一种基于DNA条形码准确鉴定香花油茶的方法与流程

一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法
技术领域
1.本发明涉及生物鉴定技术领域，尤其是涉及一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法。


背景技术：

2.花油茶(camellia osmantha ye cx,ma jl et ye h.)是2012年在广西南宁发现的一种山茶属短柱茶组新种，不仅早熟、果量多、出籽率高，而且属性美观、花带香气，也称为香花油茶。目前，经过几年的研究和积累，已选育出大量香花油茶的优良单株、无性系和家系。
3.但是，由于香花油茶的遗传背景较为复杂，目前为止，一直没有有效的分子遗传鉴定系统对香花油茶进行遗传进化分析，使香花油茶分子水平上的研究受到极大限制。为了更大范围地推广香花油茶，目前甚至未来更长时间，需要更加深入了解香花油茶的遗传机理。
4.dna条形码技术(dna barcoding)是利用标准、有足够变异、易扩增且相对较短的dna片段(dna barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。
5.在植物中，谱系偏选和杂交现象非常普遍，而山茶属种类繁多，油茶的遗传结构和系统演化关系更为复杂，增加了筛选dna条形码的难度，这样就更需要从不同的基因组中选择基因来保证鉴定的准确度。
6.植物叶绿体基因组(cpdna)为单亲遗传，其dna片段容易扩增和测序。叶绿体基因matk、rbcl、trnh-psba、ycf1等具有进化速率快、大小片段适中、种间差异度高且碱基转换/颠换数低、序列信息数据庞大，引物通用性好、序列扩增率高等特点，因此被广泛用来进行dna条形码分析，在药用植物、木兰科等植物中已成功应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，达到物种自动鉴定的目的。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法，步骤如下：
9.s1、提取待测物种的全基因组dna；
10.s2、利用dna条形码引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
11.s3、电泳检测pcr产物，如果没有目标条带，则判定待测物种不是香花油茶，如果有目标条带，则进行下一步；
12.s4、对所得pcr产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与dna条形码的核苷酸序列进行同源性比对，鉴别香花油茶物种，并进行系统发育树分析。
13.优选的，dna条形码引物包括matk引物、rbcl引物或trnh-psba引物中的一种或多
种。
14.优选的，matk的扩增引物为：
15.正向引物(seq id no.1)：5
’‑
tccatgggtttatatggatccttcctggtt-3’；
16.反向引物(seq id no.2)：5
’‑
cccgccatggatggaagaattcaaaagata-3’；
17.优选的，rbcl的扩增引物为：
18.正向引物(seq id no.3)：5
’‑
atgtcaccacaaacagagactaaagc-3’19.反向引物(seq id no.4)：5
’‑
gtaaaatcaagtccaccrcg-3’20.优选的，trnh-psba的扩增引物为：
21.正向引物(seq id no.5)：5
’‑
cgcgcatggtggattcacaatcc-3’22.反向引物(seq id no.6)：5
’‑
gttatgcatgaacgtaatgctc-3’。
23.优选的，步骤s2中pcr扩增体系为：10μl 2
×
pcr扩增体系混合液，10μm引物对，30ng的dna模板，反应体系终体积20μl；
24.pcr反应条件为94℃反应3min；然后94℃变性35s，55℃退火30s，72℃延展1min，如此35个循环；最后72℃延展7min。
25.一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的试剂盒，所述试剂盒中含有matk引物、rbcl引物或trnh-psba引物中的一种或多种引物对。
26.因此，本发明采用上述一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，达到物种自动鉴定的目的。
27.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
28.图1是不同引物对pcr扩增琼脂糖凝胶电泳检测图；
29.图2是样品部分目标序列比对结果图；
30.图3是基于单序列的系统进化树分析图；
31.图4是基于组合序列的系统进化树分析图。
具体实施方式
32.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
33.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
34.试验测试
