。
148.12.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
149.13.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl绿色荧光探针荧光素fluorescein标记的dutp溶液)，每片用50μl，盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育固定和透化的染色体标本60分钟。
150.14.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
151.15.通过共聚焦显微镜进行分析。对于共聚焦显微镜评估，使用450-500nm(如488nm)范围内的激发波长和515-565nm(绿色)范围内的检测。
152.图9为实施例5中放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人外周血染色体结果图；
153.图10为实施例5中放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化依赖性限制性内切酶abasi染色人外周血染色体结果图。
154.实施6单独使用甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人胃癌切片
155.实验步骤：
156.1用新鲜制备的人胃癌玻片标本(4％多聚甲醛的pbs，ph 7.4)在15至25℃下固定风干样品1小时。
157.2.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
158.3.在冰上(2至8℃)在透化溶液(0.1％triton x-100的0.1％柠檬酸钠溶液，新鲜制备)中孵育2分钟。
159.4.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤样品两次。
160.5.采用150u/ml clai酶溶液孵育固定和透化的切片标本。
161.6.用pbs缓冲液(200μl/孔)洗涤切片两次。
162.7.新鲜配置染色混合液(50μl tdt酶溶液混合450μl红色荧光探针荧光素tmr red标记的dutp溶液)，每片用50μl，盖上盖子在37℃的潮湿环境中避光孵育固定和透化的切片标本60分钟。
163.9.在pbs缓冲液中清洗样品两次。
164.10.通过共聚焦显微镜进行分析。对于共聚焦显微镜评估，使用520-560nm(最大540nm；绿色)范围内的激发波长和570-620nm(最大580nm，红色)范围内的检测。
165.图11.放大200倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人胃癌切片结果图。
166.图12.放大400倍共聚焦显微镜拍摄甲基化敏感性限制性内切酶clai染色人胃癌切片结果图。
167.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。