一种具有体外降糖活性的植物乳杆菌胞外多糖及制备方法

1.本发明属于微生物学中的多糖技术领域，具体涉及到一种微生物胞外多糖，特别是涉及一种植物乳杆菌来源的具有体外降糖活性的乳酸菌胞外多糖及其制备方法。


背景技术：

2.乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides,eps）是乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖的总称。乳酸菌eps具有特殊的结合水和防止脱水的工艺学功能，因而被广泛应用在食品、保健品、药品、化妆品等领域。特别是在食品领域，eps可作为胶凝剂、增粘剂、悬浮剂、水粘结剂、增稠剂、稳定剂、增韧剂、乳化剂、面团改进剂等应用于食品生产，改善食品的保水性、稠度、口感、质地、流变性、结构、口感。随着生活质量的提高，人们对具有保健功效产品的需求越来越大，越来越多研究报道了eps的健康效应，包括抗氧化、益生元、降血糖、免疫调节等。
3.据国际糖尿病联合会最新报告，2021年全球约5.37亿成年人患有糖尿病，预计到2030年，该数字将上升到6.43亿。目前常用于缓解ⅱ型糖尿病症状的双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、磺脲类药物，会对机体产生诸多不利影响。eps作为安全性、生物相容性好的活性物质，其降血糖活性备受关注。研究表明，eps可通过多种途径达到降血糖目的，如：抑制消化酶活性、调控肝脏糖代谢、调节肠道菌群及影响蛋白表达等。由于labeps具有菌株特异性，不同菌株产生的多糖差异性很大，不同的多糖具有各自特定的功能，因此研究新分离菌株的eps的降糖活性很有必要，能够为功能乳酸菌菌株的应用和功能性食品的开发等提供理论依据。