35.(1)材料与方法
36.供试材料为12株香花油茶无性系，编号分别为1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1717、1718、1719、、f1、g-8，均种植于广西南宁老虎岭。
37.dna提取：取干燥叶片约1g，液氮研磨5min，使用植物基因组dna提取试剂盒hp plant dnakit(omegabio-tec.)提取总dna。dna质量利用琼脂糖凝胶电泳检测，利用nanodrop 2000检测所提浓度，最后在-20℃冰箱冷冻保存。
38.(2)pcr体系的建立
39.pcr扩增体系为：2μl 10
×
pcr buffer，mg
2+
1.2μl，dntps 0.4μl，10μm正向引物1μ
l，10μm反向引物1μl，taq聚合酶0.2μl，dna模板1μl，加h2o至总体积为20μl。
40.pcr反应程序：94℃反应3min；然后94℃变性35s，引物对退火温度55℃退火30s，72℃延展1min，35个循环；最后72℃延展7min。
41.(3)dna测序和序列分析
42.pcr扩增产物经1％琼脂糖电泳检测，根据大小确定目的带、无杂带干扰且产物的浓度达到测序要求后，将pcr扩增产物送至上海生工进行测序，测序引物与pcr引物相同。
43.提取的香花油茶总dna浓度在47.5ng/μl
–
206.8ng/μl之间，其a260/a280比值均在1.8-2.0之间；琼脂糖凝胶电泳检测，所有样品dna条带均为单一条带，可用于后续pcr扩增实验分析。
44.如图1，分别以matk、rbcl、trnh-psba引物对对样品进行dna扩增，a、b、c分别表示matk、rbcl、trnh-psba，结果显示，matk、rbcl、trnh-psba引物扩增出来的条带均为单一性条带。
45.(4)序列分析
46.对所获得的测序片段进行比对分析，获得相应dna条形码序列。利用megax软件进行kimura2步法的参数估计，获得遗传进化树，分析和鉴定种质。
47.供试样品的matk、rbcl、trnh-psba序列比对结果如图2所示，a、b、c分别代表样品matk部分序列比对结果、样品rbcl部分序列比对结果、样品trnh-psba部分序列比对结果，对测序结果进行分析，以matk、rbcl、trnh-psba引物对扩增的序列提交至ncbi进行序列比对，所有样品序列与genebank数据库中的油茶(camellia oleifera)(accession:mf541730.2)的相似度均在99％以上，可以证明所扩增的序列片段为油茶叶绿体上的基因片段。
48.(5)不同目标片段的遗传距离和系统发育树分析
49.基于k-2p模型，bootstrap检验重复值为1000，使用mega-x软件构建nj(neighbor-joining)系统发育树。图3中，a、b、c分别代表matk序列的系统发育树、rbcl序列的系统发育树、trnh-psba序列的系统发育树，结果显示，三个序列片段都将样品分成了两大组，但不同样品的分组情况有些差异。matk序列将样品g-8、1711、f1、1719、1718、1717、1713和1712聚为一支，样品1710、1709、1714和1715聚为一支。rbcl序列将样品分为两组样品1714单独聚为一支，其余样品聚为一支。trnh-psba序列也将样品1714单独为一支，其余样品聚为一支，然后，组内又分为三个亚组，第一组包含样品1715、f1、1713、1710和1712，第二组包含样品1717、1718、1719和1711，另外一组包含1709和g-8。
50.对matk、rbcl和trnh-psba序列分析中发现，三个序列都将样品分成了两大组，与其叶片特征和生长形态跟其它样品差异很大的结果吻合。
51.将所得的单一片段组合之后，通过megax软件进行序列比对分析，结果发现，组合序列分析能够更加直观地将差异样品从供试样品中区分出来。图4中，a、b、c分别代表matk_rbcl序列的系统发育树、rbcl_trnh-psba序列的系统发育树、matk_rbcl_trnh-psba序列的系统发育树。matk+rbcl组合序列分析中，将样品1709、1710、1714和1715聚为一类，但是样品1714与组内其他样品差异还是很明显。rbcl+trnh-psba组合序列分析中，样品1714单独聚为一组，其余样品为一组，其中，f1、1712、1715、1713和1710遗传距离更近。matk+rbcl+trnh-psba组合序列将1709、1710、1714和1715分成了一组，其中，1709和1714分为单独各为
一个亚组，1715和1710为另外一个亚组；其余样品分为了另外一组，其中，1717、1711、1718、1719和g-8为一个亚组，f1、1713和1712为另外一个亚组。
52.因此，本发明采用上述一种基于dna条形码准确鉴定香花油茶的方法，通过条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码，逐级缩小范围，达到物种自动鉴定的目的。
53.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。