提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种添加维生素^提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用，属于酶工程 和发酵工程技术领域。
【背景技术】
[0002] y-氨基丁酸（y-aminobutyricacid,GABA)，一种非蛋白质氨基酸，分子式为 C4H9N02、极易溶于水。GABA以自由态形式广泛存在于自然界中，是哺乳动物中枢神经系统 的抑制性传递物质。GABA具有多种生理功能，如镇静神经、抗焦虑、降血氨、降血压、抑制 脂肪肝及肥胖症、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等。 GABA正被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。目前GABA在临床上常用于降低 人体的血氨，治疗各种类型的肝昏迷，同时又被广泛用于治疗各种脑疾病，还可以作为儿童 智力的营养补充剂和促进剂，老年人的营养剂。
[0003]GABA天然存在量很低，因此很难从天然组织中大量分离。目前，GABA的生产方法 有化学合成法、植物富集法和微生物合成法。化学合成法受到苛刻的反应条件及昂贵的天 然原料的限制，成本高、安全性差。植物富集法含量低，尚无法用作医药、医药中间体和食品 添加剂。与化学法相比，微生物合成法的主要优点是条件温和、不需要昂贵的原料，能耗低。 其原理是利用菌体内的谷氨酸脱羧酶（glutamatedecarboxylase,GAD;E(34. 1. 1. 15,卩比口多 醛类裂解酶，能专一地催化L-谷氨酸裂解为GABA和C02)的作用，将L-谷氨酸脱羧转化为 GABA。微生物合成法主要有直接发酵法和酶催化法。早期微生物法生产GABA主要采用直接 发酵法，以大肠杆菌、乳酸菌、植物乳杆菌等为生产菌，利用菌体内的谷氨酸脱羧酶的作用， 将发酵液中的L-谷氨酸转化为GABA，再从发酵液中分离纯化制得GABA。传统的直接发酵法 得到的发酵液是一个复杂的多相体系，除了目的产物GABA，还含有大量菌体、蛋白质、残糖、 色素及无机盐等杂质，使得GABA生产的下游分离纯化复杂化，成为GABA工业化生产的瓶颈 问题。酶催化法是以发酵培养的全细胞或酶液作为催化剂转化生产GABA，所需设备简单，条 件容易控制，反应步骤少，副反应少，收率高，环境友好，得到的转化液相对于直接发酵的发 酵液而言，成分简单，杂质含量少，使得主要产品的分离纯化工艺简化，成本降低。所以筛选 具有相对高活力的L-谷氨酸脱羧酶的微生物并通过分子生物学技术外源高效表达L-谷氨 酸脱羧酶并优化酶制备工艺得到该领域学者、专家的关注。
[0004] 目前已经有一些关于采用谷氨酸脱羧酶工程菌生产GABA的报道，已有研宄将大 肠杆菌基因来源的谷氨酸脱羧酶在E.coliBL21(DE3)中表达，在150g/L谷氨酸、0. 15mM 磷酸吡哆醛（PLP)、0. 6mMCa2+酶转化体系中添加360U粗酶液，反应结束后，产物浓度达到 94g/L，摩尔转化率达到90 %。但是根据已报道的一些专利和文献，谷氨酸脱羧酶的辅酶为 5' -磷酸吡哆醛（PLP)，胞内的含量并不能满足重组谷氨酸脱羧酶的需要，所以常在谷氨酸 脱羧酶发酵制备和GABA生产工艺中添加一定量辅酶促进生产，但是辅酶存在稳定性差、价 格高、来源少等诸多缺点。为解决上述问题，本发明提供一种添加维生素&提高重组菌谷 氨酸脱羧酶产量的方法，并研宄了该方法得到的谷氨酸脱酸酶的应用性能，为y_氨基丁 酸的工业化生产降低成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种在重组菌发酵过程中添加维生素&以提高谷氨酸脱 羧酶产量的方法，并提供一种不需要添加辅酶生产GABA的工艺，降低了GABA的生产成本。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种提高谷氨酸脱羧酶产量的方法，是在表达谷氨酸 脱羧酶基因的基因工程菌的发酵过程中添加维生素B6。
[0007] 所述维生素B6的添加方式为一次性添加、分批添加或恒速流加。
[0008] 所述维生素B6在发酵液中的浓度控制在2-30mM。
[0009]所述基因工程菌的发酵方法，在本发明的一种实施方式中，是在30-37°C培养，控 制溶氧水平在15?30%、pH6. 5?7. 5,当0D6QQ达到20?80时，以25?30°C下流加乳 糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加维生素B6，诱导18-24h。
[0010] 所述基因工程菌的发酵方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：采用温度两阶 段控制策略和恒溶氧分批补料技术高密度培养基因工程菌生产重组谷氨酸脱羧酶的发酵 工艺；在发酵过程中，以30-37°C恒温培养，控制溶氧水平在15?30%，流加氨水控制pH 6. 5?7. 5,当OD_达到20?80时，以25?30°C恒温、恒速流加乳糖进行诱导产酶，并在 诱导过程中添加一定量的维生素B6，诱导18-24h。
[0011] 本发明的第二个目的是提供所述方法在Y-氨基丁酸合成中的应用。
[0012] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是指基因工程菌发酵所得细胞或重组酶 在氨基丁酸合成中的应用。
[0013] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将发酵得到的基因工程菌细胞用缓冲 液洗涤并悬浮，将L-谷氨酸或谷氨酸钠加入到细胞悬浮液中至终浓度为10-200g/L，维持 反应温度30-40°C，调节控制pH4. 5-5. 5,每隔2-6h补加L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为 0-100g/L，反应 12-32h。
[0014] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将发酵得到的基因工程菌进行细胞破 碎得到酶液，将酶液加入到L-谷氨酸或谷氨酸钠的终浓度为10-200g/L的反应体系中，维 持反应温度30-40°C、pH4. 5-5. 5,每隔2-6h补L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度0-100g/L， 反应 12-32h。
[0015] 本发明的第三个目的是一种用于权利要求1所述方法的基因工程菌。
[0016] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是表达来源于大肠杆菌的L-谷氨 酸脱羧酶GAD基因的重组大肠杆菌。
[0017] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是将Genebank号为NC_000913. 3 的基因序列（即SEQ ID NO. 1所示的序列）连接到pET-24a(+)载体后转化到E. coli BL21(DE3)中得到的重组菌。
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