与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的MUC22基因突变位点及其应用

与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的muc22基因突变位点及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及位点rs1385372181在检测抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏症(antithyroid drug-induced agranulocytosis，tia)易感性中的应用。


背景技术：

2.甲状腺机能亢进症(hyperthyroidism)是一组以甲状腺激素异常分泌增多为特征的器官特异性自身免疫性疾病。graves病(gd)是引起甲状腺机能亢进症(简称甲亢)的最常见原因，约占甲亢总人数的80％～85％。graves病的主要临床表现为高代谢症候群、眼球突出、胫前粘液性水肿等，可累及全身多个系统。目前针对graves病的治疗方法主要有三种：抗甲状腺药物(antithyroid drug,atd)、放射碘治疗131i及手术治疗。抗甲状腺药物主要通过抑制体内过氧化物酶系统、阻断碘的活化，从而减少甲状腺激素的合成，是目前治疗graves病的首选方案。atd包括甲巯咪唑(methimazole,mmi)和丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,ptu)，其中甲巯咪唑是临床主要应用药物。
3.atd治疗甲亢的疗效肯定，但用药过程中会出现包括皮肤瘙痒或者皮疹、关节肌肉疼痛和发热在内的副作用，其发生率约为5％。患者大多症状轻微，对症处理或停药后一般很快就缓解。而严重的不良反应包括药物性肝损害、中性粒细胞胞质抗体阳性的血管炎、粒细胞缺乏(简称粒缺)，发生率约为0.1％～0.5％。粒细胞缺乏症是服用atd后最严重的不良反应之一，通常是指外周血中性粒细胞的绝对值低于0.5
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109/l。虽然tia的发病在接受atd治疗的患者中只占0.1％～0.3％，但通常病情进展迅速，极易并发消化系统、呼吸系统、泌尿系统等多系统的感染，严重的患者还会继发脓毒血症或败血症，甚至诱发甲状腺危象，因而tia的病死率较高。目前，临床上仍缺乏对atd所致粒细胞缺乏症发病的预测及预防机制，导致其延迟诊治的情况非常普遍，而延迟诊治会延长粒细胞缺乏症的恢复时间，甚至增加死亡风险。
4.近年来国内外学者对tia的发病机制进行了大量的研究，涉及到遗传易感性、免疫抑制、药物对骨髓毒性作用以及过敏因素等，虽然tia的发病机制目前尚不明确，但免疫遗传因素与之密切相关的观点已得到了共识，即认为atd作为一种半抗原，与体内特异蛋白结合刺激机体产生抗体，该抗体可与白细胞表面的抗原特异性结合，产生自身免疫破坏，从而导致粒细胞破坏。
5.人类主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex,mhc)系统是目前已知的人类染色体中结构最为复杂的区域，具有丰富的遗传多态性和高度的连锁不平衡。mhc区域位于6号染色体短臂6p21.31内，由一群密切连锁的基因组成，这些基因与多种药物不良反应的遗传易感相关。例如日本学者tamai等研究发现人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,hla)hla-drb1＊08032等位基因与mmi导致粒细胞减少症之间存在明显的相关性；学者chen等人报道了当地人群抗甲状腺药物所致粒细胞缺乏症的相关易感基因hla-b＊38:02和hla-drb1＊08:03。这些结果均证实mhc区域基因及相关位点与抗甲状腺
药物所致粒细胞缺乏症的发生之间存在相关性，而且在不同地区及种族，与抗甲状腺药物所致粒细胞缺乏症相关的基因位点存在差异。但这些研究仅是通过对已知与免疫反应有关的基因进行筛选研究得出的结论，还不能以此预测tia的易患人群。tia通常出现于用药后的2～3个月内，个别病例在用药的后期发生，也可见于全程中的任何时间，各研究中心的临床数据也提示由于部分tia突然起病，即使进行了规律的血常规监测并不能早期发现所有的患者，因而亟待寻找用于有效预测tia发生的临床生物标记，从而实现tia易感人群的检测。
6.随后基因组的计划不断向前发展，tia相关的药物基因组学研究快速发展，而且不断有研究报道新的候选基因。从目前的研究来看，尽管tia的易感基因多位于6号染色体的mhc区域，但针对mhc区域的深度测序和基因分型尚未能发现可用于tia的早期诊断、基因治疗靶点定位的有效依据。
7.定位于人染色体6p21.33位置的muc22基因编码一种跨膜粘蛋白，目前尚未见到muc22基因突变与tia相关的报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的muc22基因突变位点及其应用。
9.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
10.一种检测人muc22基因indel位点rs1385372181多态性的方法，包括以下步骤：
11.1)利用特异性核酸引物扩增个体离体样本中包含有muc22基因indel位点rs1385372181的dna片段，得扩增产物；所述特异性核酸引物的序列如seq.id.no.2和seq.id.no.3所示(根据rs1385372181设计的上游引物和下游引物)；
12.2)将扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测或进行测序，根据电泳检测或测序结果确定个体muc22基因indel位点rs1385372181的基因型。
13.优选的，所述步骤1中，离体样本选自体液(例如血液、腹水、尿液)、组织细胞(例如肝组织、皮肤组织，肌肉组织)或毛发等。通过提取和纯化这些样本可制备个体的基因组dna，从而以来源于人的基因组dna为模板，利用上述特异性核酸引物并通过pcr反应获得上述扩增产物。
14.优选的，所述步骤1中，扩增条件包括：95℃5～10min；94℃0.5min，60℃0.75min，72℃1min，30个循环；72℃5min。
15.优选的，所述步骤1中，pcr反应体系包括1～2μl模板dna以及10μm上、下游引物各2μl。