技术实现要素：

4.本发明所提供的植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c，是从四川传统家庭自制泡菜中筛选获得的一株高产胞外多糖乳酸菌。菌株的分类名称：植物乳杆菌lactobacillusplantarum，编号为dpa1c，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.24437，保藏日期：2022年2月28日。
5.本发明公开了一种植物乳杆菌胞外多糖，其由植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c菌株发酵而得。其制备方法为：将植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c按2%接种量在mrs肉汤中37℃培养12h。取100μl菌液于mrs-碳酸钙固体培养基，使用无菌棉签将菌液涂满整个平板，30℃培养72h。向培养结束后的平板加入适量超纯水，收集用棉签洗下的菌悬液，离心（8000r/min，4℃，20min）。将上清液沸水浴10min，冷却后加入三氯乙酸至其终浓度为4%，4℃保持16h左右，离心（8000r/min，4℃，20min）去除蛋白沉淀。加入3-4倍上清液体积预冷无水乙醇于4℃冰箱过夜储存，离心（8000r/min，4℃，20min）得到多糖沉淀，使用80%乙醇清洗沉淀，将沉淀用超纯水溶解后转移到透析袋于4℃冰箱用超纯水透析3d，间隔4h换一次水。透析完成后进行冷冻真空干燥得eps。
6.本发明的植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1ceps总糖含量为90.99%，分子量结果显示其包含两种组分，两组分分子量大小分别为1.32
×
106da、1.02
×
106da，相对含量分别为39%、61%。单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，摩尔比为2.76:1.00:0.67:0.11。体外活性实验结果表明，本发明的植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1ceps具有显著抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的能力，在作为降糖药物及相关功能食品开发方面具有广阔的研究价值与应用价值。
附图说明
7.图1为菌株dpa1c的菌落形态和细胞形态图。
8.图2为菌株dpa1ceps和阿卡波糖对α-淀粉酶的体外抑制作用。
9.图3对菌株dpa1ceps对α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用。
具体实施方式
10.实例1：植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c的鉴定。
11.一、形态特征取一环菌液于mrs平板上划线，37℃培养24-36h，观察菌落形态。挑取单菌落，革兰氏染色后用显微镜观察其个体形态，记录形状、大小、颜色等。
12.如图1所示，菌落形态呈圆形、乳白色、中间突起、表面光滑湿润。革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，菌体细胞呈短杆状。
13.二、糖发酵试验鉴定采用法国梅里埃50chlapi鉴定试剂盒并按其说明书对dpa1c进行糖发酵实验鉴定。
14.反应结果如表1所示。经数据库查询,菌株dpa1c与植物乳杆菌lactobacillusplantarum具有99.9%的相似性，因此将菌株dpa1c初步鉴定为植物乳杆菌lactobacillusplantarum。
15.表1菌株dpa1c碳源利用结果
序号底物反应情况序号底物反应情况1丙三醇-26水杨苷+2赤藻糖醇-27d-纤维二糖+3d-阿拉伯糖-28d-麦芽糖+4l-阿拉伯糖+29d-乳糖+5d-核糖+30d-密二糖+6d-木糖-31d-蔗糖+7l-木糖-32d-海藻糖+8d-核糖醇-33菊粉-9甲基-β-d-吡喃木糖醇-34d-松三糖+10d-半乳糖+35d-棉子糖+11d-葡萄糖+36淀粉-12d-果糖+37糖原-13d-甘露糖+38木糖醇-14l-山梨糖-39d-龙胆二糖+
15l-鼠李糖-40d-土伦糖+16卫矛醇-41d-来苏糖-17肌醇-42d-塔格糖-18甘露醇+43d-岩藻糖-19山梨醇+44l-岩藻糖-20甲基-α-d-吡喃甘露糖苷+45d-阿拉伯醇-21甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷-46l-阿拉伯醇-22n-乙酰葡萄糖胺+47葡萄糖酸钾+23苦杏仁苷+482-酮基葡萄糖酸钾-24熊果苷+495-酮基葡萄糖酸钾-25七叶灵柠檬酸铁+
ꢀꢀꢀ
注：“+”表示阳性，
“‑”
表示阴性。
16.三、16srdna分子鉴定挑取单菌落与10μl无菌超纯水混合均匀制成菌悬液。采用16srdna的通用引物（27f，1492r）进行扩增。pcr反应体系（50μl）为：上下游引物各1μl(10μm)，模板dna（即菌悬液）1μl，2
×
longtaqpcrmastermix25μl，超纯水22μl。pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃1min，66℃1min，72℃20s，循环30次；72℃延伸10min。pcr产物由成都擎科梓煕生物技术有限公司进行测序。该菌株的16srdna基因测序结果与genbank数据库中序列进行blast同源性对比，该菌株序列与lactobacillusplantarum菌株基因序列高度同源，得到登录号为om658540。
17.综合上述结果，菌株dpa1c鉴定为植物乳杆菌lactobacillusplantarum。
18.植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.24437，保藏日期：2022年2月28日。
19.实例2.植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c在产胞外多糖中的应用。
20.一、植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c胞外多糖的制备将植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c按2%接种量在mrs肉汤中37℃培养12h。取100μl菌液于mrs-碳酸钙固体培养基，使用无菌棉签将菌液涂满整个平板，30℃培养72h。向培养结束后的平板加入适量超纯水，收集用棉签洗下的菌悬液，离心（8000r/min，4℃，20min）。将上清液沸水浴10min，冷却后加入三氯乙酸至其终浓度为4%，4℃保持16h左右，离心（8000r/min，4℃，20min）去除蛋白沉淀。加入3~4倍上清液体积预冷无水乙醇于4℃冰箱过夜储存，离心（8000r/min，4℃，20min）得到多糖沉淀，使用80%乙醇清洗沉淀，将沉淀用超纯水溶解后转移到透析袋于4℃冰箱用超纯水透析3d，间隔4h换一次水。透析完成后进行冷冻真空干燥即得胞外多糖。
21.二、植物乳杆菌lactobacillusplantarumdpa1c胞外多糖的理化特性分析。
22.1.总糖含量测定取不同体积的0.08mg/ml葡萄糖工作液（0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml）加超纯水补至1ml，然后加入1ml6%苯酚、5ml浓硫酸并混合均匀，90℃孵育10min，冷却后于490nm测定各溶液的吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，取200μl0.4mg/ml多糖溶液依次加入800μl超纯水，然后按上述步骤测定溶液的吸光值，根据标准曲线计算eps中总糖含量。
min。随后，将100 μl 0.8 mm 对硝基苯-α-d-葡萄糖吡喃苷（pnpg）添加到混合物中，并在37
°
c下放置10 min。最后加入100 μl na2co3后混匀于405 nm处测量混合物的吸光度，以阿卡波糖标准品为阳性对照。
33.α-葡萄糖苷酶抑制活性的计算公式为：α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(1-(b
sample-b
control
)/(b
blank-b
control
))
×
100其中a
sample
是样品，pnpg和α-葡萄糖苷酶混合物的吸光度; a
control
是pbs和pnpg混合物的吸光度； a
blank
是pbs，pnpg和α-葡萄糖苷酶混合物的吸光度。
34.结果如图3所示，可以看到，当eps浓度为2 mg/ml时，α-葡萄糖苷酶抑制率为23.41%。随着eps浓度升高，抑制率也增加，当eps浓度为8 mg/ml时，α-葡萄糖苷酶抑制率可达到82.21%，其ic
50
值为3.43 mg/ml，略高于阳性对照阿卡波糖ic
50
值（2.18 mg/ml）。