018] 本发明的优势：（1)在发酵过程中添加维生素B6使酶产量达到3300U/mL，是对 照的2. 5倍；（2)该酶的酶比活由对照（不添加维生素B6发酵处理）的130U/mg提高为 197. 2U/mg，提高了 51. 7% ; (3)酶在反应温度37-40°C热稳定性显著提高，GAD的半衰期由 对照的38h提高到107h，半衰期提高到了 3倍以上；（4)酶催化过程不需要添加辅酶，维生 素B6价格便宜且易获得，稳定性较辅酶磷酸吡哆醛、辅酶前体物质盐酸吡哆醛等稳定，易 储藏，为Y-氨基丁酸的工业化生产提供方便、降低生产成本。
【附图说明】
[0019] 图1重组大肠杆菌摇瓶发酵生产谷氨酸脱羧酶的过程曲线图；其中，重组菌对 照；▲，重组菌发酵过程添加维生素B6;
[0020] 图2重组大肠杆菌发酵罐发酵生产谷氨酸脱羧酶的过程曲线图；其中，重组菌 对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素b6;
[0021] 图3谷氨酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；其中M，蛋白质分子量标准；1，谷氨酸脱羧酶 粗酶液；2,GAD-对照纯酶；2,GAD-VB6纯酶；
[0022] 图4谷氨酸脱羧酶最适pH;其中，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生素 B6；
[0023] 图5谷氨酸脱羧酶最适温度；其中，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生 素B6;
[0024] 图6谷氨酸脱羧酶pH稳定性；其中，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加维生 素B6;
[0025] 图7谷氨酸脱羧酶37°C热稳定性；其中，重组菌对照；▲，重组菌发酵过程添加 维生素B6。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上按照常规的分子克隆手册所 述的条件进行操作。
[0027]菌株和质粒：质粒pET_24a(+)，菌株E. coli_K12、E. coli JM109、E. coli BL21(DE3)〇
[0028] 材料和方法：所用的限制性内切酶，T4连接酶，pMD18-T simple载体，PCR试剂， DNA marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E. coli JM109,引物，质粒 抽提试剂盒等均购于上海生工生物工程公司。
[0029] 实施例1:基因工程菌的构建
[0030]根据NCBI数据库中的gadB的基因序列（Genebank:NC000913. 3)，分别设计含Nde I和XhoI酶切位点的两端引物P1 (序列如SEQIDNO. 2所示）、P2 (序列如SEQIDNO. 3 所示），如下：
【主权项】
1. 一种提高谷氨酸脱羧酶产量的方法，其特征在于，是在表达谷氨酸脱羧酶基因的基 因工程菌的发酵过程中添加维生素b6。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B 6的添加方式为一次性添加、 分批添加或恒速流加。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B 6在发酵液中的浓度控制在 2_30mM〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的发酵方法如下：在 30-37°C培养，控制溶氧水平在15?30%、pH 6. 5?7. 5,当0D600达到20?80时，在25? 30°C流加乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加维生素B6，诱导18-24h。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的发酵方法如下：采用温 度两阶段控制策略和恒溶氧分批补料技术高密度培养基因工程菌生产重组谷氨酸脱羧酶 的发酵工艺；在发酵过程中，以30-37°C恒温培养，控制溶氧水平在15?30%，流加氨水控 制pH 6. 5?7. 5,当0D600达到20?80时，以25?30°C恒温、恒速流加乳糖进行诱导产 酶，并在诱导过程中添加一定量的维生素B 6，诱导18-24h。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是表达来源于大 肠杆菌的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的重组大肠杆菌。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是将Genebank号为 NC_000913. 3的基因序列连接到pET-24a(+)载体后转化到E. coli BL21 (DE3)中得到的重 组菌。
8. 权利要求1-5任一所述方法在Y-氨基丁酸合成中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是将发酵得到的基因工程菌细胞用缓冲 液洗涤并悬浮，添加终浓度为10_200g/L的L-谷氨酸或谷氨酸钠到细胞悬浮液中，维持反 应温度30-40°C，调节控制pH 4. 5-5. 5,每隔2-6h补加L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为 0-100g/L，反应 12-32h。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是将发酵得到的基因工程菌进行细胞破 碎得到酶液，将酶液加入到L-谷氨酸或谷氨酸钠终浓度为10-200g/L的反应体系中，维持 反应温度30-40°C、pH 4. 5-5. 5,每隔2-6h补L-谷氨酸或谷氨酸钠至终浓度为0-100g/L， 反应 12-32h。
【专利摘要】本发明公开了一种添加维生素B6提高谷氨酸脱羧酶产量的方法及应用，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明采用导入了L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的重组大肠杆菌，以半合成培养基、分批补料的发酵方式控制一定的比生长速率，在OD600值为20-80时进行流加一定浓度乳糖进行诱导产酶，并在诱导过程中添加2-25mM维生素B6，诱导24h胞内谷氨酸脱羧酶酶活由对照(发酵过程中未添加维生素B6)1293U/mL提高到3300U/mL；本发明还公布了一种利用该发酵工艺的重组酶进行无需添加辅酶生产γ-氨基丁酸的合成工艺，GABA积累量由对照的190g/L增加到374g/L。
【IPC分类】C12N15-60, C12R1-19, C12N1-21, C12N9-88, C12P13-00
【公开号】CN104531652
【申请号】CN201410733876
【发明人】吴敬, 宿玲恰, 黄燕
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月4日