16.优选的，所述步骤1中，dna片段的参考序列如seq.id.no.1所示，在该核苷酸序列的第95位之后存在一个16bp插入/缺失多态性位点(indel位点)，即rs1385372181，该位点位于muc22基因内含子区域，具体位于人类参考基因组11号染色体第31012785到31012800位，在gd人群(包括tia患者，还包括在采用atd治疗中和治疗后未出现粒细胞缺乏症的gd对照)中存在该位点发生缺失突变(等位基因上缺失的基因片段为cgccgtctcaccctcc)的个体。
17.优选的，所述步骤2中，当扩增产物的电泳检测结果显示存在长度为219bp的条带，
10μl，上下转动混匀至液体变粘稠。56℃水浴过夜裂解细胞、消化蛋白，保温过程中，不时上下转动几次，混匀反应液。
33.1.3第二天，反应液冷却至室温后加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。12000rpm离心10min，用大口吸管吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中；重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，上下转动混匀，12000rpm离心10min，用大口吸管吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中；重复一次。
34.1.4加0.1倍体积的3mol/l醋酸钠(ph5.2)和2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻倒置混匀，即有乳白色云絮状dna出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的dna，转入另一1.5ml离心管中，加70％乙醇500μl，以12000rpm离心5min，弃上清(去除残留的盐)；重复洗涤dna一次。室温挥发残留的乙醇。加te液50μl溶解dna，置于摇床平台缓慢摇动，dna完全溶解通常需12～24h。制成的dna溶液(模板dna)于-20℃冰箱保存备用。
35.(2)pcr扩增和核酸电泳检测
36.2.1引物设计
37.从genbank下载muc22基因组序列(基因id：100507679)，用premier3.0设计引物。具体引物信息见表1。
38.表1.引物序列表
[0039][0040]
该引物对(上、下游引物组成)可特异性地扩增muc22基因中包含插入/缺失多态性位点rs1385372181(16bp-插入缺失多态性位点，缺失片段为cgccgtctcaccctcc)的片段。
[0041]
2.2pcr反应液的配制及反应程序见表2、表3：
[0042]
表2.pcr反应液
[0043][0044]
表3.pcr扩增条件
[0045]
[0046][0047]
扩增产物采用3％琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据检测结果可以确定个体在位点rs1385372181的基因型。
[0048]
2.3分型结果示例
[0049]
对来自13个不同个体的基因组dna样本的扩增产物电泳结果如图1所示。图中样本1、2、3、8、10、12为单条235bp条带，即野生型纯合子(基因型为i/i)；4、5、6、7、11为219bp条带、235bp条带和异源杂合双链三条带，即一条染色体存在缺失突变的杂合子(基因型为i/d)；9、13为单条219bp条带，即两条染色体皆出现缺失突变的纯合子(基因型为d/d)。
[0050]
(3)muc22基因多态性与tia的关联分析
[0051]
按gd标准明确诊断入选者，收集来自陕西省的无亲缘关系tia患者40例和gd对照样本100例。所有受试者均为汉族，且签署知情同意书，对受试者的实验也得到了本单位伦理委员会批准。按步骤(1)和(2)的方法获得100例gd对照样本和40例tia样本的基因型。统计方法：利用spss 18.0软件中pearson卡方检验计算muc22基因rs1385372181位点的等位基因频率，所有p值均为双侧概率，当p《0.05时认为有显著统计学意义。采用单因素logistic回归分析计算tia的患病风险or值及其95％置信区间(ci)，对等位基因频率和tia之间的相关性进行评估(结果见表4)。
[0052]
表4.rs1385372181位点在tia和gd对照中的等位基因频率风险
[0053][0054]
由表4可见，muc22基因上位点rs1385372181发生基因片段cgccgtctcaccctcc缺失突变时，在tia患者群体中的等位基因分布频率与gd对照有显著差别(p＝0.029)，表明位点rs1385372181发生缺失突变的等位基因(即缺失型等位基因d)与tia患病高风险密切相关，携带缺失型等位基因的个体(例如i/d)发生tia的风险是不携带缺失型等位基因的个体(即d/d)的2.069倍。
[0055]
按如上所述得出结论，首次发现muc22基因在第31012785到310128013位(grch38)碱基的插入/缺失多态性与tia发生具有显著相关性。即muc22基因多态性位点
rs1385372181与tia易感性密切相关，可作为tia易感性检测或者早期诊断的分子标记。
[0056]
(二)tia的基因诊断试剂盒
[0057]
该试剂盒包括用于对提取自受试者的基因组dna进行rs1385372181位点pcr扩增、检测的试剂，例如上述上、下游引物。
[0058]
通过对扩增产物测序或琼脂糖凝胶电泳检测，显示受试者为在位点rs1385372181存在基因片段cgccgtctcaccctcc缺失(参照seq.id.no.1)的个体、即出现219bp条带的个体，则判定其属于tia易感人群，而在位点rs1385372181不存在基因片段cgccgtctcaccctcc缺失的个体、即仅出现235bp条带的个体属于tia非易感人群。
[0059]
本发明设计的引物，只需要少量dna样品就足以测定muc22基因的多态性，具有灵敏度高、错误率低的优势，特别适合进行大量样本的筛查。
[0060]
(三)本发明的其他应用例证
[0061]
本发明通过分析人muc22基因rs1385372181位点的缺失突变，即第31012785到31012800位(grch38)碱基缺失变异，还应用于对tia的辅助性诊断，以利于开展tia的早期干预和治疗。
[0062]
本发明发现的muc22基因分子标记，可用作药物设计分子靶标的筛选，促进tia分子致病机制的研究及tia的新药开发。